葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法。采用二極管陣列檢測器，YMC?Carotenoid?C30色譜柱，以甲醇∶乙腈∶二氯甲烷＝50∶30∶20為流動相，時間13min，流速1.0mL/min，柱溫25℃，進樣量20μL，掃描波長300～500nm，檢測波長450nm，該方法能夠很好地分離葉黃素單順式、雙順式異構體；同時利用APCI正離子質譜，色譜柱流出組分進入質譜儀的流速為10μL/min，掃描范圍m/z＝80～900，氣化溫度350℃，干燥氣體流速5L/min，電暈電流4μA，破碎電壓150v，毛細管電壓2500V。根據(jù)質譜和光譜信息確定葉黃素的單順式、雙順式異構體分別為13，15-雙順式、9，15-雙順式、15-順式、13-順式、13′-順式、9，9′-雙順式、9-順式和9′-順式葉黃素。該方法具有快速有效、重現(xiàn)性好、回收率高等特點，可以對葉黃素單順式和雙順式異構體進行定性和定量分析。
【專利說明】葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法 一、

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法，屬于分析【技術領域】。 二、

【背景技術】
[0002] 葉黃素又名"植物黃體素"，是一種無 VA活性的含氧類胡蘿卜素，廣泛存在于蔬菜、 花卉、水果與某些藻類生物中。十幾年的科學研究表明葉黃素是構成人眼視網(wǎng)膜黃斑色素 的主要組成部分。葉黃素不僅可以過濾對黃斑損傷作用最強的藍光，而且能夠淬滅和捕獲 高能量藍光誘導產(chǎn)生的活性氧自由基，從而起到保護視力和抗氧化的作用。因此，經(jīng)常補充 葉黃素可以降低老年性黃斑退化?。ˋge-related Macular Degeneration,簡稱AMD)的患 病風險。另外，葉黃素還具有預防白內障和人體衰老、抗癌、抗誘變、延緩早期動脈硬化等生 理功能，是一種營養(yǎng)健康的功能性天然色素。
[0003] 自然界中葉黃素以全反式構象為主，富含或強化葉黃素制品在加工貯藏過程中， 全反式葉黃素會受到光、氧和熱等外界條件的影響產(chǎn)生很多順式異構體，順式結構在物化 性質和生理功能上與全反式差別較大。因此，建立一種準確快速的葉黃素順反異構體的定 性、定量分析方法對葉黃素在食品工業(yè)中的生產(chǎn)和應用具有重要意義。
[0004] 由于靈敏、準確、快速等優(yōu)點，高效液相色譜和質譜聯(lián)用技術已成為葉黃素定性定 量分析的主要方法。c 3(l柱是繼c18柱之后又一廣泛應用的反相吸附色譜固定相，在分離類胡 蘿卜素幾何異構體方面顯示出獨特的優(yōu)勢，又稱類胡蘿卜素柱。張艷等報道了一種ymc-c 3(i 色譜柱分離葉黃素及其異構體的方法，使用的流動相為甲基叔丁基醚、甲醇和乙腈，葉黃素 異構體分離效果不是很好，并且甲基叔丁基醚價格較貴；李秀霞等報道了用ymc-c 3(i色譜柱 分離鑒定玉米蛋白粉中的全反式葉黃素及其順式異構體，使用的流動相為甲醇和丙酮，但 洗脫時間較長。國外有報道使用水-甲醇、水-乙腈為流動相對葉黃素順、反異構體進行分 離，但這兩種方法所用時間都較長，分別為70min和45min，效率較低。尚未見葉黃素雙順式 異構體檢測方面的報道。因此，建立一種快速經(jīng)濟有效的葉黃素單順式、雙順式異構體的定 性定量分析方法顯得十分必要。 三、


【發(fā)明內容】

[0005] 技術問題
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準確的葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方 法，可以對葉黃素單順式、雙順式異構體進行準確的定性和定量分析。
[0007] 技術方案
[0008] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0009] 1.葉黃素單順式、雙順式異構體樣品的制備
[0010] 吸取大豆油4. 6mL于具塞刻度試管中，分別在130?190°C下于恒溫油浴鍋中避光 加熱。稱取l〇mg反式葉黃素于試管中并加入400 μ L正己烷，超聲溶解30s，頻率為40kHz。 將正己烷-葉黃素溶液注入油脂中，制成工作溶液，這一過程須在lmin內完成。定時移取 200 μ L樣品于小試管中，與2mL丙酮混合均勻后，迅速置于-20°c冰箱保存24h，使油脂中的 三酰甘油酯結晶。通過〇.45μπι膜過濾于樣品瓶中待用。整個實驗過程中，試管敞口不密 封，所有操作均在避光下完成。
[0011] 2.葉黃素單順式、雙順式異構體的HPLC檢測
[0012] 取20 μ L制備的葉黃素單順式、雙順式異構體樣品進行檢測，二極管陣列檢測器， YMC Carotenoid C3Q色譜柱，以甲醇：乙腈：二氯甲烷=50 : 30 : 20為流動相，時間 13min，流速1. OmL/min，柱溫25°C，進樣量20 μ L，掃描波長300?500nm，檢測波長450nm。
[0013] 3.葉黃素單順式、雙順式異構體的質譜檢測
[0014] 采用大氣壓化學電離源，正離子質譜（APCI+/MS)掃描模式，色譜柱流出組分進入 質譜儀的流速為10 μ L/min，掃描范圍m/z = 80?900,氣化溫度350°C，干燥氣體流速5L/ min，電暈電流4μ A，破碎電壓150v，毛細管電壓2500V。
[0015] 4.建立全反式葉黃素標準曲線
[0016] 準確稱取lmg全反式葉黃素標準品，用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混勻，制 成濃度為40 μ g/mL的標準液。再分別取0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5mL標準液置于10mL容量瓶 中，混勻，制成2、4、6、8、10 μ g/mL的全反式葉黃素系列標準液。按照上述的色譜條件測定， 以進樣量為橫坐標，相應的吸收峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析。
[0017] 有益效果
[0018] 1.本發(fā)明在國內外文獻的基礎上，遴選出流動相甲醇A、流動相乙腈B、流動相 二氯甲烷C對葉黃素單順式、雙順式異構體進行分離，依據(jù)葉黃素單順式和雙順式異構 體的分離效果和最低洗脫時間，確定了較優(yōu)的流動相配比。不同A-B-C配比（v/v/v): ① 20 : 60 : 20;② 30 : 50 : 20;③ 40 : 40 : 20;④ 50 : 30 : 20;⑤ 60 : 20 : 20 后葉黃素異構體分離效果見圖1。由圖可知在由流動相①逐漸調整至流動相⑤的過程中，樣 品中各物質全部洗脫所用的時間是逐漸縮短的，其中流動相①、②未使樣品中各組分較好 分離，流動相③、⑤得到的色譜峰對稱性稍差，峰形欠滿意，流動相④使樣品中各物質達到 有效分離，拖尾現(xiàn)象有明顯改善，峰形較好，因此，選擇流動相比例為甲醇：乙腈：二氯甲 烷=50 : 30 : 20,時間縮短為13min。
[0019] 2.對含有葉黃素的高溫油脂樣品進行了正離子模式的HPLC-APCI-MS和電子吸收 光譜分析，通過與標準品保留時間比對、最大吸收波長、紫外-可見光譜特性、質譜特性、Q 值（順式吸收峰"高度值"與最大吸收峰"高度值"之比）及文獻中相關報道分離鑒定得到 9種化合物。圖2至圖5分別為全反式葉黃素標準品色譜圖、葉黃素順式異構體HPLC分離 色譜圖、光譜特征圖和質譜特征圖。
[0020] 葉黃素分子量均為568. 88,質譜結果中主離子峰應為569. 4[M+H]+，但因葉黃素兩 側紫羅酮環(huán)的不對稱性，使得葉黃素在質譜電離過程中容易失去一個水分子，所以葉黃素 在質譜圖中的主離子峰為551. 4[M+H] +。圖3中峰6與全反式葉黃素標準品洗脫時間和最大 吸收波長均一致，確定峰6為全反式葉黃素。因順式異構體沒有標準品可利用，可以通過以 下程序對其進行分析：（1)單順式異構體的最大吸收波長相對全反式結構有4?6nm的藍 移，雙順式異構體則有10?14nm的藍移；（2)順式異構體在330?340nm之間有一個新的 吸收，順式雙鍵越靠近分子中心順式吸收越強，而雙順式異構體吸收較小，甚至無吸收；（3) 葉黃素與β-胡蘿卜素均為類胡蘿卜素，有相同的異戊二烯結構主鏈性質，因此在相應位 置異構體的洗脫順序與β-類胡蘿卜素應一致。由此可以確定異構體混合物中的單順式和 雙順式異構體。圖5顯示葉黃素的所有順式異構體和全反式結構一樣有相同的主離子峰， 即m/z 551. 4[Μ+Η] +。圖4顯示15-、13-、13'_、9_和9'-順式-葉黃素最大吸收波長分別 為442、440、440、442和442nm，與全反式有2?6nm藍移。其Q值和洗脫順序與文獻報道 值相符合。13,15-雙順式、9,13-雙順式和9,9'-雙順式-葉黃素的最大吸收波長為432、 434和434nm，相對全反式葉黃素有10-14nm藍移，符合雙順式異構體特征。三種葉黃索雙 順式異構體洗脫順序與β_胡蘿卜素雙順式異構體洗脫順序相一致。
[0021] 表1樣品中葉黃素單順式、雙順式異構體的鑒定
[0022]

【權利要求】
1. 葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法，其特征在于HPLC條件為采用二極管陣列 檢測器，YMC Carotenoid C3Q色譜柱，以甲醇：乙腈：二氯甲烷=50 : 30 : 20為流動相， 時間13min，流速1. OmL/min，柱溫25°C，進樣量20 μ L，掃描波長300?500nm，檢測波長 450nm ;同時利用APCI正離子質譜，色譜柱流出組分進入質譜儀的流速為10 μ L/min，掃描 范圍m/z = 80?900,氣化溫度350°C，干燥氣體流速5L/min，蒸發(fā)器溫度400°C，電暈電流 4μ A，毛細管電壓2500V。
2. 權利要求1所述葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法，其特征在于在上述HPLC 條件下，13,15-雙順式、9,15-雙順式、15-順式、13-順式、13'-順式、全反式_、9,9'-雙 順式、9-順式和9'-順式葉黃素得到顯著分離，根據(jù)色譜、質譜和光譜信息，對這9種化合 物進行了定性分析；建立了全反式葉黃素標準曲線用于定量分析，Υ = 6. 224Χ+0. 731，R2 = 0. 9998,方法重現(xiàn)性好、回收率和精密度高。
【文檔編號】G01N30/88GK104090062SQ201410376892
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月30日 優(yōu)先權日:2014年7月30日
【發(fā)明者】李大婧, 肖亞冬, 張鐘元, 劉春泉 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院