雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針及其合成方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針及其合成方法和應(yīng)用。該陽離子型熒光探針的結(jié)構(gòu)式為其是以熒光量子產(chǎn)率高、對微環(huán)境極性敏感的丹磺酰作為信號輸出基團(tuán)，通過二乙烯三胺兩端保護(hù)引入丹磺酰，然后二乙烯三胺兩端脫保護(hù)與溴乙酰溴反應(yīng)，最后與N-甲基咪唑共價(jià)結(jié)合，合成雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針，其化學(xué)穩(wěn)定性好，能夠即時(shí)、在線測定氨基酸，對天冬氨酸或谷氨酸的響應(yīng)速度快、靈敏度高、響應(yīng)范圍寬，檢出限可分別達(dá)到1.6μmol/L和6.0μmol/L，實(shí)現(xiàn)了氨基酸的高選擇性、高靈敏度、低檢出限檢測。
【專利說明】雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針及其合成方法和應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于氨基酸的檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種在水中測定氨基酸的熒光探針 及其合成方法和檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，對生物化學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研 究以及產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和生產(chǎn)管理等具有重要意義。因此，氨基酸分析是工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)、食品加工及生命科學(xué)研究中十分重要的技術(shù)之一。其中天冬氨酸通過脫氨生成草 酰乙酸而促進(jìn)三羧酸循環(huán)，并且與鳥氨酸循環(huán)密切相關(guān)，擔(dān)負(fù)著使血液中的氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?排泄出去的部分工作。同時(shí)，天冬氨酸還是合成乳清酸等核酸前體物質(zhì)的原料，可作為K+、 Mg2+離子的載體向心肌輸送電解質(zhì)，從而改善心肌收縮功能，同時(shí)降低氧消耗，在冠狀動(dòng)脈 循環(huán)障礙缺氧時(shí)，對心肌有保護(hù)作用。谷氨酸和天冬氨酸具有興奮性遞質(zhì)作用，當(dāng)谷氨酸含 量達(dá)9 %時(shí)，只要增加10?15mol的谷氨酸就可對皮層神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性影響。因此，谷氨 酸對改進(jìn)和維持腦功能必不可少。谷氨酸也可用于治療肝昏迷等癥，谷氨酸、天冬氨酸主要 用于治療肝病疾病、消化道疾病、腦病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、兒科 營養(yǎng)和解毒等。此外氨基酸衍生物給癌癥治療上帶來了希望。由此可見，氨基酸在人體生 命活動(dòng)中十分重要。
[0003] 目前，有關(guān)氨基酸分離與測定的方法正在不斷發(fā)展與完善之中，包括化學(xué)法、分光 光度法、色譜法、毛細(xì)管電泳法及其它方法。但是化學(xué)法試劑耗量多，測定周期長。分光光 度法操作簡單、時(shí)間短，但是誤差大、計(jì)算繁瑣。色譜法儀器復(fù)雜、價(jià)格昂貴、用途單一、分 析時(shí)間較長（目前約減至1小時(shí)）、破壞氨基酸的固有結(jié)構(gòu)、靈敏度相對較低。而熒光化學(xué) 傳感器由于其具有制備簡單、易于操作、靈敏度高、選擇性好及可用于體外或活體測量、實(shí) 時(shí)在線檢測，能夠成像和輸出信號豐富（比如：熒光強(qiáng)度、最大發(fā)射波長、光譜形貌、熒光壽 命和熒光各向異性等）等優(yōu)點(diǎn)，采用熒光化學(xué)傳感器對氨基酸進(jìn)行檢測，則可以很好地解 決上述問題。楊清正小組將熒光物種氟硼二吡咯（B0DIPY)在乙腈-水混合溶液中實(shí)現(xiàn)對 半胱氨酸（Cys)的高靈敏傳感。Xiaoming Feng等人用手性聯(lián)二萘酚（BIN0L)作為熒光化 學(xué)傳感器實(shí)現(xiàn)了在乙腈-水的混合溶液中對谷胱甘肽和半胱氨酸的檢測。Chengjian Zhu 小組制備了一種與Zn2+-比一配位的聚合物為熒光探針分子實(shí)現(xiàn)了在四氫呋喃中對具有 手性異構(gòu)體的丙氨酸區(qū)分檢測，然而這些傳感器只能在有機(jī)溶劑和水的混合溶液中進(jìn)行檢 測，然而實(shí)現(xiàn)在水中對氨基酸的檢測具有十分重要的意義。同時(shí)對天冬氨酸和谷氨酸的熒 光識別檢測鮮為報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述氨基酸檢測技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種靈敏 度高、選擇性好、測試范圍廣且可實(shí)現(xiàn)水溶液中檢測氨基酸的雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子 型熒光探針，并為該熒光探針提供一種合成方法，以及合成的熒光探針在檢測天冬氨酸或 谷氨酸中的應(yīng)用。
[0005] 解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0006]

【權(quán)利要求】
1. 一種雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針，其特征在于該熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下 所示：
2. -種權(quán)利要求1的雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針的合成方法，其特征在于 它由下述步驟組成： (1) 合成兩端叔丁氧羰基保護(hù)的二乙烯三胺 以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，將二乙烯三胺與叔丁基苯基碳酸酯、三乙胺按摩爾比為 3. 2?5:8?12:1，在氮?dú)獗Ｗo(hù)、冰浴條件下攪拌12?24小時(shí)，分離純化產(chǎn)物，得到式I所 示的兩端叔丁氧羰基保護(hù)的二乙烯三胺；
(2) 合成兩端叔丁氧羰基保護(hù)的二乙烯三胺丹磺酰衍生物 以三氯甲烷為溶劑，將兩端叔丁氧羰基保護(hù)的二乙烯三胺、丹磺酰氯、三乙胺按摩爾比 為1?1. 5:1:2?3. 5,在氮?dú)獗Ｗo(hù)、常溫條件下攪拌12?36小時(shí)，所得反應(yīng)液用飽和食 鹽水洗滌，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸除三氯甲烷，依次用正己烷與乙酸乙酯的體積比為 5?8:1的混合物、正己烷與乙酸乙酯的體積比為1:1的混合物、二氯甲烷和甲醇的體積比 為50?60:1的混合物作為洗脫液柱層析純化產(chǎn)物，真空干燥，得到式II所示的兩端叔丁氧 羰基保護(hù)的二乙烯三胺丹磺酰衍生物；
(3) 合成兩端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物 以二氯甲烷為溶劑，將兩端叔丁氧羰基保護(hù)的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、三氟醋酸按 摩爾比為1:80?90,在氮?dú)獗Ｗo(hù)、冰浴條件下攪拌12?24小時(shí)，蒸除二氯甲烷，加入蒸餾 水溶解，然后用飽和碳酸鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至9?11，用三氯甲烷萃取，有機(jī)層用無水硫酸鈉 干燥，蒸除三氯甲烷，真空干燥，得到式III所示的兩端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物；
(4) 合成兩端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物 以三氯甲烷為溶劑，將兩端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、溴乙酰溴、三乙胺按摩爾 比為1:2. 5?4:25?27,在氮?dú)獗Ｗo(hù)、冰浴條件下攪拌36?48小時(shí)，所得反應(yīng)液用去離 子水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，蒸除三氯甲烷，用石油醚與乙酸乙酯的體積比為1:3? 5的混合液作為洗脫柱層析純化產(chǎn)物，真空干燥，得到式IV所示的兩端溴的二乙烯三胺丹磺 酰衍生物；
(5) 合成雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針 以四氫呋喃為溶劑，將兩端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、N-甲基咪唑按摩爾比為 1:4?6,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流48?72小時(shí)，抽濾，所得固體在丙酮中加熱回流8?12 小時(shí)，抽濾，用乙醚淋洗，得到雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針的合成方法，其特征 在于：在合成兩端叔丁氧羰基保護(hù)的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步驟（2)中，所述的兩端叔 丁氧羰基保護(hù)的二乙烯三胺、丹磺酰氯、三乙胺按摩爾比為1?1. 3:1:2. 5?3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針的合成方法，其特征 在于：在合成兩端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步驟（4)中，所述的兩端氨基的二乙烯三 胺丹磺酰衍生物、溴乙酰溴、三乙胺按摩爾比為1:3?3. 5:25?27。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針的合成方法，其特征 在于：在合成雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針步驟（5)中，所述的兩端溴的二乙烯 三胺丹磺酰衍生物、N-甲基咪唑按摩爾比為1:4?5。
6. 權(quán)利要求1的雙咪唑丹磺酰衍生物陽離子型熒光探針在檢測氨基酸中的用途，所述 的氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸。
【文檔編號】G01N21/64GK104151248SQ201410341279
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】丁立平, 曹建華, 王世懷, 胡雯婷, 薛思琪, 陳霄 申請人:陜西師范大學(xué)