一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法，該脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括：標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、顯色液、分析緩沖液及濃縮洗滌液；該脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法包括：制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；制備包被有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的載體；制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶標(biāo)記物；制備分析緩沖液；制備濃縮洗滌液；組裝脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明可以取代其他試劑盒來進(jìn)行脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的定量檢測。本發(fā)明試劑盒價格低廉，而且操作簡便，靈敏度高，便于在臨床上大規(guī)模推廣使用。
【專利說明】一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測分析【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動脈粥樣硬化(atheiOscleiOsis)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病種，在過去很長一段時間內(nèi)始終是醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)研究的重點。因為它普及面廣，在人體內(nèi)潛伏期長，往往以局部缺血、心絞痛、心肌梗塞、中風(fēng)、冠心病或心力衰竭等致命病的形式爆發(fā)，已成為現(xiàn)階段最常見的死因。
[0003]脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp_PLA2)是心血管疾病中一種新的炎癥酶，屬于磷脂酶家族中PLA2的一種，是絲氨酸依賴的磷脂酶，能水解氧化低密度脂蛋白(LDL)，產(chǎn)生溶血磷脂酸膽喊(lysophosphatidylcholine,Lyso-PC)和氧化型游離脂肪酸(oxidized free fattyacids，ox-FA)，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。越來越多的研究證實，Lp-PLA2活性能反映動脈粥樣硬化病變的嚴(yán)重程度，并與易損斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)。它可作為缺血性卒中獨立的預(yù)測因子，可提供傳統(tǒng)危險因子評估以外的預(yù)測信息，測定其水平有助于指導(dǎo)預(yù)防策略。Lp-PLA2與其他炎性因子(如C-反應(yīng)蛋白等)相比，受其他危險因素的影響較小，檢測具有更高的靈敏度和特異性，目前已被用作預(yù)測心血管事件的風(fēng)險指標(biāo)，用以對患者心血管疾病進(jìn)行早期診斷、療效觀察及預(yù)后評估。大量臨床研究證實，Lp-PLA2與其他心血管疾病標(biāo)志物聯(lián)檢，可以更進(jìn)一步提高診斷的敏感性和特異性。
[0004]目前，臨床上用于測定Lp-PLA2的方法有ELISA法和免疫比濁法兩種。免疫比濁法檢測靈敏度低，很容易受血脂濃度影響產(chǎn)生假性升高，且不適用于大批量、自動化式檢測平臺。ELISA法具有更高的靈敏度、特異性，且具有檢測時間短、測量線性范圍寬、穩(wěn)定性好、操作簡便快捷、便于自動化、安全無污染等諸多優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于傳染病、肥胖相關(guān)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)、遺傳病、腫瘤的早期診斷、動植物檢驗檢疫等眾多領(lǐng)域，并已逐漸成為標(biāo)記免疫分析的一個重要方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法，旨在解決酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在人Lp-PLA2免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用方面仍是空白的問題。
[0006]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，該脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括:標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、顯色液、分析緩沖液及濃縮洗滌液；
[0007]標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品是以胎牛血清為基質(zhì)，由脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原稀釋而成，其中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度包括 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL 共 6 個濃度，質(zhì)控品分為質(zhì)控低值和質(zhì)控高值，濃度范圍依次為150±30ng/mL、300±60ng/mL。
[0008]進(jìn)一步載體為微孔板、磁性顆?；蛩芰瞎堋?br> [0009]進(jìn)一步用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0010]進(jìn)一步顯色液為四甲基聯(lián)苯胺或3_(2’ -螺旋金剛烷)-4_甲氧基_4-(3’ -磷酰氧基)苯基_1，2- 二氧乙燒。
[0011]進(jìn)一步分析緩沖液為含有I %牛血清白蛋白和0.05%吐溫的IOmM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。
[0012]進(jìn)一步濃縮洗滌液為含有1%吐溫的20mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。
[0013]本發(fā)明實施例的另一目的在于提供一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法，該脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法包括以下步驟:
[0014]步驟一，制備脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品:
[0015]用pH7.4、20mmol/L PBS緩沖液與胎牛血清按體積比3:1比例混合配制成基礎(chǔ)緩沖液，用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品；用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質(zhì)控品和150ng/mL低值質(zhì)控品，高、低質(zhì)控品的濃度測定范圍經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析確定為300±35ng/mL、150± 15ng/mL ；
[0016]步驟二，制備包被有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的載體:
[0017]載體為微孔板或塑料管時，包被載體通過以下方法制備:脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經(jīng)過稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體負(fù)載于載體上，包被結(jié)束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37°C封閉2小時或4°C封閉過夜；棄去封閉液，室溫18-25°C干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，所述包被緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽溶液，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為lug/mL ;稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔IOOul ;包被的條件可置于37°C包被2小時或4°C包被過夜；封閉緩沖液為pH7.2-7.4、IOmmoI/L PBST溶液，內(nèi)含1% BSA及I~10%蔗糖；封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul ；封閉后包被載體的干燥環(huán)境相對濕度小于30% ；
[0018]載體為磁性顆粒時，包被載體通過以下方法制備:吸取3mL內(nèi)含2%磁顆粒的PBS溶液，用磁力架分離，用去離子水清洗；用清洗液清洗磁顆粒并調(diào)整體積至6mL ;加入5mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，置于4°C內(nèi)混勻30min ;加入12mg碳二亞胺，置于4°C內(nèi)孵育過夜；用ρΗ7.4、IOOmmoI/L PBS緩沖液清洗磁顆粒；加入Tris和EDTA，使終濃度依次為50mmol/L和4mmol/L ;調(diào)節(jié)pH至7.4,抗體終濃度為lmg/mL,得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，清洗液為PH6.0、10mmol/L PBS緩沖液；
[0019]步驟二，制備脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2抗體酶標(biāo)記物:
[0020]用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為:采用戊二醛交聯(lián)法將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，用pH7.2U0mmol/L PBS緩沖液充分透析，在透析后的結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，_20°C以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20%胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，置于4°C保存至有效期，胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/L PBST溶液，內(nèi)含20%胎牛血清、I~10%蔗糖、0.01 %食品紅；[0021]用于標(biāo)記的酶為辣根過氧化物酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為:溶解2mg辣根過氧化物酶于ImL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4°C緩慢搖動30min，用pH4.4、Immo 1/L醋酸鈉緩沖液透析過夜,加入2mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體,4 °C震蕩過夜，使用400ul200mmol/L NaBH4溶液進(jìn)行還原，經(jīng)pH7.4、20mmol/L PBS緩沖液透析過夜后用HPLC 二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-20°C以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20%胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4°C保存至有效期，胎牛血清稀釋液為pH7.4、10mmol/L PBST溶液，內(nèi)含20%胎牛血清、I %蔗糖、0.1 %防腐劑、
0.01%食品紅；
[0022]步驟四，制備分析緩沖液，分析緩沖液為pH7.4U0mmol/L PBST緩沖液，內(nèi)含1%BSA ；
[0023]步驟五，制備濃縮洗滌液，濃縮洗滌液為pH7.2-7.4、20mmol/L PBS緩沖液，內(nèi)含I %吐溫；
[0024]步驟六，組裝脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、顯色液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0025]本發(fā)明提供的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法，采用雙抗體夾心反應(yīng)模式，可以對人血樣本中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2分子進(jìn)行專一的定量檢測。具有靈敏度高、檢測范圍寬、穩(wěn)定性好、操作簡便快速無污染等優(yōu)點。本發(fā)明與其他開放式全自動酶聯(lián)免疫檢測平臺相結(jié)合，可以有效縮短檢測時間，降低檢測成本和人力花費。項目開發(fā)的產(chǎn)品市場前景廣闊，經(jīng)濟(jì)和社會效益顯著；與免疫比濁等方法相比較，本發(fā)明簡化了操作步驟，縮短了檢測時間、大大提高了測定的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0026]本發(fā)明使用的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體具有高度特異性，得到的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法可以取代其他試劑盒來進(jìn)行脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的定量檢測。與國外試劑盒相比，本發(fā)明試劑盒不僅價格低廉，而且操作簡便，靈敏度高，便于在臨床上大規(guī)模推廣使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是本發(fā)明的實施例1所制備的試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品線形圖；
[0028]圖2為本發(fā)明實施例1提供的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與美國PLAC公司脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫測定試劑盒檢測200例心血管病人相關(guān)性的結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0029]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0030]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0031]本發(fā)明實施例的一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括:標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、顯色液、分析緩沖液及濃縮洗滌液；[0032]標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品是以胎牛血清為基質(zhì)，由脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原稀釋而成，其中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度包括 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL 共 6 個濃度，質(zhì)控品分為質(zhì)控低值和質(zhì)控高值，濃度范圍依次為150±30ng/mL、300±60ng/mL ；
[0033]載體為微孔板、磁性顆?；蛩芰瞎?；
[0034]用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；
[0035]顯色液為四甲基聯(lián)苯胺或3_(2’ -螺旋金剛烷)-4_甲氧基_4-(3’ -磷酰氧基)苯基_1，2- 二氧乙燒；
[0036]分析緩沖液為含有I %牛血清白蛋白和0.05%吐溫的IOmM磷酸鹽緩沖溶液，ρΗ7.2-7.4 ；
[0037]濃縮洗滌液為含有I %吐溫的20mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。
[0038]本發(fā)明具體的方法如下:
[0039]步驟一，制備脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品:
[0040]用pH7.4、20mmol/L PBS緩沖液與胎牛血清按體積比3:1比例混合配制成基礎(chǔ)緩沖液，用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品；用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質(zhì)控品和150ng/mL低值質(zhì)控品，高、低質(zhì)控品的濃度測定范圍經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析確定為300±60ng/mL、150±30ng/mL ；
[0041]步驟二，制備包被有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的載體:
[0042]載體為微孔板或塑料管時，包被載體可通過以下方法制備:脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經(jīng)過稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體負(fù)載于載體上，包被結(jié)束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37°C封閉2小時或4°C封閉過夜；棄去封閉液，室溫(18-25°C )干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體,所述包被緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽溶液,所述脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為lug/mL ;所述稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔IOOul ;所述包被的條件可置于37°C包被2小時或4°C包被過夜；所述封閉緩沖液為PH7.2-7.4U0mmol/L PBST溶液，內(nèi)含1% BSA、1?10%蔗糖；所述封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul ;所述封閉后包被載體的干燥環(huán)境相對濕度小于30% ；
[0043]載體為磁性顆粒時，包被載體可通過以下方法制備:吸取3mL內(nèi)含2%磁顆粒的PBS溶液，用磁力架分離，用去離子水清洗；用清洗液清洗磁顆粒并調(diào)整體積至6mL ;加入5mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，置于4°C內(nèi)混勻30min ;加入12mg碳二亞胺，置于4°C內(nèi)孵育過夜；用PH7.4U00mmol/L PBS緩沖液清洗磁顆粒；加入Tris和EDTA，使終濃度依次為50mmol/L和4mmol/L ;調(diào)節(jié)pH至7.4,抗體終濃度為lmg/mL,得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，所述清洗液為PH6.0U0mmol/L PBS緩沖液；
[0044]步驟二，制備脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2抗體酶標(biāo)記物:
[0045]用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為:采用戊二醛交聯(lián)法將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，用pH7.2U0mmol/L PBS緩沖液充分透析，在透析后的結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，-20°C以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20%胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4°C保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/L PBST溶液，內(nèi)含20%胎牛血清、I?10%蔗糖、0.01%食品紅；
[0046]用于標(biāo)記的酶為辣根過氧化物酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為:溶解2mg辣根過氧化物酶于ImL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4°C緩慢搖動30min，用pH4.4、Immo 1/L醋酸鈉緩沖液透析過夜,加入2mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體,4 °C震蕩過夜，使用400ul200mmol/L NaBH4溶液進(jìn)行還原，經(jīng)pH7.4、20mmol/L PBS緩沖液透析過夜后用HPLC 二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-20°C以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20%胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4°C保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為PH7.4U0mmol/L PBST溶液，內(nèi)含20%胎牛血清、I %蔗糖、0.1%防腐劑、0.01%食品紅；
[0047]步驟四，制備分析緩沖液，分析緩沖液為pH7.4U0mmol/L PBST緩沖液，內(nèi)含1%BSA ；
[0048]步驟五，制備濃縮洗滌液，濃縮洗滌液為pH7.2-7.4、20mmol/L PBS緩沖液，內(nèi)含I %吐溫；
[0049]步驟六，組裝脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、顯色液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0050]結(jié)合以下的實施例對本發(fā)明的應(yīng)用效果做進(jìn)一步的說明:
[0051]實施例1:
[0052]本發(fā)明實施例的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、堿性磷酸酶酶標(biāo)記物、顯色液、分析緩沖液、濃縮洗滌液；
[0053]其中:
[0054]1.標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品用下述方法制成:用pH7.4、20mmol/L PBS緩沖液與胎牛血清按體積比3:1比例混合配制成基礎(chǔ)緩沖液，用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、01^/11114示準(zhǔn)品；用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質(zhì)控品和150ng/mL低值質(zhì)控品，高、低質(zhì)控品的濃度測定范圍經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析確定為300±60ng/mL、150±30ng/mL ；
[0055]2.包被微孔板的制備步驟為:脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經(jīng)過稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體負(fù)載于載體上，包被結(jié)束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37°C封閉2小時或4°C封閉過夜；棄去封閉液，室溫(18-25°C )干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，所述包被緩沖液為PH7.2、10mmol/L磷酸鹽溶液，所述脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為lug/mL;所述稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔IOOul ;所述包被的條件可置于37°C包被2小時或4°C包被過夜；所述封閉緩沖液為pH7.4、IOmmoI/L PBST溶液，內(nèi)含1% BSA及I~10%蔗糖；所述封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul ;所述封閉后包被載體的干燥環(huán)境相對濕度小于30% ；
[0056]3.堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的制備方法為:采用戊二醛交聯(lián)法將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，用pH7.2U0mmol/L PBS緩沖液充分透析，在透析后的結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，-20°C以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20%胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4°C保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/L PBST溶液，內(nèi)含20%胎牛血清、I %蔗糖、0.01%食品紅；
[0057]4.分析緩沖液的制備配方為:pH7.4、IOmmoI/L PBST緩沖液，內(nèi)含I % BSA ;
[0058]5.濃縮洗滌液的制備配方為:pH7.4、20mmol/L PBS緩沖液，內(nèi)含I %吐溫；
[0059]6.半成品及成品組成:上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品，隨機(jī)抽取三批進(jìn)行特異性、精密度、靈敏度及穩(wěn)定性檢驗，合格后組裝為脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0060]實驗證明:用塑料管替代實施例1步驟2中的微孔板，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0061]用磁性顆粒替代實施例1步驟2中的微孔板，并在所述試劑盒中放入空白微孔板或塑料管，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0062]實驗證明:用pH為7.3或7.4的包被緩沖液替代實施例1步驟2中的pH值為7.2的包被緩沖液，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0063]實驗證明:用pH為7.2或7.3的封閉緩沖液替代實施例1步驟2中的pH值為7.4的封閉緩沖液，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0064]實驗證明:用pH為7.2或7.3的濃縮洗滌液替代實施例1步驟2中的pH值為7.4的濃縮洗滌液，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0065]實施例2:
[0066]一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括以下組分:
[0067]1.標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品(同實施例1):
[0068]2.包被載體(同實施例1)
[0069]3.辣根過氧化物酶標(biāo)記物，其制備方法為:溶解2mg辣根過氧化物酶于ImL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液,4°C緩慢搖動30min,用pH4.4、lmmol/L醋酸鈉緩沖液透析過夜，加入2mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，4°C震蕩過夜，使用400ul200mmol/L NaBH4溶液進(jìn)行還原，經(jīng)pH7.4、20mmol/L PBS緩沖液透析過夜后用HPLC 二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-200C以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20%胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4°C保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、10mmol/L PBST溶液，內(nèi)含20%胎牛血清、I %蔗糖、、0.01%食品紅；
[0070]4.分析緩沖液(同實施例1);
[0071]5.濃縮洗滌液(同實施例1)；
[0072]6.半成品及成品組成(同實施例1);
[0073]實驗證明:用塑料管替代實施例1步驟2中的微孔板，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0074]用磁性顆粒替代實施例1步驟2中的微孔板，并在所述試劑盒中放入空白微孔板或塑料管，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0075]實驗證明:用pH為7.3或7.4的包被緩沖液替代實施例1步驟2中的pH值為7.2的包被緩沖液，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0076]實驗證明:用pH為7.2或7.3的封閉緩沖液替代實施例1步驟2中的pH值為7.4的封閉緩沖液，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0077]實驗證明:用pH為7.2或7.3的濃縮洗滌液替代實施例1步驟2中的pH值為7.4的濃縮洗滌液，其他同實施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0078]實施例3:
[0079]以下給出采用實施例1中制備的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測臨床樣本中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的具體操作方法:
[0080]1.樣本處理:待測樣本為血漿時，用EDTA抗凝管取血2mL，1500r/min離心10分鐘，收集上清液；待測樣本為血清時，用普通管或促凝管取血2mL，4°C下放置30分鐘后，1500r/min離心10分鐘，收集上清液；
[0081]2.樣本檢測:將樣本、分析緩沖液加到固相有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的微孔板中，反應(yīng)30min后，樣本中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2與固相抗體特異性結(jié)合，洗去游離成分，加入酶標(biāo)記物避光反應(yīng)30min，被酶標(biāo)記的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與抗原、固相抗體形成“夾心”復(fù)合物，洗去游離成分，加入顯色液，避光反應(yīng)5min后測定各孔吸光值，其與其中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原濃度正相關(guān)，樣本濃度依據(jù)樣本的OD值可進(jìn)行定量計算；
[0082]實施例4:
[0083]以下給出按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果見表1:
[0084]表1
[0085]
【權(quán)利要求】
1.一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括:標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、顯色液、分析緩沖液及濃縮洗滌液； 標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品是以胎牛血清為基質(zhì)，由脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原稀釋而成，其中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度包括 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL 共 6 個濃度，質(zhì)控品分為質(zhì)控低值和質(zhì)控高值，濃度范圍依次為150±30ng/mL、300±60ng/mL。
2.如權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述包被載體為微孔板、磁性顆?；蛩芰瞎?。
3.如權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
4.如權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述顯色液為四甲基苯胺或3- (2 ’ -螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3 ’ -磷酰氧基)苯基-1，2- 二氧乙烷。
5.如權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述分析緩沖液為含有1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫的IOmM磷酸鹽緩沖溶液，pH為7.2-7.4。
6.如權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為含有1%吐溫的20mM磷酸鹽緩沖溶液，pH為7.2-7.4。
7.一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法，其特征在于，所述脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法包括以下步驟: 步驟一，制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品: 用pH = 7.4,20mmol/L的PBS緩沖液與胎牛血清按體積比3:1比例混合配制成基礎(chǔ)緩沖液，用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、Ong/mL標(biāo)準(zhǔn)品；用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2抗原稀釋成濃度為300±60ng/mL的高值質(zhì)控品和150±30ng/mL的低值質(zhì)控品； 步驟二，制備包被有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的載體: 所述包被載體為微孔板或塑料管時，包被載體通過以下方法制備:脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經(jīng)過稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體負(fù)載于載體上，包被結(jié)束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37°C封閉2小時或4°C封閉過夜；棄去封閉液，室溫18-25°C干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，所述包被緩沖液為pH為7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽溶液，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為lug/mL ;稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔IOOul ;包被的條件可置于37°C包被2小時或4°C包被過夜；封閉緩沖液為pH7.2-7.4U0mmol/L PBST溶液，內(nèi)含1% BSA及I~10%蔗糖；封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul ;封閉后包被載體的干燥環(huán)境相對濕度小于30% ； 步驟三，制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶標(biāo)記物: 用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為:采用戊二醛交聯(lián)法將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，用pH為7.2U0mmol/L PBS緩沖液充分透析，在透析后的結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，-20°C以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20%胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，置于4°C保存至有效期，胎牛血清稀釋液為PH為7.4、20mmol/L PBST溶液，內(nèi)含20%胎牛血清、I~10%蔗糖、0.01 %食品紅； 步驟四，制備分析緩沖液，分析緩沖液為pH7.4U0mmol/L PBST緩沖液，內(nèi)含1% BSA、1%防腐劑； 步驟五，制備濃縮洗滌液，濃縮洗滌液為pH7.2-7.4、20mmol/L PBS緩沖液，內(nèi)含1%吐溫； 步驟六，組裝脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、顯色液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
8.如權(quán)利要求7所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法，其特征在于,在步驟二中,載體為磁性顆粒時,包被載體通過以下方法制備:吸取3mL內(nèi)含2%磁顆粒的PBS溶液，用磁力架分離，用去離子水清洗；用清洗液清洗磁顆粒并調(diào)整體積至6mL ;加入5mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，置于4°C內(nèi)混勻30min ;加入12mg碳二亞胺，置于4°C內(nèi)孵育過夜；用PH7.4U00mmol/L PBS緩沖液清洗磁顆粒；加入Tris和EDTA，使終濃度依次為50mmol/L和4mmol/L ;調(diào)節(jié)pH至7.4,抗體終濃度為lmg/mL,得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，清洗液為PH6.0、lOmmol/L PBS緩沖液。
9.如權(quán)利要求7所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法，其特征在于，在步驟三中，用于標(biāo)記的酶為辣根過氧化物酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為:溶解2mg辣根過氧化物酶于ImL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4°C緩慢搖動30min,用pH4.4、lmmol/L醋酸鈉緩沖液透析過夜,加入2mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，4°C震蕩過夜，使用400ul200mmol/L NaBH4溶液進(jìn)行還原，經(jīng)pH7.4、20mmol/L PBS緩沖液透析過夜后用HPLC 二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，_20°C以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20%胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4°C保存至有效期，胎牛血清稀釋液為PH7.4U0mmol/L PBST溶液，內(nèi)含20%胎牛血清、I %蔗糖、0.01%食品紅。
【文檔編號】G01N33/535GK104007260SQ201410265732
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】蘭成杰 申請人:天津康爾克生物科技有限公司