一種快速測(cè)定禽源多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物中細(xì)菌總數(shù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速測(cè)定禽源多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物中細(xì)菌總數(shù)的方法，它包括以下步驟：①洗滌液配制；②取樣；③樣品處理；④檢測(cè)：利用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定處理后的樣品于600nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值，以步驟①中洗滌液為參比；⑤計(jì)算：當(dāng)OD值在0.4-1.2的范圍內(nèi)時(shí)，樣品的含菌數(shù)為(4129.4×OD600+509.31)×106CFU/mL，當(dāng)OD值＜0.4時(shí)，將樣品適當(dāng)濃縮后測(cè)定，當(dāng)OD值＞1.2時(shí)，將樣品適當(dāng)稀釋后測(cè)定，并計(jì)算含菌總數(shù)。本發(fā)明的目的在于提供一種快速測(cè)定禽源多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物中細(xì)菌總數(shù)的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1.簡(jiǎn)單；2.快速；3.誤差小。
【專利說(shuō)明】一種快速測(cè)定禽源多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物中細(xì)菌總數(shù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種快速測(cè)定禽源多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物中細(xì)菌總數(shù)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]禽霍亂，又名禽出血性敗血癥、禽巴氏桿菌病或禽搖頭瘟等，是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)引起的侵害各種禽類的接觸性傳染病。該病的流行季節(jié)主要為夏末和秋季，主要通過(guò)消化道和呼吸道傳染。各種日齡均易感，但多發(fā)生于性成熟的禽類。該病最急性發(fā)作時(shí)，病程短促、死亡快，?？床灰?jiàn)發(fā)病即死亡。急性發(fā)作時(shí)，病禽體溫升高，羽毛松亂，精神萎頓，獨(dú)居一隅，閉目瞌睡。口、鼻分泌物增多而引起呼吸困難、搖頭企圖甩出喉頭粘液。典型的剖檢病變?yōu)榧毙詳⊙Y，心包內(nèi)充滿透明橙黃色滲出物，心冠脂肪上有出血點(diǎn)。肝、脾腫大，質(zhì)地變脆、表面密布有大量針尖大的圓形灰白色壞死點(diǎn)。腸道出血，以小腸前段和大腸粘膜充血和出血最嚴(yán)重，小腸后段和盲腸較輕。腸內(nèi)容物呈膠凍樣，腸粘膜脫落，腸淋巴集結(jié)環(huán)狀腫大、出血。慢性發(fā)作時(shí)，病禽表現(xiàn)為消瘦，下痢，鼻炎，關(guān)節(jié)炎。病程稍長(zhǎng)者可見(jiàn)局部關(guān)節(jié)腫脹，影響病禽行走。該病廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]細(xì)菌計(jì)數(shù)是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行各方面研究的基礎(chǔ)。平板菌落計(jì)數(shù)法是最常用的方法。平板菌落計(jì)數(shù)法的原理是每個(gè)活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長(zhǎng)條件下可以通過(guò)生長(zhǎng)形成肉眼可見(jiàn)的菌落?？梢詫⒕鷳乙哼B續(xù)稀釋，取一定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，推算菌懸液中的活菌數(shù)。該方法適用于樣品中的活的可培養(yǎng)的菌數(shù)的測(cè)定，靈敏度高，對(duì)操作者的素質(zhì)要求較高，耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種快速測(cè)定禽源多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物中細(xì)菌總數(shù)的方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種快速測(cè)定禽源多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物中細(xì)菌總數(shù)的方法，它包括以下步驟:
[0006]①洗滌液配制:配制適合禽源多殺性巴氏桿菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基作為洗滌液，室溫保存；
[0007]②取樣:取一定體積的待測(cè)樣品；
[0008]③樣品處理:將樣品5000g離心5min，吸出上清，加入與去上清后所剩的樣品等體積的洗滌液，輕輕吹打混勻，再次5000g離心5min，吸出上清，再加入與去上清后所剩的樣品等體積的洗滌液，輕輕吹打混勻；
[0009]④檢測(cè):利用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定處理后的樣品于600nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值，以步驟①中洗滌液為參比；
[0010]⑤計(jì)算:當(dāng)OD值在0.4-1.2的范圍內(nèi)時(shí)，樣品的含菌數(shù)為(4129.4X0D600+509.31) X 106CFU/mL,當(dāng)OD值< 0.4時(shí)，將樣品適當(dāng)濃縮后測(cè)定，當(dāng)OD值〉1.2時(shí)，將樣品適當(dāng)稀釋后測(cè)定，并計(jì)算含菌總數(shù)。
[0011]較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0012]1、簡(jiǎn)單。與平板菌落計(jì)數(shù)法相比，省去了稀釋、培養(yǎng)、人工計(jì)數(shù)的步驟。
[0013]2、快速。與平板菌落計(jì)數(shù)法相比，省去了細(xì)菌培養(yǎng)的時(shí)間。禽源殺性巴氏桿菌在平板上形成肉眼明顯可見(jiàn)的菌落約需時(shí)16h-18h，該方法僅需30min即可得出結(jié)果。
[0014]3、誤差小。平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)操作人員的素質(zhì)要求較高，不同人員操作得到的數(shù)據(jù)差異較大，可重復(fù)性較差。而該方法利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)，可重復(fù)性好。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是樣品0D_值與含菌數(shù)的線性關(guān)系圖。
[0016]圖2是圖1中部分樣品0D_值與含菌數(shù)的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:
[0018]1、洗滌液的選擇
[0019]常規(guī)細(xì)菌的洗滌液選擇無(wú)菌蒸餾水或生理鹽水，但禽源多殺性巴氏桿菌在這兩種液體中迅速死亡，所以只能選擇適合禽源多殺性巴氏桿菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基如馬丁肉湯、LB培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯、腦心浸液肉湯等。本技術(shù)方案的建立選擇馬丁肉湯。
[0020]2、禽源多殺性巴氏桿菌CVCC44801株(購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心)，劃線接種于馬丁瓊脂平板，37°C培養(yǎng)20h，挑取10個(gè)單菌落接種于400mL馬丁肉湯中，于37°C振蕩培養(yǎng)箱中，200rpm振蕩培養(yǎng)5h。此時(shí)還處于多殺性巴氏桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，培養(yǎng)液中的活菌數(shù)即為總菌數(shù)。
[0021]3、將培養(yǎng)液取出，于2V -8°C冷水中水浴30min。
[0022]4、按表I取樣，將樣品5000g離心5min，吸出上清，加入等體積無(wú)菌馬丁肉湯，輕輕吹打混勻。再次5000g離心5min，吸出上清，加入表中相應(yīng)終體積的無(wú)菌馬丁肉湯，輕輕吹打混勻。以無(wú)菌馬丁肉湯為參比，測(cè)定不同倍數(shù)稀釋或濃縮后的樣品于600nm波長(zhǎng)時(shí)的OD600值，每個(gè)樣品測(cè)3次，記錄其平均值。
[0023]表I培養(yǎng)液的稀釋或濃縮
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種快速測(cè)定禽源多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物中細(xì)菌總數(shù)的方法，其特征在于，它包括以下步驟: ①洗滌液配制:配制適合禽源多殺性巴氏桿菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基作為洗滌液，室溫保存； ②取樣:取一定體積的待測(cè)樣品； ③樣品處理:將樣品5000g離心5min，吸出上清，加入與步驟②所取待測(cè)樣品等體積的洗滌液，輕輕吹打混勻，再次5000g離心5min，吸出上清，再加入與步驟②所取待測(cè)樣品等體積的洗滌液，輕輕吹打混勻； ④檢測(cè):利用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定處理后的樣品于600nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值，以步驟①中洗漆液為參比； ⑤計(jì)算:當(dāng)OD值在0.4-1.2的范圍內(nèi)時(shí)，樣品的含菌數(shù)為(4129.4X0D600+509.31) X 106CFU/mL,當(dāng)OD值< 0.4時(shí)，將樣品適當(dāng)濃縮后測(cè)定，當(dāng)OD值〉1.2時(shí)，將樣品適當(dāng)稀釋后測(cè)定，并計(jì)算含菌總數(shù)。
【文檔編號(hào)】G01N21/33GK103969207SQ201410214797
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】程龍飛, 林建生, 黃瑜, 傅光華, 施少華, 陳紅梅, 萬(wàn)春和, 傅秋玲 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院