一種吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，包括如下試劑：磁分離試劑：標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒懸浮液，所述的標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒的濃度為0.1~1.0mg/ml；酶標(biāo)試劑：含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體溶液，所述的含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體的濃度為0.5~1μg/ml。本發(fā)明通過采用標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒懸浮液和含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體溶液制成的試劑盒，使得靈敏度達(dá)到0.008IU/ml，并且該試劑盒與其他免疫球蛋白的交叉反應(yīng)率均小于0.04%，準(zhǔn)確性好、精密度高，樣本無需預(yù)稀釋，操作簡單省時，檢測范圍寬。
【專利說明】一種吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，具體涉及一種吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]化學(xué)發(fā)光技術(shù)在歐美發(fā)達(dá)國家比較成熟，以瑞士羅氏、美國雅培、美國貝克曼，德國西門子等進(jìn)口品牌為代表，其質(zhì)量可靠，性能穩(wěn)定，主要集中在國內(nèi)的三級以及部分二級醫(yī)院開展，但由于各家試劑的產(chǎn)品特點(diǎn)及在國內(nèi)的注冊情況不同，一般三級醫(yī)院會同時應(yīng)用上述廠家不同系列的產(chǎn)品。
[0003]過敏性疾病又稱變態(tài)反應(yīng)性疾病，是指機(jī)體通過吸入、食入、注入或接觸某種含有致敏成分的物質(zhì)(稱為過敏原或變應(yīng)原)后觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過量的免疫球蛋白E (IgE)，從而引起各種功能性障礙或組織損傷的一類疾病，常表現(xiàn)為支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮膚病等，有時會發(fā)生威脅生命的過敏性休克。過敏性疾病影響著全世界近1/4的人口，被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一。實(shí)際上，很多的過敏性疾病，只要知道了過敏原，就可以采取簡單的避免接觸和謹(jǐn)慎使用的方式，防止過敏性疾病的發(fā)生，極大節(jié)省醫(yī)療開支，減少抗過敏類藥物的使用。目前本項(xiàng)目的研究內(nèi)容即是研發(fā)和優(yōu)化與血清學(xué)抗原抗體反應(yīng)原理相關(guān)的各種關(guān)鍵技術(shù)，從而提高針對臨床患者體內(nèi)IgE抗體的檢測敏感度和特異性，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出靈敏、穩(wěn)定的納米磁微粒免疫診斷試劑，從而快速、準(zhǔn)確地確定機(jī)體相關(guān)的過敏原類型。
[0004]相對于體外診斷試劑，過敏原檢測的主要的替代品是皮試。這是傳統(tǒng)的檢測方法，具有準(zhǔn)確性高、簡便易行的優(yōu)點(diǎn)。但是，皮試具有受檢者痛苦、危險性高、發(fā)作期不能檢查、依賴主管判斷的致命缺點(diǎn)，江蘇省和北京市都有過患者因皮試死亡的病例。而且，目前全國沒有經(jīng)過藥監(jiān)局批準(zhǔn)的合法皮試產(chǎn)品，所以其替代性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏度高的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒。
[0006]本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供上述試劑盒的制備方法。
[0007]本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是提供采用上述試劑盒進(jìn)行檢測的檢測方法。
[0008]為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
[0009]一種吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，包括如下試劑:
[0010]磁分離試劑:標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒懸浮液，所述的標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒的濃度為0.1?1.0mg/ml ；
[0011]酶標(biāo)試劑:含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體溶液，所述的含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體的濃度為0.5?I μ g/mlo[0012]優(yōu)選地,所述的吸入過敏原的純度大于90%。
[0013]優(yōu)選地，所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為0.1?2 μ m，每克磁微粒表面的羧基含量不低于I毫摩爾。
[0014]優(yōu)選地，所述的吸入過敏原與所述的磁微粒的摩爾比為0.02?0.16:1。
[0015]優(yōu)選地，所述的抗人IgE抗體與所述的堿性磷酸酶的摩爾比為1:1?5。
[0016]優(yōu)選地，所述的堿性磷酸酶的純度大于95%，比活性大于1000U/mg，濃度大于5mg/ml ο
[0017]優(yōu)選地,所述的抗人IgE抗體的純度大于95%,濃度大于lmg/ml。
[0018]上述吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的制備方法，
[0019]磁分離試劑的制備方法為:將所述的磁微粒用0.04?0.06mol/L、pH4.5?5的2-嗎啉乙磺酸緩沖液重懸；然后加入所述的吸入過敏原，在15?40°C下混懸30?60分鐘；然后再加入新鮮配置的8?12mg/ml的碳二亞胺水溶液,在15?40°C下混懸2?12h,其中所述的2-嗎啉乙磺酸緩沖液與所述的碳二亞胺水溶液的體積比為10?20:1 ;磁分離，去上清，用含質(zhì)量比為4.5?5.5%的牛血清白蛋白、pH為8?9.5、物質(zhì)的量濃度為0.01?0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液重懸到所述的標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒的濃度為0.1?1.0mg/ml,即得所述的磁分離試劑；
[0020]酶標(biāo)試劑的制備方法為:將抗人IgE抗體加入到濃度為8?12mg/ml的2_亞胺基硫烷鹽酸鹽偶聯(lián)劑中，在15?40°C下靜置18?25分鐘，加入0.09?0.llmol/L的甘氨酸溶液，在15?40°C下靜置4?5分鐘，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后抗人IgE抗體，2?8°C保存?zhèn)溆?；將堿性磷酸酶溶液加入到4?5mg/ml的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中，在15?40°C下靜置25?35分鐘，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，2?8°C保存?zhèn)溆?；將活化后的抗人IgE抗體和活化后的堿性磷酸酶混合，在2?8°C下靜置12?24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化，獲得連接物濃溶液，在2?8°C保存?zhèn)溆茫粚⑺龅倪B接物濃溶液用含質(zhì)量比為0.4?0.6%的牛血清白蛋白、pH為7.8?8.0、物質(zhì)的量濃度為0.09?0.llmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋到含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體的濃度為0.5?I μ g/ml,即得所述的酶標(biāo)試劑；
[0021]上述吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的檢測方法，包括依次進(jìn)行的以下步驟:
[0022]步驟1:在檢測管中加入待測樣本原液，然后加入所述的磁分離試劑，混勻，在36?38°C下溫育25?35分鐘，其中所述的待測樣本原液與所述的磁分離試劑的體積比為1:0.9 ?1.1 ;
[0023]步驟2:添加磁場，使步驟I溫育后的體系在磁場中沉降，去除上清液，經(jīng)清洗液多次清洗后，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸；
[0024]步驟3:向步驟2處理后的體系中加入所述的酶標(biāo)試劑，混勻，在36?38°C下溫育8?12分鐘；
[0025]步驟4:添加磁場，使步驟3溫育后的磁微粒在磁場中沉降，去除上清液，經(jīng)清洗液多次清洗后，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸；
[0026]步驟5:添加磁場，使步驟4處理后的磁微粒在磁場中沉降，去除上清液，然后加入發(fā)光底物，去除磁場，充分混懸后檢測5min內(nèi)相對發(fā)光強(qiáng)度值。[0027]由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0028]本發(fā)明通過采用標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒懸浮液和含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體溶液制成的試劑盒，使得靈敏度達(dá)到0.008IU/ml，并且該試劑盒與其他免疫球蛋白的交叉反應(yīng)率均小于0.04%，準(zhǔn)確性好、精密度高，樣本無需預(yù)稀釋，操作簡單省時，檢測范圍寬。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]附圖1為A，B點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲線；
[0030]附圖2為實(shí)施例1制備得到的試劑盒的系統(tǒng)參比結(jié)果；
[0031]附圖3為測試校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件為本行業(yè)中的常規(guī)條件。
[0033]實(shí)施例1:試劑盒的制備
[0034](一)磁分離試劑的制備:
[0035]材料與儀器:
[0036]1、磁微粒:含羧基(COOH)活性集團(tuán)，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量為I毫摩爾(mmol),具有超順磁性,直徑為I μ m。
[0037]2、吸入過敏原:將凍干粉塵螨過敏原IOmg用磷酸鹽緩沖液(pH7.2，0.02M) 2ml溶解，得濃度5mg/ml過敏原溶液，將所得溶液裝入透析袋中，系緊透析袋后，用磷酸鹽緩沖液500ml，4°C進(jìn)行透析4?8小時，換液3_4次，收集透析產(chǎn)物，過敏原蛋白純度為90%。
[0038]3、2-嗎啉乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)和其他試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純。
[0039]操作步驟:
[0040]1、取IOOmg磁微粒,磁分離去上清,用0.05mol/L、pH5的MES緩沖液IOml重懸；
[0041]2、加入8mg的吸入過敏原，室溫混懸50min ；
[0042]3、加入Iml,新鮮配制的10mg/ml的EDC水溶液,室溫混懸IOh ；
[0043]4、磁分離，去上清，用含5%牛血清白蛋白(BSA)、pH9的lmol/L的TRIS緩沖液重懸到lmg/ml,完成磁分離試劑的制備。
[0044](二)酶標(biāo)試劑的制備:
[0045]材料與儀器:
[0046]1、抗人IgE抗體由蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司制備，純度為95%，濃度為Img/ml,以磷酸鹽緩沖液保存；
[0047]2、堿性磷酸酶(ALP)純度為95%，比活性應(yīng)為1000U/mg，濃度為5mg/ml ；
[0048]3、偶聯(lián)劑4-(N_馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)，2-亞胺基硫烷鹽酸鹽(2-1T)購自THERMO公司，TRIS等化學(xué)試劑達(dá)到化學(xué)純；
[0049]4、G-25凝膠柱和Supperdex200凝膠純化柱為GE公司產(chǎn)品。[0050]操作步驟:
[0051]1、取Img抗人IgE抗體，加入I Omg/ml的偶聯(lián)劑2-1T溶液3 μ 1，室溫靜置20min，加入0.lmol/L的甘氨酸溶液10 μ 1，室溫靜置5min。用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后抗人IgE抗體，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0052]2、取 1.5mg 的 ALP，加入 5mg/ml 的 SMCC 溶液 15 μ 1，室溫靜置 30min,用 G-25 凝膠柱除鹽，收集活化后ALP，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0053]3、將上述活化的抗人IgE抗體與活化的ALP混合，4 °C條件下靜置20h，用Supperdex200凝膠純化柱純化偶聯(lián)物，獲得連接物濃溶液，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0054]4、將連接物濃溶液用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)、pH8.0的0.lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到I y g/ml，完成酶標(biāo)試劑的制備。
[0055]實(shí)施例2:檢測的實(shí)施和檢測效果的評價:
[0056](一)檢測的實(shí)施
[0057]材料與儀器:
[0058]1、磁分離試劑和酶標(biāo)試劑，由實(shí)施例1制備。
[0059]2、IgE校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、發(fā)光底物、清洗液、特異性IgE測定試劑盒(熒光法)由法瑪西亞公司生產(chǎn)。
[0060]檢測實(shí)施:
[0061]下述檢測步驟由全自動化學(xué)發(fā)光分析儀自動完成，也可手工操作完成。
[0062]1、在檢測管中加入50 μ I待測樣本(血清或血漿)原液，然后加入50 μ I磁分離試劑，混勻，37 ± I °C條件下溫育30min ；
[0063]2、使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入500 μ I的清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸。重復(fù)此操作，共操作3次。
[0064]3、加入IOOul酶標(biāo)試劑；混勻，37± 1°C條件下溫育IOmin ；
[0065]4、使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入500 μ I的清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸。重復(fù)此操作，共操作3次。
[0066]5、將磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入150 μ I的發(fā)光底物，去除磁場，充分混懸后檢測5min內(nèi)相對發(fā)光強(qiáng)度值(RLU)。
[0067](二)檢測效果的評價
[0068]以下數(shù)據(jù)以F13為例:
[0069]1、靈敏度評價:
[0070]檢測“O”濃度樣本，重復(fù)檢測20次，計(jì)算相對發(fā)光強(qiáng)度(RLU)的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并計(jì)算M+2SD值，根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M+2SD值帶入上述方程中，求出對應(yīng)的濃度值，即為最低檢測限。本方法的靈敏度不大于0.01IU/mL
[0071]A點(diǎn)發(fā)光值,參見表I。
[0072]表I
[0073]
【權(quán)利要求】
1.一種吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，其特征在于:包括如下試劑: 磁分離試劑:標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒懸浮液，所述的標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒的濃度為0.1~1.0mg/ml ； 酶標(biāo)試劑:含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體溶液，所述的含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體的濃度為0.5"! μ g/mlo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，其特征在于:所述的吸入過敏原的純度大于90%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，其特征在于:所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為0.1~2μm，每克磁微粒表面的羧基含量不低于I毫摩爾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，其特征在于:所述的吸入過敏原與所述的磁微粒的摩爾比為0.02^0.16:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，其特征在于:所述的抗人IgE抗體與所述的堿性磷酸酶的摩爾比為1: f 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，其特征在于:所述的堿性磷酸酶的純度大于95%，比活性大于1000 U/mg，濃度大于5mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，其特征在于:所述的抗人IgE抗體的純度大于95%,濃度大于I mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于: 磁分離試劑的制備方法為:將所述的磁微粒用0.04、.06mol/L、pH4.5^5的2-嗎啉乙磺酸緩沖液重懸；然后加入所述的吸入過敏原，在15~4(TC下混懸30-60分鐘；然后再加入新鮮配置的8~12mg/ml的碳二亞胺水溶液，在15~40°C下混懸2~12h，其中所述的2-嗎啉乙磺酸緩沖液與所述的碳二亞胺水溶液的體積比為10-20:1 ;磁分離，去上清，用含質(zhì)量比為4.5~5.5%的牛血清白蛋白、pH為8~9.5、物質(zhì)的量濃度為0.01~0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液重懸到所述的標(biāo)記有吸入過敏原的磁微粒的濃度為0.1~1.0mg/ml,即得所述的磁分離試劑； 酶標(biāo)試劑的制備方法為:將抗人IgE抗體加入到濃度為8~12mg/ml的2-亞胺基硫烷鹽酸鹽偶聯(lián)劑中，在15~40°C下靜置18~25分鐘，加入0.09~0.llmol/L的甘氨酸溶液，在15~40°C下靜置4飛分鐘，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后抗人IgE抗體，2~8°C保存?zhèn)溆?；將堿性磷酸酶溶液加入到r5mg/ml的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷_1_羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中，在15lO°C下靜置25~35分鐘，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，2l°C保存?zhèn)溆?；將活化后的抗人IgE抗體和活化后的堿性磷酸酶混合，在疒8°C下靜置12~24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化，獲得連接物濃溶液，在2~8°C保存?zhèn)溆?；將所述的連接物濃溶液用含質(zhì)量比為0.4^0.6%的牛血清白蛋白、pH為7.8~8.0、物質(zhì)的量濃度為0.09、.llmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋到含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體的濃度為0.5^1 μ g/ml,即得所述的酶標(biāo)試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的吸入過敏原的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:包括依次進(jìn)行的以下步驟: 步驟1:在檢測管中加入待測樣本原液，然后加入所述的磁分離試劑，混勻，在36~38°C下溫育25~35分鐘，其中所述的待測樣本原液與所述的磁分離試劑的體積比為1:0.9^1.1 ；步驟2:添加磁場，使步驟I溫育后的體系在磁場中沉降，去除上清液，經(jīng)清洗液多次清洗后，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸； 步驟3:向步驟2處理后的體系中加入所述的酶標(biāo)試劑，混勻，在36~38°C下溫育8~12分鐘； 步驟4:添加磁場，使步驟3溫育后的磁微粒在磁場中沉降，去除上清液，經(jīng)清洗液多次清洗后，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸； 步驟5:添加磁場，使步驟4處理后的磁微粒在磁場中沉降，去除上清液，然后加入發(fā)光底物，去 除磁場，充分混懸后檢測5min內(nèi)相對發(fā)光強(qiáng)度值。
【文檔編號】G01N33/53GK103901188SQ201410142725
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】李慶春, 孫嬋, 丁俊榮, 宋孟杰, 李永紅, 左云國 申請人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司