熒光觀察方法和熒光觀察設(shè)備的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種熒光觀察方法，其中可在不需要多種激發(fā)波長的情況下并且利用簡單光學(xué)結(jié)構(gòu)同時觀察從多種熒光分子發(fā)射的多種熒光，熒光分子用作其熒光標(biāo)簽的被觀察對象幾乎不受損傷，并且可使用通常用作用于熒光觀察的光學(xué)材料的玻璃，并且提供了一種熒光觀察設(shè)備。根據(jù)本發(fā)明的用于檢測從兩種或更多種熒光分子發(fā)射的多種熒光的熒光觀察方法包括以下步驟：利用可見區(qū)中的具有等于或小于700nm的激發(fā)激發(fā)波長的光使兩種或更多種熒光分子的每種經(jīng)受多光子激發(fā)，以在利用兩種或更多種熒光分子的每種的深紫外區(qū)中的吸收波長帶時產(chǎn)生熒光；以及同時檢測在激發(fā)光的激發(fā)波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。
【專利說明】熒光觀察方法和熒光觀察設(shè)備

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及觀察從像例如多種熒光蛋白質(zhì)這樣的熒光分子發(fā)射的熒光的熒光觀察方法，并且涉及熒光觀察設(shè)備。

【背景技術(shù)】
[0002]利用熒光分子觀察生物分子是在醫(yī)學(xué)或生命科學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)觀察方法。已開發(fā)了熒光波長不同的各種熒光分子，并且可以利用這些熒光分子彼此結(jié)合地觀察多種生物分子。
[0003]在觀察由熒光分子發(fā)射的熒光的常規(guī)方法中，例如，存在:一種方法，其中利用可見區(qū)中的光通過單光子激發(fā)來激發(fā)熒光分子并且檢測激發(fā)光的波長的較長波長側(cè)產(chǎn)生的熒光(斯托克司頻移)；以及一種方法，其中利用近紅外區(qū)中的光通過多光子激發(fā)來激發(fā)熒光分子并且檢測在激發(fā)光的波長的較短波長側(cè)產(chǎn)生的熒光(參照例如非專利文獻(xiàn)I)。
[0004]在要觀察多種熒光分子的情況下，這些熒光觀察方法需要將要根據(jù)每種熒光分子的吸收光譜來選擇激發(fā)光的最佳波長，因此具有以下問題:
[0005](問題I)在要同時觀察多種熒光分子的情況下，為了利用波長彼此不同的多種激發(fā)光同時照射試樣，需要用于多種激發(fā)光混合在同一路徑中的的光學(xué)系統(tǒng)，以至于光學(xué)構(gòu)造復(fù)雜；
[0006](問題2)當(dāng)使用波長彼此不同的多種激發(fā)光來進(jìn)行熒光觀察時，將被收集在試樣表面上的多種激發(fā)光由于當(dāng)它們通過位于它們的路徑上的光學(xué)系統(tǒng)時發(fā)生的色差而導(dǎo)致它們的焦點位置隨著它們的波長變化，以至于破壞了空間重合性。結(jié)果，這個問題可導(dǎo)致在多種生物分子之間的交疊或生物分子的定位的分析中的偽像；以及
[0007](問題3)雖然在順序地改變波長不同的多種激發(fā)光時針對每種熒光分子逐個執(zhí)行熒光觀察，但該過程不允許同時觀察從各個熒光分子發(fā)射的熒光。具體地說，在觀察諸如活細(xì)胞這樣的活試樣中在需要同時觀察多種生物分子的運動的情況下產(chǎn)生不方便。
[0008]另一方面，在作為能夠解決上述問題I和問題2的現(xiàn)有技術(shù)文章的以下非專利文獻(xiàn)2中公開了利用深紫外區(qū)中的光通過單光子激發(fā)激發(fā)熒光蛋白質(zhì)的方法。非專利文獻(xiàn)2公開了熒光分子(蛋白質(zhì))具有在深紫外區(qū)中的吸收波長帶，并且盡管這些熒光分子彼此不同，但是這些熒光分子仍在深紫外區(qū)中具有公共吸收波長帶。
[0009]結(jié)果，如果用深紫外區(qū)中的光通過單光子激發(fā)來激發(fā)熒光分子并且檢測激發(fā)光的波長的較長波長側(cè)產(chǎn)生的熒光(斯托克司頻移)，則能夠同時觀察到多種熒光。
[0010]然而，在其中用深紫外區(qū)中的光通過單光子激發(fā)來激發(fā)熒光分子并且檢測激發(fā)光的波長的較長波長側(cè)產(chǎn)生的熒光(斯托克司頻移)的情況下，具有以下問題:
[0011](問題4)為了將深紫外區(qū)中的光收集和引導(dǎo)到熒光分子上，則幾乎沒有可用的光學(xué)構(gòu)件，并且在光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)造中存在許多限制條件，因此，難以制造滿足期望規(guī)格的光學(xué)系統(tǒng)。通常用作諸如光學(xué)窗和透鏡這樣的光學(xué)構(gòu)件的玻璃在紫外線波長范圍內(nèi)顯著地吸收系數(shù)增大并且透射率急劇地減小。結(jié)果，這種方法需要使用了諸如石英玻璃、氟化鈣和氟化鎂的特殊材料的特殊光學(xué)系統(tǒng)；以及
[0012](問題5)與可見光或紅外光相比，深紫外區(qū)中的光具有較大的光能量，對活體造成大的光損傷。結(jié)果，在其中待觀察的對象是像活細(xì)胞這樣的活試樣的情況下，深紫外區(qū)中的光不適于用作用于觀察從試樣上標(biāo)記有的熒光分子發(fā)射的熒光的激發(fā)光。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)列表
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)I
[0016]Science-1990, vol.248, Winfried Denk et al.，iiTwo-Photon LaserScanning Fluorescence Microscopy”，Science, New Series,Vol.248，N0.4951 (April6，1990)，pp.73-76
[0017]非專利文獻(xiàn)2
[0018]B1chemistry.2004Nov 30，43，14913-14923，Turoverov et al.，“Comparativestudies on the structure and stability of fluorescent proteinsEGFP，zFP506，mRFPl，“dimer2”and DsRedl”


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]技術(shù)問題
[0020]鑒于這些傳統(tǒng)問題提出本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供熒光觀察方法和熒光觀察設(shè)備，其可在省去了多種激發(fā)波長的情況下利用簡單的光學(xué)構(gòu)造同時觀察從多種熒光分子發(fā)射的多種熒光，并且對使用熒光分子作為其熒光標(biāo)簽的被觀察對象幾乎不造成損傷，并且允許利用普通玻璃作為用于熒光觀察的光學(xué)材料。
[0021]技術(shù)方案
[0022]為了實現(xiàn)以上目的，根據(jù)本發(fā)明的一種用于檢測從至少兩種或更多種熒光分子發(fā)射的多種熒光的熒光觀察方法，其特征在于該熒光觀察方法包括以下步驟:通過激發(fā)可見區(qū)中的具有等于或小于700nm的激發(fā)波長的光使兩種或更多種熒光分子的每種經(jīng)受多光子激發(fā)，以在利用兩種或更多種熒光分子的每種的深紫外區(qū)中的吸收波長帶時產(chǎn)生熒光；以及同時檢測在激發(fā)光的激發(fā)波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。
[0023]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，用于熒光檢測對象的兩種或更多種熒光分子的每種具有在深紫外區(qū)和可見區(qū)中的吸收波長帶。
[0024]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，激發(fā)光是超短脈沖激光束。
[0025]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，經(jīng)由短通濾波器僅檢測在激發(fā)波長的較短波長側(cè)產(chǎn)生的突光。
[0026]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，檢測在激發(fā)波長的短波長側(cè)產(chǎn)生的具有400nm或更長的波長的熒光。
[0027]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，以光譜選擇方式來檢測經(jīng)由多光子激發(fā)產(chǎn)生的多種熒光。
[0028]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，通過共焦檢測來檢測經(jīng)由多光子激發(fā)而產(chǎn)生的多種熒光。
[0029]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，同時檢測經(jīng)由多光子激發(fā)而產(chǎn)生的源于一個光子的熒光和源于兩個光子的熒光。
[0030]另外，一種根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備，其特征在于該熒光觀察設(shè)備包括:光源，其以高密度發(fā)射具有預(yù)定波長的光；二次諧波產(chǎn)生元件，其使用來自該光源的光產(chǎn)生可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的二次諧波；以及顯微鏡，其被構(gòu)造成利用由該二次諧波產(chǎn)生元件產(chǎn)生的光使多種熒光分子經(jīng)受多光子激發(fā)，使得同時可觀察在激發(fā)光的波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。
[0031]另外，一種根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備，其特征在于該熒光觀察設(shè)備包括:激發(fā)光產(chǎn)生單元，其一體地設(shè)置有光源，其以高密度發(fā)射具有預(yù)定波長的光，以及二次諧波產(chǎn)生元件，其利用來自光源的光產(chǎn)生可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的二次諧波，以及顯微鏡，其被構(gòu)造成利用由激發(fā)光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的光使多種熒光分子經(jīng)受多光子激發(fā)，使得同時可觀察在激發(fā)光的波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。
[0032]另外，在本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備中，優(yōu)選的是，二次諧波產(chǎn)生元件被構(gòu)造成可插入源自光源的光路上并可從所述光路上移除。
[0033]本發(fā)明的有益效果
[0034]根據(jù)本發(fā)明，可獲得熒光觀察方法和熒光觀察設(shè)備，其可在省去了多種激發(fā)波長的情況下利用簡單光學(xué)構(gòu)造同時觀察從多種熒光分子發(fā)射的多種熒，并且對使用熒光分子作為熒光標(biāo)簽的被觀察對象幾乎不造成損傷，并且允許利用普通玻璃作為用于熒光觀察的光學(xué)材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是概念性地示出在現(xiàn)有技術(shù)中分別利用可見區(qū)中的光通過單光子激發(fā)、利用近紅外區(qū)中的光通過雙光子激發(fā)和利用深紫外區(qū)中的光通過單光子激發(fā)而由熒光分子產(chǎn)生的熒光光譜的曲線圖。
[0036]圖2是示出多種熒光蛋白質(zhì)的吸收光譜的曲線圖。
[0037]圖3是示出圖2所示的熒光蛋白質(zhì)的激發(fā)光譜的曲線圖。
[0038]圖4是概念性地示出根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法在利用可見區(qū)中的光的多光子激發(fā)中由一個熒光分子產(chǎn)生的熒光光譜的曲線圖。
[0039]圖5是分別示出以下情況中的能態(tài)的說明圖:在現(xiàn)有技術(shù)中，利用可見區(qū)中的光的單光子激發(fā)和利用深紫外區(qū)中的光的單光子激發(fā)；以及根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法的利用可見區(qū)中的光的多光子激發(fā)。
[0040]圖6是示出在其中單獨使用不同的熒光分子的情況下在雙光子激發(fā)中激發(fā)光強度與獲得的熒光強度之間的關(guān)系的示圖；圖6八是在其中熒光蛋白質(zhì)Sirius用作熒光分子的情況下的曲線圖，圖6B是在其中熒光蛋白質(zhì)mseCFP用作熒光分子的情況下的曲線圖，圖6C是在其中熒光蛋白質(zhì)mTFPl用作熒光分子的情況下的曲線圖，并且圖6D是在其中熒光蛋白質(zhì)EGFP用作熒光分子的情況下的曲線圖。
[0041]圖7是示意性地示出具體化根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備的一種模式的構(gòu)造的框圖；圖7A是示出它們的一個示例的圖，圖7B是示出圖7A所示的示例的變形形式的一個示例的圖，并且圖7C是示出圖7A所示的示例的變形形式的另一示例的圖。
[0042]圖8是示意性地示出用于根據(jù)本發(fā)明的實施方式I的熒光觀察方法的熒光觀察設(shè)備的整體結(jié)構(gòu)的說明圖。
[0043]圖9是示出利用熒光觀察設(shè)備按照實施方式I的熒光觀察方法的激發(fā)波長的范圍、由熒光蛋白質(zhì)的每個發(fā)射的熒光波長的范圍以及各個檢測器檢測到的熒光波長的范圍之間的關(guān)系的曲線圖。
[0044]圖10是示出其中利用實施方式I的熒光觀察方法表達(dá)四種熒光蛋白質(zhì)的HeLa細(xì)胞的熒光圖像的照片；圖1OA是利用熒光蛋白質(zhì)Sirius的熒光圖像的照片，圖1OB是利用熒光蛋白質(zhì)mseCFP的熒光圖像的照片，圖1OC是利用熒光蛋白質(zhì)mTFPl的熒光圖像的照片，并且圖1OD是利用熒光蛋白質(zhì)EGFP的熒光圖像的照片。
[0045]圖11是通過以下步驟獲得的圖像:處理在其中利用實施方式I的熒光觀察方法表達(dá)四種熒光蛋白質(zhì)的HeLa細(xì)胞的熒光圖像中、利用熒光波長分離(UNMIXING)方法等由檢測器的每一個檢測到的熒光信號；去除除了主要由檢測器的每一個檢測到的熒光以外的熒光成分的滲透；以及隨后將經(jīng)處理的熒光圖像疊加:圖1lA是在X-Y平面上的細(xì)胞的熒光圖像；并且圖1lB是在X-Z平面上的細(xì)胞的熒光圖像。
[0046]圖12是示出熒光染料ATT0488的熒光強度與激發(fā)光強度之間的關(guān)系的曲線圖。
[0047]圖13是示出在利用ATT0488染色的HeLa細(xì)胞中，利用520nm的脈沖光激發(fā)的細(xì)胞色素c的熒光圖像的照片。

【具體實施方式】
[0048]在說明本發(fā)明的實施方式之前，先解釋本發(fā)明的操作效果。
[0049]根據(jù)本發(fā)明的用于檢測從至少兩種或更多種熒光分子發(fā)射的多種熒光的熒光觀察方法包括:通過激發(fā)可見區(qū)中的具有等于或小于700nm的激發(fā)波長的光使兩種或更多種熒光分子的每種經(jīng)受多光子激發(fā)，以在使用兩種或更多種熒光分子的每種在深紫外區(qū)中的吸收波長帶時產(chǎn)生熒光；以及同時檢測在激發(fā)光的激發(fā)波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。
[0050]現(xiàn)在解釋實現(xiàn)本發(fā)明的熒光觀察方法的經(jīng)過。
[0051]圖1是概念性地示出在現(xiàn)有技術(shù)中分別利用可見區(qū)中的光通過單光子激發(fā)、利用近紅外區(qū)中的光通過雙光子激發(fā)和利用深紫外區(qū)中的光通過單光子激發(fā)而由熒光分子產(chǎn)生的熒光光譜的曲線圖。圖2是示出多種熒光蛋白質(zhì)的吸收光譜的曲線圖。圖3是示出圖2所示的熒光蛋白質(zhì)的激發(fā)光譜的曲線圖。圖4是概念性地示出根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法在利用可見區(qū)中的光的多光子激發(fā)中由一個熒光分子產(chǎn)生的熒光光譜的曲線圖。圖5是分別示出以下情況中的能態(tài)的說明圖:在現(xiàn)有技術(shù)中，利用可見區(qū)中的光的單光子激發(fā)和利用深紫外區(qū)中的光的單光子激發(fā)；以及根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法的利用可見區(qū)中的光的多光子激發(fā)。圖6是示出在其中單獨使用不同的熒光分子的情況下在雙光子激發(fā)中激發(fā)光強度與獲得的熒光強度之間的關(guān)系的示圖；圖6A是在其中熒光蛋白質(zhì)Sirius用作熒光分子的情況下的曲線圖，圖6B是在其中熒光蛋白質(zhì)mseCFP用作熒光分子的情況下的曲線圖，圖6C是在其中熒光蛋白質(zhì)mTFPl用作熒光分子的情況下的曲線圖，并且圖6D是在其中熒光蛋白質(zhì)EGFP用作熒光分子的情況下的曲線圖。
[0052]如圖1所示，當(dāng)利用可見區(qū)中的光通過單光子激發(fā)來對熒光分子進(jìn)行激發(fā)時，產(chǎn)生具有比激發(fā)光的波長長的波長的熒光。另外，當(dāng)利用近紅外區(qū)中的光通過雙光子激發(fā)來對熒光分子進(jìn)行激發(fā)時，產(chǎn)生具有比激發(fā)光的波長短的波長的熒光。另外，當(dāng)利用深紫外區(qū)中的光通過單光子激發(fā)來對熒光分子進(jìn)行激發(fā)時，產(chǎn)生具有比激發(fā)光的波長長的波長的熒光。
[0053]另外，如圖2所示，熒光蛋白質(zhì)在可見區(qū)和深紫外區(qū)中具有吸收波長帶。將可見區(qū)中的吸收波長帶用作用于利用可見區(qū)中的光的單光子激發(fā)中和利用近紅外區(qū)中的光的雙光子激發(fā)對熒光蛋白質(zhì)進(jìn)行激發(fā)的吸收波長帶，通常執(zhí)行這些激發(fā)。
[0054]另外，如圖2所示，許多熒光分子在深紫外區(qū)中具有公共吸收波長帶。
[0055]通過描繪由熒光蛋白質(zhì)的每種發(fā)射的熒光強度的測量結(jié)果獲得圖3所示的激發(fā)光譜，測量是在激發(fā)波長變化的同時執(zhí)行的。可利用這些激發(fā)光譜將在對應(yīng)的激發(fā)波長的激發(fā)效率互相比較?？梢岳斫獾氖牵ㄟ^圖3所述的曲線圖，也可在深紫外區(qū)中獲得與在可見區(qū)中的激發(fā)效率相當(dāng)?shù)募ぐl(fā)效率。
[0056]現(xiàn)在，已知當(dāng)作為具有預(yù)定波長的激發(fā)光的光子吸收到熒光分子內(nèi)的結(jié)果，電子從基態(tài)能級躍遷至激發(fā)態(tài)能級；以及隨后電子經(jīng)由熱振動弛豫而躍遷至基態(tài)能級時產(chǎn)生熒光。另外，用于產(chǎn)生熒光的方法可根據(jù)激發(fā)處理中的不同被大致分為“單光子吸收熒光”和“雙光子(多光子)吸收熒光”。在單光子吸收熒光中，熒光分子吸收激發(fā)光的一個光子，從而熒光分子中的電子躍遷至激發(fā)態(tài)能級。另一方面，在雙光子吸收熒光中，熒光分子同時吸收激發(fā)光的兩個光子，從而熒光分子中的電子躍遷至激發(fā)態(tài)能級。另外，在單光子吸收熒光中，必須將具有與熒光分子中的基態(tài)能級與激發(fā)態(tài)能級之間的能量差大致相同的能量(波長)的光用作激發(fā)光。另一方面，在雙光子吸收熒光中，可以將能量(波長)小于該能量差的光用作激發(fā)光。通常，在相同種類的熒光分子被激發(fā)的情況下，用于雙光子吸收熒光的激發(fā)光的波長比用于單光子吸收熒光的激發(fā)光的波長長。另外，已知通過雙光子吸收的處理產(chǎn)生的熒光強度與激發(fā)光的強度的平方成比例(平方特性)。
[0057]因此，如圖4所示，本發(fā)明的發(fā)明人提出利用通過深紫外區(qū)中的熒光分子吸收的多光子吸收處理產(chǎn)生熒光的構(gòu)思和利用可見區(qū)中的光作為激發(fā)光的構(gòu)思。熒光蛋白質(zhì)的吸收特性的特征在于它們在深紫外區(qū)中的激發(fā)效率良好。在其中通過利用具有比吸收波長長的波長的光作為激發(fā)光(例如，通過利用可見區(qū)中的具有525nm的波長的光子)通過雙光子激發(fā)來激發(fā)熒光蛋白質(zhì)的情況下，熒光蛋白質(zhì)基于通過深紫外區(qū)中的這些熒光蛋白質(zhì)的每個的吸收有效地產(chǎn)生雙光子吸收熒光(圖5)。另外，如上所述，通過雙光子吸收產(chǎn)生的熒光強度與激發(fā)光的強度的平方成比例。
[0058]因此，在利用可見區(qū)中的光作為激發(fā)光的同時，使用雙光子吸收熒光可獲得與利用深紫外區(qū)中的光的激發(fā)產(chǎn)生的熒光(單光子吸收熒光)相當(dāng)?shù)臒晒狻?br> [0059]為了展示通過利用可見區(qū)中的光通過多光子激發(fā)來激發(fā)熒光分子可產(chǎn)生熒光，本發(fā)明的發(fā)明人嘗試了利用具有可見波長的光對多種熒光蛋白質(zhì)的雙光子激發(fā)。
[0060]圖6是示出在其中單獨使用不同的熒光分子的情況下在雙光子激發(fā)中激發(fā)光強度與獲得的熒光強度(用對數(shù)畫出各個強度)之間的關(guān)系的示圖；圖6八是在其中熒光蛋白質(zhì)Sirius用作熒光分子的情況下的曲線圖，圖6B是在其中熒光蛋白質(zhì)mseCFP用作熒光分子的情況下的曲線圖，圖6C是在其中熒光蛋白質(zhì)mTFPl用作熒光分子的情況下的曲線圖，并且圖6D是在其中熒光蛋白質(zhì)EGFP用作熒光分子的情況下的曲線圖。激發(fā)光的波長為525nm。
[0061]如圖6A、圖6B、圖6C和圖6D中的曲線圖的每個所示，無論哪種熒光蛋白質(zhì)用作熒光分子，熒光強度都與激發(fā)光的強度的平方成比例(各個對數(shù)圖的逼近直線的斜度為約2)。這示出了檢測到的熒光是通過雙光子激發(fā)產(chǎn)生的。
[0062]本發(fā)明的發(fā)明人通過這種考慮和這種展示想出了一種用于檢測從至少兩種或更多種熒光分子發(fā)射的多種熒光的熒光觀察方法，該熒光觀察方法包括:通過激發(fā)可見區(qū)中的具有等于或小于700nm的激發(fā)波長的光使兩種或更多種熒光分子的每種經(jīng)受多光子激發(fā)，以在利用兩種或更多種熒光分子的每種的深紫外區(qū)中的吸收波長帶時產(chǎn)生熒光；以及同時檢測在激發(fā)光的激發(fā)波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種突光。
[0063]如在本發(fā)明的熒光觀察方法中，在檢測從至少兩種或更多種熒光分子發(fā)射的熒光的過程中，利用可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的光作為用于熒光分子的多光子激發(fā)的激發(fā)光可省去多種激發(fā)波長。結(jié)果，可省去對于使用波長彼此不同的多種激發(fā)光必要的、用于將激發(fā)光混合到同一路徑的光學(xué)系統(tǒng)等，以避免光學(xué)系統(tǒng)的復(fù)雜構(gòu)造。另外，如上所述，雖然由于將被收集在試樣表面上的多種激發(fā)光的焦點位置由于色差而隨著波長變化而導(dǎo)致波長彼此不同的多種激發(fā)光應(yīng)用于熒光觀察將破壞空間重合性，但是本發(fā)明的熒光觀察方法可省去使用多種激發(fā)光，因此不需要考慮試樣表面上的色差。另外，本發(fā)明的熒光觀察方法不需要針對執(zhí)行熒光觀察，波長不同的多種激發(fā)光針對各個熒光分子進(jìn)行交替，因此有利于同時觀察多種生物分子的運動。
[0064]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中用作激發(fā)光的可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的光的光子能量小于深紫外區(qū)中的光的光子能量。另外，在本發(fā)明的方法中利用了多光子激發(fā)，從而深紫外區(qū)中的光不被通過除包括焦點的區(qū)域以外的熒光分子的區(qū)域的熒光分子吸收。結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法可降低對標(biāo)記有熒光分子的試樣的光損傷。
[0065]另外，在根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法中可見區(qū)中的光用作激發(fā)光，從而通常使用的玻璃等可用作用于光學(xué)系統(tǒng)的光學(xué)材料。
[0066]多光子吸收的發(fā)生可能性與光子密度的平方成比例(平方特性)。因此，多光子激發(fā)用于本發(fā)明的熒光觀察方法中，從而其中熒光分子被激發(fā)的部分的體積可減小為顯著地小于在激發(fā)光的焦點位置的部分的體積。可利用比根據(jù)單光子激發(fā)中的激發(fā)光的波長確定的分辨率高的分辨率來檢測熒光。結(jié)果，正像近紅外區(qū)的多光子激發(fā)可獲得可見區(qū)的單光子激發(fā)的分辨率，根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法可通過可見區(qū)的多光子激發(fā)獲得與深紫外區(qū)的單光子激發(fā)獲得的分辨率相當(dāng)?shù)姆直媛省?br> [0067]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中可見區(qū)中的光用作激發(fā)光，從而可通過僅利用透射或反射可見區(qū)中的光的構(gòu)件并涂覆來制造光學(xué)系統(tǒng)。結(jié)果，光的透射率和反射率可增大，從而可提高光學(xué)系統(tǒng)的性能。
[0068]此外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，用于熒光檢測對象的熒光分子的每個是在深紫外區(qū)和在可見區(qū)中具有吸收波長帶的熒光分子。因此，當(dāng)通過多光子激發(fā)激發(fā)具有吸收光譜與激發(fā)光交疊的特性的熒光分子時，可分別出現(xiàn)源于多光子激發(fā)和單光子激發(fā)的熒光成分。
[0069]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，超短脈沖激光束用作激發(fā)光。這種方式可在焦點處在空間和時間上增大光子密度，從而可有效地執(zhí)行雙光子激發(fā)。
[0070]另外，可通過諸如帶通濾波器和邊緣濾器的波長選擇裝置使超短脈沖激光束的光譜形狀成形。這種方式容易將熒光和激發(fā)光彼此分離，另外，可較有效地檢測熒光發(fā)射。例如，可通過利用彼此結(jié)合的邊緣濾器切掉寬光譜寬度的超短脈沖激光束的光譜以具有矩形形狀。這種方式可加寬可用于檢測熒光發(fā)射的波長帶。通過切掉其譜形并使所述譜形成形為矩形來加寬超短脈沖激光的時域形狀，從而可較有效地檢測熒光發(fā)射，盡管雙光子激發(fā)的效率在一定程度上降低。
[0071]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，經(jīng)由短通濾波器僅檢測到在激發(fā)光的激發(fā)波長的較短波長側(cè)產(chǎn)生的熒光。
[0072]在其中通過可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的光通過多光子激發(fā)激發(fā)具有吸收光譜與激發(fā)光重疊的特性的熒光分子的情況下，分別出現(xiàn)源于雙光子激發(fā)和開-光子激發(fā)的熒光成分，如上所述。已知由單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光的波長通常比激發(fā)光的波長長(斯托克司頻移)。因此，在利用本發(fā)明的熒光觀察方法通過多光子激發(fā)來激發(fā)熒光分子的情況下，激發(fā)光的激發(fā)波長的較長波長側(cè)還含有由單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光成分。然而，如果按照光譜選擇方式利用短通濾波器等去除波長比激發(fā)光的波長長的由單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光成分并且僅檢測到波長比激發(fā)光的波長短的熒光成分，則可有效地檢測通過雙光子激發(fā)產(chǎn)生的突光。
[0073]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，檢測到在激發(fā)光的激發(fā)波長的較短波長側(cè)產(chǎn)生的波長為400nm或更長的熒光。
[0074]這種方式可將源于像DNA或構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的活自發(fā)熒光物質(zhì)的自發(fā)熒光與源于熒光分子的熒光分離，從而可執(zhí)行高對比度熒光成像。
[0075]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，按照光譜選擇方式檢測由多光子激發(fā)產(chǎn)生的多種突光。
[0076]為了按照光譜選擇方式檢測熒光，例如，可彼此結(jié)合地使用多通道檢測器、多個光電倍增管和分色鏡，或者，可彼此結(jié)合地使用多焦點機構(gòu)和像CCD、CMOS等的成像傳感器。
[0077]此外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，同時產(chǎn)生波長不同的多種熒光。因此，在其中多種熒光的波長帶彼此交疊的情況下，在由檢測器檢測僅通過特定熒光分子產(chǎn)生的熒光信號時必然也可通過檢測器檢測到通過除特定熒光分子外的熒光分子產(chǎn)生的熒光(熒光串?dāng)_)。在這種情況下，優(yōu)選地:通過熒光-波長分離(UNMIXING)方法等處理由檢測器檢測到的熒光信號；然后去除源于除特定熒光分子外的熒光分子的熒光成分。
[0078]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，優(yōu)選的是，通過共焦檢測來檢測經(jīng)由多光子激發(fā)產(chǎn)生的多種突光。
[0079]更具體地說，可將針孔、狹縫等布置在檢測熒光的檢測器前方以通過共焦檢測來檢測熒光。
[0080]這種構(gòu)造可去除由單光子激發(fā)產(chǎn)生和在其檢測平面以外發(fā)生的熒光。
[0081]另外，還提高了光學(xué)切片效果(獲得諸如僅切除輪廓線上的一部分的圖像的效果)。
[0082]另外，在本發(fā)明的熒光觀察方法中，可同時檢測經(jīng)由多光子激發(fā)產(chǎn)生的源于一個光子的熒光和源于兩個光子的熒光。這種方式可增加可通過激發(fā)而同時檢測到的熒光的種類數(shù)量。
[0083]另外，根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備包括:光源，其以高密度發(fā)射具有預(yù)定波長的光；二次諧波產(chǎn)生元件，其使用來自該光源的光產(chǎn)生可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的二次諧波；以及顯微鏡，其被構(gòu)造成利用由二次諧波產(chǎn)生元件產(chǎn)生的光對多種熒光分子進(jìn)行激發(fā)，使得同時可觀察熒光分子在激發(fā)光的波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。
[0084]圖7是示意性地示出根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備的一個實施方式的構(gòu)造的框圖，圖7A是示出它們的一個示例的圖，圖7B是示出圖7A所示的示例的變形形式的一個示例的圖，并且圖7C是示出圖7A所示的示例的變形形式的另一示例的圖。
[0085]圖7A所示的示例的熒光觀察設(shè)備包括光源單元、二次諧波產(chǎn)生單元和用于試樣觀察的單元。
[0086]例如，光源單元由以高密度發(fā)射具有預(yù)定波長的激光脈沖光束的光源構(gòu)成，光源為鎖模激光器、可變波長激光器、OPO (光參量振蕩器)器等。
[0087]二次諧波產(chǎn)生單元包括像LBO (LiB305:三硼酸鋰)晶體或BBO (硼酸鋇)晶體的SGH(二次諧波產(chǎn)生)晶體，并且二次諧波產(chǎn)生單元由利用來自光源單元的光產(chǎn)生可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的二次諧波的元件構(gòu)成。
[0088]用于試樣觀察的單元由顯微鏡構(gòu)成，顯微鏡被構(gòu)造成利用由二次諧波產(chǎn)生單元產(chǎn)生的光使多種熒光分子經(jīng)受多光子激發(fā)，以使得同時可觀察熒光分子在激發(fā)光的波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種突光，顯微鏡為例如激光掃描顯微鏡、多光子熒光顯微鏡、共焦熒光顯微鏡等。
[0089]這種構(gòu)造可利用本發(fā)明的熒光觀察方法執(zhí)行熒光觀察。
[0090]此外，如圖7B所示，根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備可被構(gòu)造成包括:激發(fā)光產(chǎn)生單元，其一體地設(shè)置有光源單元和二次諧波產(chǎn)生元件；以及顯微鏡，其被構(gòu)造成通過激發(fā)光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的光使多種熒光分子經(jīng)受多光子激發(fā)，從而可同時觀察通過熒光分子在激發(fā)光的波長的較短波長側(cè)或較短波長側(cè)和較長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。按照這種方式形成的熒光觀察設(shè)備不需要用于連接光源單元和外部的二次諧波產(chǎn)生單元的光學(xué)系統(tǒng)，從而可簡化設(shè)備的結(jié)構(gòu)。
[0091]作為另外一種選擇，在本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備中，如圖7C所示，二次諧波產(chǎn)生元件可被構(gòu)造成可插入源自光源的光路中并可從該光路移除。
[0092]這種方式可利用一個內(nèi)窺鏡實現(xiàn)多種觀察方法。例如，與多光子內(nèi)窺鏡結(jié)合，可通過從光路中移除諧波產(chǎn)生單元，利用近紅外區(qū)中的雙光子激發(fā)執(zhí)行熒光觀察，以及可通過插入諧波產(chǎn)生單元以將諧波產(chǎn)生單元置于光路上，利用二次諧波利用可見區(qū)中的雙光子激發(fā)執(zhí)行熒光觀察。
[0093][實施方式]
[0094]以下利用附圖解釋本發(fā)明的實施方式。
[0095]實施方式I
[0096]圖8是示意性地示出用于根據(jù)本發(fā)明的實施方式I的熒光觀察方法的熒光觀察設(shè)備的整體結(jié)構(gòu)的說明圖。圖9是示出利用所述熒光觀察設(shè)備在實施方式I的熒光觀察方法中，激發(fā)波長的范圍、由熒光蛋白質(zhì)的每個發(fā)射的熒光波長的范圍以及通過各個檢測器檢測的熒光波長的范圍之間的關(guān)系的曲線圖。
[0097]如圖8所示，當(dāng)前實施方式中的熒光觀察設(shè)備設(shè)有光源單元U、二次諧波產(chǎn)生單元12和用于試樣觀察的單元13。
[0098]光源單元11由像鎖模激光、可變波長激光OPO等的超短脈沖激光構(gòu)成。
[0099]二次諧波產(chǎn)生單元12包括透鏡12a、像BBO晶體的SHG晶體12b和透鏡12c。SHG晶體12b利用從光源單元11發(fā)射的脈沖激光產(chǎn)生具有525nm(作為波長為可見區(qū)中的700nm或更短)的波長的二次諧波。
[0100]此外，當(dāng)前實施方式中的熒光觀察設(shè)備包括反射鏡14a和透鏡14b和14c，它們是用于連接二次諧波產(chǎn)生單元12和用于試樣觀察的單元13的光學(xué)構(gòu)件14。
[0101]用于試樣觀察的單元13由顯微鏡構(gòu)成，顯微鏡包括:分色鏡13al至13a4 ;帶通濾波器13bl至13b5 ;檢測器13cl至13c4 ;用于二維掃描的反射鏡13d ;透鏡13el至13e3 ；物鏡13f ;用于三維掃描的工作臺13g ;等等。并且，用于試樣觀察的單元形成為能夠利用多個檢測器13cl至13c4和分色鏡13al至13a4按照光譜選擇方式檢測多種熒光。此外，在附圖中，標(biāo)號13h指示針孔，標(biāo)號20指示像標(biāo)記有熒光分子的生物分子的試樣。
[0102]試樣20標(biāo)記有作為熒光分子的四種熒光蛋白質(zhì)(Sirius、mseCFP、mTFPl和EGFP)。
[0103]分色鏡13al具有透射由二次諧波產(chǎn)生單元12產(chǎn)生并且具有525nm的波長的光以及反射具有其它波長的光的光學(xué)特性。
[0104]帶通濾波器13bl具有阻擋通過試樣20標(biāo)記有的多種熒光分子產(chǎn)生的多種熒光波長中的波長比525nm的激發(fā)光波長長的光以及透射其它波長帶中的光的光學(xué)特性。
[0105]分色鏡13a2具有反射410nm至440nm的波長帶中的光以及透射其它波長帶中的光的光學(xué)特性。
[0106]帶通濾波器13b2具有透射410nm至440nm的波長帶中的光以及阻擋其它波長帶中的光的光學(xué)特性。
[0107]分色鏡13a3具有反射455nm至475nm的波長帶中的光以及透射其它波長帶中的光的光學(xué)特性。
[0108]帶通濾波器13b3具有透射455nm至475nm的波長帶中的光以及阻擋其它波長帶中的光的光學(xué)特性。
[0109]分色鏡13a4具有反射475nm至490nm的波長帶中的光以及透射其它波長帶中的光的光學(xué)特性。
[0110]帶通濾波器13b4具有透射475nm至490nm的波長帶中的光以及阻擋其它波長帶中的光的光學(xué)特性。
[0111]帶通濾波器13b5具有透射490nm至500nm的波長帶中的光以及阻擋其它波長帶中的光的光學(xué)特性。
[0112]檢測器13cl至13c4分別由光電倍增管(PMT)構(gòu)成。
[0113]此外，實施方式I中的熒光觀察設(shè)備形成為通過多個檢測器和分色鏡(以及另外，帶通濾波器)檢測按照光譜選擇方式通過各個熒光蛋白質(zhì)發(fā)射的熒光。然而，本發(fā)明的設(shè)備可按照這些部件由多通道檢測器替代的方式形成，以使得光譜作為塊中的光學(xué)光譜被檢測。
[0114]用于二維掃描的反射鏡13d由沿著二維方向執(zhí)行掃描的檢流計反射鏡構(gòu)成。
[0115]用于三維掃描的工作臺13g形成為能夠在試樣20布置在工作臺13g上的情況下沿著三維方向移動。
[0116]現(xiàn)在解釋利用具有這種結(jié)構(gòu)的實施方式I中的熒光觀察設(shè)備觀察從熒光分子發(fā)射的熒光的過程。
[0117]利用光源單元11提供的超短脈沖激光以高密度發(fā)射具有預(yù)定波長的脈沖激光束。接著，針對二次諧波產(chǎn)生單元12設(shè)置的SHG晶體12b利用通過光源單元11發(fā)射的光進(jìn)行振蕩以發(fā)射具有525nm的波長的光作為二次諧波。
[0118]通過光源單元11和二次諧波產(chǎn)生單元12以高密度發(fā)射并且具有525nm的波長的光經(jīng)光學(xué)構(gòu)件14進(jìn)入用于試樣觀察的單元13的分色鏡13al。
[0119]分色鏡13al透射具有525nm的波長并且入射在反射鏡13al上的光。通過分色鏡13al透射的光被用于二維掃描的反射鏡13反射，穿過透鏡13e2、透鏡13e3和物鏡13f，隨后被收集在試樣20中的預(yù)定焦點位置上。通過以高密度將具有525nm的波長的光輻射至試樣在試樣20中的預(yù)定焦點位置以各個預(yù)定的可能性通過多光子激發(fā)來激發(fā)試樣20標(biāo)記有的各個熒光分子。多光子吸收熒光的使用可產(chǎn)生這樣的熒光，其中波長比深紫外區(qū)中的波長長的光用作激發(fā)光，并且利用深紫外區(qū)中的各個熒光分子的吸收特性。此外，熒光分子的每一個具有帶有如下特征的吸收光譜的特性，所述特征即:吸收光譜位于深紫外區(qū)中以及可見區(qū)中；并且可見區(qū)中的吸收光譜的一部分與激發(fā)光的波長重疊。結(jié)果，波長比激發(fā)光的波長長的熒光還通過單光子激發(fā)經(jīng)各個熒光分子發(fā)射。因此，從熒光分子發(fā)射的熒光不僅包括源于雙光子激發(fā)的熒光而且包括源于單光子激發(fā)的熒光，并且源于單光子激發(fā)的熒光與源于雙光子激發(fā)的熒光混合。
[0120]通過多光子激發(fā)從試樣20標(biāo)記有的各個熒光分子發(fā)射的熒光經(jīng)過物鏡13f、透鏡13e3和13e2以及用于二維掃描的反射鏡13d，然后通過分色鏡13al而被反射。
[0121]被分色鏡13al反射的光進(jìn)入帶通濾波器13bl。帶通濾波器13bl阻擋波長比525nm的激發(fā)光波長長的光，以及透射其它波長帶中的光。結(jié)果，去除了由單光子激發(fā)產(chǎn)生的突光。
[0122]通過帶通濾波器13bl透射的光經(jīng)過透鏡13el和針孔13h，隨后進(jìn)入分色鏡13a2。分色鏡13a2反射410nm至440nm的波長帶中的光，以及透射其它波長帶中的光。被分色鏡13a2反射的光進(jìn)入帶通濾波器13b2。帶通濾波器13b2透射入射在帶通濾波器13b2上的光的410nm至440nm的波長帶中的光，以及阻擋其它波長帶中的光。檢測器13cl檢測到通過帶通濾波器13b2透射的410nm至440nm的波長帶中的光。結(jié)果，主要檢測到在深紫外區(qū)中通過熒光蛋白質(zhì)Sirius吸收由多光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光。
[0123]通過分色鏡13a2透射的光進(jìn)入分色鏡13a3。分色鏡13a3反射入射在分色鏡13a3上的光中的455nm至475nm的波長帶中的光，以及透射其它波長帶中的光。被分色鏡13a3反射的光進(jìn)入帶通濾波器13b3。帶通濾波器13b3透射入射在帶通濾波器13b3上的光中的455nm至475nm的波長帶中的光，并且阻擋其它波長帶中的光。檢測器13c2檢測到通過帶通濾波器13b3透射的455nm至475nm的波長帶中的光。結(jié)果，主要檢測到在深紫外區(qū)中通過熒光蛋白質(zhì)CFP吸收由多光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光。
[0124]通過分色鏡13a3透射的光進(jìn)入分色鏡13a4。分色鏡13a4反射入射在分色鏡13a4上的光中的475nm至490nm的波長帶中的光，以及透射其它波長帶中的光。被分色鏡13a4反射的光進(jìn)入帶通濾波器13b4。帶通濾波器13b4透射入射在帶通濾波器13b4上的光中的475nm至490nm的波長帶中的光，以及阻擋其它波長帶中的光。檢測器13c3檢測到通過帶通濾波器13b4透射的475nm至490nm的波長帶中的光。結(jié)果，主要檢測到在深紫外區(qū)中通過熒光蛋白質(zhì)mTFPl吸收由多光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光。
[0125]通過分色鏡13b4透射的光進(jìn)入帶通濾波器13b5。帶通濾波器13b5透射入射在帶通濾波器13b5上的光中的490nm至500nm的波長帶中的光，以及阻擋其它波長帶中的光。檢測器13c4檢測到通過帶通濾波器13b5透射的490nm至500nm的波長帶中的光。結(jié)果，主要檢測到在深紫外區(qū)中通過熒光蛋白質(zhì)GFP吸收由多光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光。
[0126]此外，通過附圖中未示出的已知的信號處理裝置或已知的成像裝置，通過檢測器的每個檢測到的熒光輸出并在附圖中未示出的顯示裝置上顯示為熒光圖像。
[0127]圖10是示出其中利用實施方式I的熒光觀察方法表達(dá)四種熒光蛋白質(zhì)的HeLa細(xì)胞的熒光圖像的照片，并且通過使分別通過檢測器13cl至13c4檢測到的熒光信號成像獲得分別在圖1OA至圖1OD中示出的熒光圖像。分別在以下細(xì)胞器中表達(dá)四種熒光蛋白質(zhì)。用于成像的激發(fā)光的波長為525nm。此外，圖中的刻度條的長度為5 μ m。
[0128]Sirius:線粒體
[0129]mseCFP:組蛋白 H2B
[0130]mTFPl:聞爾基氏體
[0131]EGFP:纖維蛋白
[0132]圖11是示出按照以下方式獲得的圖像的示圖，所述方式即，針對HeLa細(xì)胞的熒光圖像(其中利用實施方式I的熒光觀察方法表達(dá)四種熒光蛋白質(zhì))利用熒光波長分離(UNMIXING)方法處理通過檢測器13cl至13c4檢測到的熒光信號，以及隨后熒光圖像重疊:圖1lA是在X-Y平面上的細(xì)胞的熒光圖像；圖1lB是在X-Z平面上的細(xì)胞的熒光圖像。
[0133]此外，圖中的刻度條的長度為5 μ m。
[0134]此外，雖然在實施方式I中熒光蛋白質(zhì)用作熒光分子，但是本發(fā)明的熒光觀察方法也可應(yīng)用于除熒光蛋白質(zhì)以外的熒光分子(例如，由化學(xué)合成物質(zhì)構(gòu)成的熒光染料)。
[0135]圖12是示出熒光染料ATT0488的熒光強度與激發(fā)光強度之間的關(guān)系的曲線圖。利用具有560nm的波長和200毫微微秒的脈沖寬度的脈沖激光束的激發(fā)產(chǎn)生熒光。圖13是示出520nm的脈沖光激發(fā)的利用ATT0488染色的HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞色素c的熒光圖像的照片。圖13中的刻度條的長度為5 μ m。
[0136]如圖12所示，當(dāng)將具有560nm的波長和200毫微微秒的脈沖寬度的脈沖激光束輻射至ATT0488時，熒光強度與激發(fā)光強度的平方成比例。因此，也通過雙光子激發(fā)產(chǎn)生檢測到的從ATT0488發(fā)射的熒光，并且清楚的是根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法的可見波長區(qū)中的雙光子激發(fā)也可應(yīng)用于除熒光蛋白質(zhì)以外的化學(xué)合成物質(zhì)。
[0137]另外，已經(jīng)證實了本發(fā)明也可應(yīng)用于突光染料Mitotracker Green。
[0138]此外，二次諧波產(chǎn)生單元12可設(shè)有通過在超短脈沖束的群速中產(chǎn)生負(fù)色散來調(diào)整超短脈沖束的脈沖寬度的預(yù)啁啾器(chirper)(圖中省略了預(yù)啁啾器)。這樣可控制試樣表面上的脈沖寬度，并可在試樣表面上大致形成傅里葉極限脈沖。結(jié)果，雙光子激發(fā)的效率增大，并且產(chǎn)生的熒光的熒光強度變大。
[0139]另外，針孔13h布置在實施方式I中的光路上。然而，毋庸置疑，根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察設(shè)備可具有其中熒光觀察設(shè)備未設(shè)置針孔的結(jié)構(gòu)。
[0140]另外，雖然在實施方式I中透鏡13el和針孔13h設(shè)置在分色鏡13a2、13a3和13a4以及帶通濾波器13b5之前，但是所述透鏡13el和針孔13h對可布置在分色鏡13a2、13a3和13a4的每個以及帶通濾波器13b5之后。這種方式可根據(jù)入射在檢測器13cl至13c4的每個上的熒光的波長來優(yōu)化針孔13h的位置和直徑，并且可有效地檢測熒光。
[0141]另外，在同時存在由單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光和由雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光的情況下，可利用聲光系統(tǒng)等(圖中省略)通過單頻率調(diào)制激發(fā)光的強度，并且隨后可利用鎖相放大器等(圖中省略)以調(diào)制的頻率兩倍大的頻率解調(diào)通過檢測器13cl至13c4檢測到的熒光的強度，從而通過單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光成分和通過雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光成分彼此分離，并且僅提取通過雙光子激發(fā)的熒光成分。這種方式在其中利用濾器難以分裂熒光的情況下可提高分辨能力。
[0142]另外，例如，可利用邊緣濾器等(圖中省略)使激發(fā)光波長的波長寬度成形，以使得激發(fā)光波長的波長寬度變?yōu)?nm至10nm。這種方式可容易地將熒光和激發(fā)光彼此分離，另外，可更有效地檢測熒光發(fā)射。然而，該波長寬度不限于這些值，并且激發(fā)光的波長寬度可根據(jù)用于本發(fā)明的熒光觀察方法的熒光蛋白質(zhì)、激發(fā)光波長等改變?yōu)樽罴选?br> [0143]工業(yè)應(yīng)用
[0144]根據(jù)本發(fā)明的熒光觀察方法和熒光觀察方法可用于需要同時觀察分別從多種熒光分子發(fā)射的熒光的每個領(lǐng)域。
[0145]附圖標(biāo)記列表
[0146]10:熒光觀察設(shè)備
[0147]11:光源單元
[0148]12: 二次諧波產(chǎn)生單元
[0149]12a、12c、13el、13e2、13e3:透鏡
[0150]12b: SHG 晶體
[0151]13:用于試樣觀察的單元(顯微鏡)
[0152]13al、13a2、13a3、13a4:分色鏡
[0153]13bl、13b2、13b3、13b4、13b5:帶通濾波器
[0154]13cl、13c2、13c3、13c4:檢測器(PMT)
[0155]13d:用于二維掃描的反射鏡(檢流計反射鏡)
[0156]13f:物鏡
[0157]13g:用于三維掃描的工作臺
[0158]20:試樣
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測從兩種或更多種熒光分子發(fā)射的多種熒光的熒光檢測方法，其特征在于，該熒光觀察方法包括以下步驟: 通過可見區(qū)中的具有等于或小于700nm的激發(fā)波長的激發(fā)光對兩種或更多種熒光分子的每種進(jìn)行多光子激發(fā)，以利用所述兩種或更多種熒光分子的每種的深紫外區(qū)中的吸收波長帶產(chǎn)生熒光；以及 同時檢測在激發(fā)光的激發(fā)波長的短波長側(cè)、或短波長側(cè)和長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測方法，其特征在于，用于熒光檢測對象的所述兩種或更多種熒光分子的每種具有深紫外區(qū)和可見區(qū)中的吸收波長帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的熒光檢測方法，其特征在于，所述激發(fā)光是超短脈沖激光束。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項所述的熒光檢測方法，其特征在于，利用短通濾波器僅檢測在所述激發(fā)波長的短波長側(cè)產(chǎn)生的熒光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項所述的熒光檢測方法，其特征在于，檢測在所述激發(fā)波長的短波長側(cè)產(chǎn)生的具有400nm或更長的波長的熒光。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項所述的熒光檢測方法，其特征在于，以光譜選擇的方式檢測通過所述多光子激發(fā)產(chǎn)生的多種熒光。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6的任一項所述的熒光檢測方法，其特征在于，通過共焦檢測來檢測通過所述多光子激發(fā)產(chǎn)生的多種熒光。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項所述的熒光檢測方法，其特征在于，同時檢測通過所述多光子激發(fā)產(chǎn)生的源于一個光子的熒光和源于兩個光子的熒光。
9.一種突光觀察設(shè)備,其特征在于該突光觀察設(shè)備包括: 光源，其以高密度發(fā)射具有預(yù)定波長的光； 二次諧波產(chǎn)生元件，其使用來自所述光源的光產(chǎn)生可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的二次諧波；以及 顯微鏡，其被構(gòu)造成利用由所述二次諧波產(chǎn)生元件產(chǎn)生的光對多種熒光分子進(jìn)行多光子激發(fā)，使得能夠同時觀察到在所述激發(fā)光的波長的短波長側(cè)、或短波長側(cè)和長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種熒光。
10.一種突光觀察設(shè)備，其特征在于，該突光觀察設(shè)備包括: 激發(fā)光產(chǎn)生單元，其一體地設(shè)置有 光源，其以高密度發(fā)射具有預(yù)定波長的光，以及 二次諧波產(chǎn)生元件，其使用來自所述光源的光產(chǎn)生可見區(qū)中的具有700nm或更短的波長的二次諧波；以及 顯微鏡，其被構(gòu)造成利用由所述激發(fā)光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的光對多種熒光分子進(jìn)行多光子激發(fā)，使得能夠同時觀察到在所述激發(fā)光的波長的短波長側(cè)、或短波長側(cè)和長波長側(cè)二者上產(chǎn)生的多種突光。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的熒光觀察設(shè)備，其特征在于，所述二次諧波產(chǎn)生元件被構(gòu)造成可插入源自所述光源的光路上并可從所述光路上移除。
【文檔編號】G01N33/58GK104204779SQ201380016595
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月26日
【發(fā)明者】藤田克昌, 永井健治, 齊藤健太, 山中真仁, 瀧本真一 申請人:奧林巴斯株式會社