檢測結(jié)直腸癌及其惡性程度的免疫組化試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種結(jié)直腸癌及其惡性程度的免疫組化診斷試劑盒，該試劑盒包含：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色劑；其中一抗為人源抗S100A9單克隆抗體或鼠源抗S100A9單克隆抗體，二抗為生物素標記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。通過該試劑盒可以方便快捷地檢測樣本結(jié)直腸病理組織表面S100A9抗原的表達水平，從而可為快速診斷結(jié)直腸癌提供幫助，尤其對待測結(jié)直腸癌病理組織樣本的惡性程度評估提供幫助。
【專利說明】檢測結(jié)直腸癌及其惡性程度的免疫組化試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及結(jié)直腸腫瘤免疫診斷試劑盒，尤其涉及用于診斷結(jié)直腸腫瘤及判斷其惡性程度的免疫組化試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]SlOO蛋白是由小分子量蛋白(10-14 kDa)組成的鈣結(jié)合蛋白家族，因其在中性pH條件下能溶解于100%飽和度硫酸銨中而得名。研究發(fā)現(xiàn)，此類蛋白僅在脊柱動物中表達，目前已發(fā)現(xiàn)23種SlOO蛋白家族成員。S100A9蛋白是SlOO蛋白家族的重要成員，具有SlOO蛋白家族特征性的保守EF手型結(jié)構(gòu)和4-螺旋環(huán)形，與Ca2+、Zn2+及Cu2+等不同金屬離子結(jié)合發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，暴露與靶蛋白的結(jié)合位點進而通過與相應(yīng)的效應(yīng)靶蛋白相互作用參與系列反應(yīng)。其主要在粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞中高表達，通常與S100A8蛋白共表達形成異二聚體一S100A8/9鈣衛(wèi)蛋白，結(jié)合TLR4、RAGE、⑶36和細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子(EMMPRIN)等受體后激活NF-κ B、AP-1及其他轉(zhuǎn)錄因子，參與急慢性炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤生長、增殖及侵襲轉(zhuǎn)等系列生物學效應(yīng)。國內(nèi)外目前雖有研究表明S100A9與腫瘤相關(guān)，但對于S100A9與特定類型腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及其應(yīng)用于特定類型腫瘤的診斷與治療，尚缺少研究。
[0003]結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見的惡性腫瘤，據(jù)2008年國際癌癥機構(gòu)(IARC)研究統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)每年約有一百萬人發(fā)生結(jié)直腸癌，全球結(jié)直腸癌死亡率占腫瘤總死亡率8%，腫瘤致死率排名第四，且我國結(jié)直腸癌病死率高達45.5%,而結(jié)直腸腫瘤的惡性程度與腫瘤致死率密切相關(guān)。因此，尋找一種對結(jié)直腸癌進行診斷并對其惡性程度進行判斷的方法至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)直腸癌診斷及惡性程度判斷的S100A9免疫組化檢測試劑盒，通過該試劑盒可以方便快捷地檢測樣本結(jié)直腸病理組織表面S100A9抗原的表達水平，從而可以為結(jié)直腸癌診斷及其惡性程度的判斷提供幫助。
[0005]為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的診斷試劑盒包含:內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色劑；其中一抗為人源抗S100A9單克隆抗體或鼠源抗S100A9單克隆抗體，二抗為生物素標記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
[0006]本發(fā)明中，常規(guī)各種用于免疫組化試驗的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點阻斷劑、酶、顯色劑均可用于本發(fā)明試驗盒，但作為最佳選擇，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑為3wt% H2O2 ;非特異性結(jié)合位點阻斷劑為動物非免疫血清，其中優(yōu)選非免疫羊血清；酶優(yōu)選鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶；顯色劑優(yōu)選DAB顯色劑，包括:DAB緩沖液(20X)，DAB 底物(20X)，DAB 色原(20X)。
[0007]更進一步地，作為本發(fā)明試劑盒的優(yōu)化，還可以在試劑盒中設(shè)置用于參照的比對色卡，以方便對待測樣本的染色結(jié)果進行比對，或者設(shè)置對待測樣本切片中染色細胞百分數(shù)進行計算的計數(shù)器，以便于對樣本染色結(jié)果做快速分析。
[0008]發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn):S100A9在結(jié)直腸癌中的表達水平明顯高于正常結(jié)直腸組織，并且，S100A9蛋白的表達水平在不同分化程度結(jié)直腸癌組織中表達強度存在顯著差別，高、中、低分化結(jié)直腸癌組織中，S100A9蛋白表達的強陽性率呈明顯遞增趨勢，即分化程度越低，強陽性表達水平越高，分化程度越高，表達水平越低。因此，檢測受試者結(jié)直腸組織表面S100A9的表達水平，可以作為結(jié)直腸癌的惡性程度診斷的分子標志物。因此，發(fā)明人提供上述免疫組化試劑盒，利用該試劑盒，通過檢測結(jié)直腸病理組織表面S100A9抗原的表達，能快速準確地判斷結(jié)直腸癌惡性程度的臨床診斷提供幫助。試劑盒中設(shè)置比對色卡和染色細胞計數(shù)器，能方便對染色結(jié)果做快速準確地分析，提高試劑盒的易用性和方便性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1:NCBI GEO DataSets 系列 GSE37364 中探針 203535_at 所對應(yīng)的 S100A9 在 38例正常結(jié)直腸組織和27例結(jié)直腸癌組織的RNA表達結(jié)果圖。
[0010]圖2:免疫組化檢測正常結(jié)直腸組織及高、低分化結(jié)直腸癌組織中S100A9蛋白的表達結(jié)果圖A-E圖均為顯微鏡下放大200倍的組織結(jié)構(gòu)圖，其中:
A:正常結(jié)直腸組織陰性對照(未加S100A9 —抗)；
B:結(jié)直腸癌組織陰性對照(未加S100A9 —抗)；
C:正常結(jié)直腸組織；
D:高分化結(jié)直腸癌組織；
E:低分化結(jié)直腸癌組織。
[0011]圖3:S100A9蛋白在正常結(jié)直腸組織及癌組織中表達的IHC結(jié)果比較。
[0012]圖4:S100A9蛋白在不同分化程度的結(jié)直腸癌組織中表達的IHC結(jié)果比較。
【具體實施方式】
[0013]實施例1結(jié)直腸癌及其惡性程序診斷試劑盒的制備
發(fā)明人利用NCBI高通量基因表達數(shù)據(jù)庫GEO DataSets (gene expression omnibus),對系列GSE37364中27例結(jié)直腸癌組織和38例正常結(jié)直腸組織進行S100A9 RNA水平芯片數(shù)據(jù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A9在結(jié)直腸癌中的表達水平明顯高于正常結(jié)直腸組織，p〈0.0001，差異具有統(tǒng)計學意義，詳見附圖1。因此研究表明，S100A9參與了結(jié)直腸癌復雜的演進過程，可作為結(jié)直腸癌診斷的標志蛋白。
[0014]發(fā)明人進一步研究表明:S100A9蛋白的表達水平在高、低分化結(jié)直腸癌組織中的表達強度上存在顯著差別。高、低分化結(jié)直腸癌組織中S100A9蛋白的表達強陽性率呈明顯遞增趨勢，即結(jié)直腸癌組織分化程度越低，強陽性表達水平越高。這一結(jié)果進一步表明:S100A9可作為結(jié)直腸癌惡性程度判斷的分子標志物。
[0015]在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，發(fā)明人提供一種結(jié)直腸癌及其惡性程序診斷試劑盒，該試劑盒包含:內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色齊U ;其中一抗為人源抗S100A9單克隆抗體或鼠源抗S100A9單克隆抗體，二抗為生物素標記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
[0016]作為優(yōu)選，所述內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑為3wt% H2O2，非特異性結(jié)合位點阻斷劑選為動物非免疫血清，其中優(yōu)選非免疫羊血清；酶為鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶；顯色劑為DAB顯色劑，包括:DAB緩沖液(20 X )，DAB底物(20 X )，DAB色原(20 X )。
[0017]作為試劑盒更進一步地改進，在試劑盒中設(shè)置用于參照的比對色卡，分別為淡黃色、黃色和棕褐色。并設(shè)置一個掃描計數(shù)器，該計數(shù)器包括一個能對切片的顯微圖片進行拍照或掃描的單元，并包含一個對所掃描到的圖片進行細胞計數(shù)的分析單元。用該計數(shù)器，能對待所測樣本切片中染色細胞百分數(shù)進行自動計算，以便于對樣本染色結(jié)果做快速分析。
[0018]實施例2用制備的試劑盒對待測樣本進行檢測
(1)烤片脫蠟:待染色的組織切片放入60°C烤箱內(nèi)烘烤60-90分鐘，視切片質(zhì)量而定，后迅速放入二甲苯(1、II)中浸泡10分鐘X2次進行脫蠟；
(2)水化:切片按順序置于以下梯度酒精中:100%乙醇中浸泡5分鐘一90%乙醇中浸泡5分鐘一75%乙醇中浸泡5分鐘一50%乙醇中浸泡5分鐘一蒸餾水中浸泡3分鐘一PBS洗滌3分鐘X3次；
(3)抗原修復:0.01M pH6.0的檸檬酸抗原修復液在微波爐中煮沸，切片放入其中，乳膠手套封住容器口，繼續(xù)在沸水中加熱15-20分鐘，使溫度保持在100°C，完畢容器自然冷卻至室溫，不要將切片從修復液中取出，后再用IXPBS緩沖液搖床上漂洗3分鐘X3次；
(4)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:將切片置于孵育盒中，用蠟筆將組織圈起來，以免滴加后的試劑擴散，吸水紙將切片上的水稍吸去，不要碰到組織，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑溶液3%H2O2 100 μ I覆蓋組織后室溫孵育30分鐘，以清除內(nèi)源性過氧化物酶，然后用I XPBS緩沖液搖床上漂洗3分鐘 X 3次；
(5)非特異性結(jié)合位點血清封閉:吸水紙將切片上的水稍吸去，滴加100μ I動物非免疫羊血清，封閉30分鐘，輕輕甩去上清，不漂洗；
(6)—抗孵育:在孵育盒中，滴加1乂？85稀釋后的鼠源抗510(^9單克隆抗體溶液稀釋成1:500的濃度，每張切片約滴加100 μ I均勻覆蓋組織，41過夜(>12小時)，然后1父？83緩沖液搖床上3分鐘X 3次漂洗，陰性對照采用PBS代替一抗；
(7)二抗孵育:吸水紙將切片上的水稍吸去，滴加100 μ I生物素標記的羊抗鼠IgG，室溫15分鐘，I XPBS緩沖液搖床上3分鐘X 3次進行漂洗；
(8)吸水紙將切片上的水稍吸去,每張切片滴加100μ I鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育15分鐘，再用I XPBS緩沖液搖床上3分鐘X 3次進行漂洗；
(9)顯色及終止:吸水紙將切片上的水稍吸去，勿干片，滴加DAB顯色液，DAB緩沖液(20X)、DAB底物(20X )、DAB色原(20X)各50μ I滴加至850 μ I雙蒸水中配制成ImL新鮮顯示液，有效使用時間為30分鐘進行顯色，顯微鏡下控制顯色時間，染色均為50秒，完畢自來水中終止反應(yīng)；
(10)復染:吸水紙將切片上的水稍吸去，滴加蘇木素復染15秒，迅速用自來水沖洗終止反應(yīng)，自來水返藍10分鐘；
(11)脫水透明:晾干后依次入50wt%乙醇、75wt%乙醇、90 wt%乙醇、100 wt%乙醇各2分鐘快速脫水。再入二甲苯中2分鐘進行透明；
(12)封片:待切片自然晾干后,滴加中性樹膠及蓋玻片封片。
[0019]實施例3試劑盒的臨床驗證
用上述實施例1制備的試劑盒，依據(jù)實施例2的檢測步驟與方法，檢測了 54例正常和104例結(jié)直腸癌大體標本中S100A9蛋白的表達。所有組織標本在手術(shù)后經(jīng)中南大學湘雅二醫(yī)院病理科進行病理證實；104例結(jié)直腸腫瘤標本中14例為高分化癌，33例低分化癌。
[0020]依據(jù)蛋白在細胞內(nèi)的定位，分別以蛋白表達陽性信號強度和陽性表達細胞數(shù)兩種觀測標準進行綜合評分。判斷陽性表達結(jié)果標準:(1)參照比對色卡，根據(jù)陽性染色強度判斷:細胞無染色記O分；細胞染成淡黃色，記I分；黃色，記2分；棕褐色，記3分。(2)根據(jù)陽性細胞表達數(shù)記分:陽性細胞數(shù)< 5%，記O分；5%?25%，記I分；26%?50%，記2分;51%?75%，記3分，>75%，記4分。最終計分結(jié)果為上述兩種判斷標準得分相加。結(jié)果評估:0分為陰性表達(_);1、2分為弱陽性表達(+ );3?5分為中等陽性(+ );6、7分為強陽性表達(+ )。Fisher確切概率法分析組織中S100A9免疫組化的結(jié)果表明，S100A9蛋白在100% (104/104)的結(jié)直腸癌組織和58.62% (34/58)的正常結(jié)直腸組織中表達陽性，見附圖3和附圖2，即在結(jié)直腸癌組織中S100A9蛋白表達水平明顯高于正常結(jié)直腸組織(p=0.00)。Kruskal-Wallis H檢驗統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，S100A9蛋白的表達水平在高、低分化結(jié)直腸癌組織中的表達強度上有顯著差別，X M.72，P=0.03，差異有統(tǒng)計學意義。高、低分化癌強陽性率分別為28.57%和63.64%，呈明顯遞增趨勢，即分化程度越低，強陽性表達水平越高，見附圖4及附圖2。
[0021]上述臨床驗證的結(jié)果進一步表明:S100A9可以作為結(jié)直腸癌診斷和惡性程度判斷的分子標志物。運用本發(fā)明提供的試劑盒，檢測人體結(jié)直腸組織表面S100A9的表達水平，根據(jù)S100A9表達水平可以方便快捷地為結(jié)直腸癌診斷提供幫助，并對腫瘤的惡性程度判斷提供幫助。
[0022]應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述公開內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請的權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.檢測結(jié)直腸癌及其惡性程度的免疫組化試劑盒，包含:內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色劑，其特征在于:所述一抗為人源抗S100A9單克隆抗體或鼠源抗S100A9單克隆抗體，二抗為生物素標記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑為3wt%H2O2，非特異性結(jié)合位點阻斷劑為動物非免疫血清，酶為鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，顯色劑為DAB顯色劑，由DAB緩沖液、DAB底物、DAB色原組成。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述非特異性結(jié)合位點阻斷劑為非免疫羊血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述之一的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中設(shè)置用于染色參照的比對色卡，所述比對色卡有三張，分別為淡黃色、黃色和棕褐色。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述之一的試劑盒，其特征在于:試劑盒中設(shè)置對待測樣本切片中染色細胞百分數(shù)進行自動計算的計數(shù)器。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:試劑盒中設(shè)置對待測樣本切片中染色細胞百分數(shù)進行自動計算的計數(shù)器。
【文檔編號】G01N33/68GK103499694SQ201310478845
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】沈守榮, 馬健, 張學梅, 李夏雨, 李楠, 唐岸柳 申請人:中南大學