基于氯過氧化物酶法檢測亞硝酸鹽含量的方法
【專利摘要】一種基于氯過氧化物酶法檢測亞硝酸鹽含量的方法，利用NO2-的存在能夠提高氯過氧化物酶對吲哚的氧化活性，并在一定濃度范圍內(nèi)與氯過氧化物酶的氧化活性成線性關(guān)系這一特性，來定量檢測NO2-的濃度。本發(fā)明方法操作簡單，加標(biāo)回收率95%～115.8%，檢出限為0.0048mmol/L，線性范圍為0.005～0.055mmol/L，該方法準(zhǔn)確、可靠，精密度高，檢出限低，綠色環(huán)保，可檢測的樣品范圍廣泛，對食品安全評估具有一定意義。
【專利說明】基于氯過氧化物酶法檢測亞硝酸鹽含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于氯過氧化物酶與NO2-之間的相互作用來檢測食品中亞硝酸鹽含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]亞硝酸鹽對人體有極大危害，它可與人體血紅蛋白反應(yīng)，使之失去載氧功能，造成高鐵血紅蛋白癥；另一方面，亞硝酸鹽還可在胃腔中形成強(qiáng)致癌物亞硝胺，可誘發(fā)有機(jī)體突變，對神經(jīng)和腎臟有害，具有致畸性和致癌性。亞硝酸鹽進(jìn)入人體的途徑主要是通過飲食攝入，除了飲用水、蔬菜、潰酸菜、隔夜炒菜等飲食含有一定量的亞硝酸鹽之外，由于它具有抑制肉毒梭菌產(chǎn)生肉毒毒素的作用，賦予肉制品特有的顏色、風(fēng)味和質(zhì)地的作用，還被廣泛應(yīng)用于肉制品的生產(chǎn)過程中。
[0003]隨著近代分析化學(xué)的發(fā)展和新儀器的應(yīng)用，亞硝酸鹽的測定方法已經(jīng)相當(dāng)多樣和完善，選擇性和靈敏度都在不斷提高。其中氣相色譜-熱能分析法是檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，但熱能分析儀價(jià)格昂貴，應(yīng)用范圍窄，適應(yīng)性不強(qiáng)，一般實(shí)驗(yàn)室都沒有配備；同時(shí)待測定的樣品中目標(biāo)組分含量低，而其他的成分卻十分復(fù)雜，而且數(shù)量大，干擾作用較多。因此建立方便、易行、選擇性好的檢測方法非常必要。
[0004]氯過氧化物酶(CPO)是從海洋真菌Caldariomyces fumago中分離出來的一種血紅素過氧化物酶，其具有多種多樣的催化活性，因而被認(rèn)為是過氧化物酶家族中應(yīng)用最廣泛的酶。目前基于過氧化物酶的亞硝酸鹽檢測體系還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于氯過氧化物酶法檢測食品中亞硝酸鹽含量的方法，該方法操作簡單、選擇性好、適用范圍廣泛。
[0006]解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是由下述步驟組成:
[0007]1、測定氯過氧化物酶的氧化活性
[0008]將5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200 μ L2mmol/L的吲哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液、695 μ L pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液加入ImL比色皿中，用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Λ Al27(lnm。
[0009]2、測定NOf存在時(shí)氯過氧化物酶的相對氧化活性
[0010]將5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200 μ L2mmol/L的吲哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液加入ImL比色皿中，再加入lmmol/L的NaNO2水溶液和pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，保持混合液的總體積為lmL，混合液中NO2-離子的濃度為0.005?0.055mmol/L，用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Λ A2 2 70nm,按下述公式(I)計(jì)算氯過氧化物酶的相對氧化活性
[0011 ] 氯過氧化物酶的相對氧化活性=Δ Kl210J Δ Al270nm (I)
[0012]3、確定工作曲線及方程[0013]以N02_的濃度為橫坐標(biāo)，氯過氧化物酶的相對氧化活性為縱坐標(biāo)，由計(jì)算機(jī)繪制工作曲線，并得出工作曲線的線性回歸方程為y=l.0364+55.02x，式中y是氯過氧化物酶的相對氧化活性，X是N02_的濃度，相關(guān)系數(shù)為0.9975。
[0014]4、測定樣品中亞硝酸鹽含量
[0015]將5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200 μ L2mmol/L的吲哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液加入ImL比色皿中，再加入10?20 μ L樣品浸出液和pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，保持混合液的總體積為lmL，用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Δ M210rm,按公式(I)計(jì)算氯過氧化物酶的相對氧化活性，將此值代入線性回歸方程，計(jì)算樣品中亞硝酸鹽的含量。
[0016]本發(fā)明的檢測對象是生活中常見的腌辣椒、腌芥菜、榨菜和火腿腸，本發(fā)明所采用的的酶法檢測，操作簡單、選擇性好、適用范圍廣泛。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是實(shí)施例1繪制的工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不僅限于這些實(shí)施例。
[0019]實(shí)施例1
[0020]1、測定氯過氧化物酶的氧化活性
[0021]將5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200 μ L2mmol/L的吲哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液、695 μ L pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液加入ImL比色皿中，用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Λ Al27(lnm。
[0022]2、測定NOf存在時(shí)氯過氧化物酶的相對氧化活性
[0023]取7個(gè)ImL比色皿,每個(gè)比色皿中均加入5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200μ L2mmol/L的吲哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液，再分別加入5、10、20、30、40、50,55 μ Llmmol/L的NaNO2水溶液，然后用pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液補(bǔ)加至7個(gè)比色皿中混合液的總體積均為lmL，混合液中N02_離子的濃度為0.005,0.01,0.02,0.03、
0.04,0.05,0.055mmol/L，分別用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Λ A2 2 70nm,按下述公式(I)計(jì)算氯過氧化物酶的相對氧化活性
[0024]氯過氧化物酶的相對氧化活性=Δ Kl210J Δ Al270nm (I)
[0025]3、確定工作曲線及方程
[0026]以N02_的濃度為橫坐標(biāo)，氯過氧化物酶的相對氧化活性為縱坐標(biāo)，由計(jì)算機(jī)繪制工作曲線，如圖1所示，并得出工作曲線的線性回歸方程為y=l.0364+55.02x,式中y是氯過氧化物酶的相對氧化活性，X是N02_的濃度，相關(guān)系數(shù)為0.9975。
[0027]4、測定腌辣椒中亞硝酸鹽含量
[0028]將30g腌辣椒用紗布裹好、包扎之后置于200mL去離子水中，放置在搖床中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘，室溫震蕩24小時(shí)，使其中的亞硝酸鹽完全浸出，取出腌辣椒的浸出液。[0029]將5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200 μ L2mmol/L的吲哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液、20 μ L腌辣椒的浸出液和pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，保持混合液的總體積為lmL，用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Λ A227tol，按公式(I)計(jì)算氯過氧化物酶的相對氧化活性，將此值代入線性回歸方程，經(jīng)計(jì)算，腌辣椒中亞硝酸鹽(以NaNO2計(jì))的含量為0.532mg/kg。
[0030]實(shí)施例2
[0031]按照實(shí)施例1的方法測定腌芥菜中亞硝酸鹽的含量，經(jīng)計(jì)算腌芥菜中亞硝酸鹽(以NaNO2計(jì))的含量為8.280mg/kg。
[0032]實(shí)施例3
[0033]按照實(shí)施例1的方法測定榨菜中亞硝酸鹽的含量，經(jīng)計(jì)算榨菜中亞硝酸鹽(以NaNO2 計(jì))的含量為 17.000mg/kg。
[0034]實(shí)施例4
[0035]按照實(shí)施例1的方法測定火腿腸中亞硝酸鹽的含量，經(jīng)計(jì)算火腿腸中亞硝酸鹽(以 NaNO2 計(jì))的含量為 18.860mg/kg。
[0036]為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室研究實(shí)驗(yàn)，各種情況如下:
[0037]1、本發(fā)明方法的加標(biāo)回收率
[0038]取4個(gè)50mL的離心管，向其中加入30mLlmmol/L的NaNO2水溶液，再分別向4個(gè)離心管中依次加入5,11.25、17.5,23.75mL的4mmol/L的NaNO2水溶液，配制成濃度為1.429、
1.818,2.105,2.325mmol/L的待測樣品溶液。按照實(shí)施例1的方法測定各樣品溶液中N02_的含量。測定結(jié)果見表I。
[0039]表I利用本發(fā)明測定的加標(biāo)回收率
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種基于氯過氧化物酶法檢測亞硝酸鹽含量的方法，其特征在于由下述步驟組成: (1)測定氯過氧化物酶的氧化活性 將5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200 μ L2mmol/L的卩引哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液、695μ L pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液加入ImL比色皿中,用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Δ Al270rm ； (2)測定N02_存在時(shí)氯過氧化物酶的相對氧化活性 將5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200 μ L2mmol/L的卩引哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液加入ImL比色皿中，再加入lmmol/L的NaNO2水溶液和pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，保持混合液的總體積為lmL，混合液中N02_離子的濃度為0.005?0.055mmol/L，用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Δ M210rm,按下述公式(I)計(jì)算氯過氧化物酶的相對氧化活性 氯過氧化物酶的相對氧化活性=Δ Kl210J Δ Al270nm (I) (3)確定工作曲線及方程 以N02_的濃度為橫坐標(biāo)，氯過氧化物酶的相對氧化活性為縱坐標(biāo)，由計(jì)算機(jī)繪制工作曲線，并得出工作曲線的線性回歸方程為y=l.0364+55.02x，式中y是氯過氧化物酶的相對氧化活性，X是NO2-的濃度，相關(guān)系數(shù)為0.9975 ； (4)測定樣品中亞硝酸鹽含量 將5 μ L8 μ mol/L的氯過氧化物酶水溶液、200 μ L2mmol/L的卩引哚水溶液、100 μ L3mmol/L的雙氧水溶液加入ImL比色皿中，再加入10?20 μ L樣品浸出液和pH值為5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，保持混合液的總體積為lmL，用紫外可見分光光度計(jì)在波長270nm處測定30s內(nèi)其吸光度變化量，記為Λ A2270nm,按公式(I)計(jì)算氯過氧化物酶的相對氧化活性，將此值代入線性回歸方程，計(jì)算樣品中亞硝酸鹽的含量。
【文檔編號】G01N21/33GK103454237SQ201310442916
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】蔣育澄, 焦瑞娟, 高強(qiáng), 胡滿成, 李淑妮, 翟全國 申請人:陜西師范大學(xué)