全內(nèi)反射熒光顯微成像方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種基于高級次軸對稱偏振光束的全內(nèi)反射熒光顯微成像方法及裝置。所述裝置包括激光器，發(fā)出激光束；針孔濾波器，對激光器發(fā)出的激光束進行空間濾波；準直透鏡，將經(jīng)過空間濾波的激光束準直為平行光束；偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，對所述平行光束進行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得高級次軸對稱偏振光束；光瞳濾波器和環(huán)形光闌，對獲得的高級次軸對稱偏振光束進行振幅及相位調(diào)制；反射和聚焦系統(tǒng)，被調(diào)制的軸對稱偏振光束被反射和聚焦系統(tǒng)聚焦到玻璃與樣品之間的界面上，以在玻璃-樣品界面上因為全反射而產(chǎn)生倏逝場；反射和過濾系統(tǒng)，由倏逝場激發(fā)的熒光信號經(jīng)過反射和過濾系統(tǒng)后被聚焦到針孔陣列板上，光電探測器用于探測信號，以及信號分析處理系統(tǒng)。
【專利說明】全內(nèi)反射熒光顯微成像方法及裝置
【技術(shù)領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)，具體涉及一種基于高級次軸對稱偏振光束的全內(nèi)反射熒光顯微成像方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]全內(nèi)反射突光顯微技術(shù)(TotalInternal Reflection FluorescenceMicroscopy, TIRFM)是近年來新興的一種光學成像技術(shù)，它利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝場來照明樣品，從而致使在百納米級厚的光學薄層內(nèi)的熒光團受到激發(fā)，熒光成像的信噪比很高。這種方法的成像裝置簡單，極易和其它成像技術(shù)、探測技術(shù)相結(jié)合。目前已成功的實現(xiàn)了 IOOnm甚至更低的空間分辨率，被生物物理學家們廣泛應用于單分子的熒光成像中。
[0003]全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)的提出應該追溯到20世紀80年代中期。到目前，科學家們已發(fā)展了多種全內(nèi)反射熒光顯微成像系統(tǒng)，其中棱鏡型和物鏡型是最為普遍的兩種類型。棱鏡型系統(tǒng)在實現(xiàn)上更加容易，它只需要激光光源、棱鏡和顯微鏡。在探測上，它也不容易受到入射光信號的干擾，但是放置樣品的空間受到棱鏡的限制。物鏡型系統(tǒng)中樣品的放置則非常方便，并且在對樣品的控制上可與多種其它技術(shù)相結(jié)合，例如納米操縱、光鑷技術(shù)等，展現(xiàn)出更加誘人的生物應用前景。
[0004]作為一種光學顯微鏡，如何進一步提高成像的空間分辨率和時間分辨率依然是全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)的關鍵問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明將高級次軸對稱偏振光束引入到全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)中，通過靈活的調(diào)控入射光束的偏振及相位分布，可以靈活調(diào)控“熒光探針”的空間分布，從而實現(xiàn)高分辨率的顯微成像。
[0006]本發(fā)明提供一種基于高級次軸對稱偏振光束的全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，包括:激光器，發(fā)出激光束；針孔濾波器，對激光器發(fā)出的激光束進行空間濾波；準直透鏡，將經(jīng)過空間濾波的激光束準直為平行光束；偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，對所述平行光束進行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得軸對稱偏振分布；光瞳濾波器和環(huán)形光闌，對獲得的軸對稱偏振光束進行振幅及相位調(diào)制，其中環(huán)形光闌的作用是阻擋低于全反射臨界角的光束入射到聚焦物鏡中，使得只有超過臨界角的光束入射到玻璃-樣品界面上，從而極大抑制了由于透射光熒光激發(fā)導致的背景噪聲；反射和聚焦系統(tǒng)，被調(diào)制的軸對稱偏振光束被反射和聚焦系統(tǒng)聚焦到玻璃與樣品之間的界面上，以在玻璃-樣品界面上因為全反射而產(chǎn)生倏逝場，該倏逝場沿著玻璃界面?zhèn)鞑グl(fā)生干涉，沿著垂直方向強度以指數(shù)形式衰減，因此只對界面附近的樣品進行熒光激發(fā)，探測的厚度很薄，背景噪聲被極大抑制；反射和過濾系統(tǒng)，由倏逝場激發(fā)的熒光信號經(jīng)過反射和過濾系統(tǒng)后被聚焦到針孔陣列板上；光電探測器，布置于針孔陣列板后，以探測信號；信號分析處理系統(tǒng)，對信號進行分析處理。
[0007]可選的，所述偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)包括:棱鏡，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束；和一對透鏡，所述一對透鏡組成望遠鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏轉(zhuǎn)角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關，使?jié)M足偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小的光束入射進聚焦物鏡。
[0008]可選的，所述光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)包括:電控偏轉(zhuǎn)器，用于將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束；一對透鏡，所述一對透鏡組成望遠鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束。
[0009]可選的，所述高級次軸對稱偏振光束的偏振級次小于5，聚焦系統(tǒng)透鏡數(shù)值孔徑高于 0.95。
[0010]本發(fā)明提供一種基于高級次軸對稱偏振光束的全內(nèi)反射突光顯微成像方法，包括如下步驟:激光器發(fā)出激光束；針孔濾波器對激光器發(fā)出的激光束進行空間濾波；準直透鏡將經(jīng)過空間濾波的激光束準直為平行光束；偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)對所述平行光束進行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得軸對稱偏振分布；光瞳濾波器和環(huán)形光闌對獲得的軸對稱偏振光束進行振幅及相位調(diào)制，其中環(huán)形光闌用于阻擋低于全反射臨界角的光束入射到聚焦物鏡中，使得只有超過臨界角的光束入射到玻璃-樣品界面上，從而極大抑制了由于透射光熒光激發(fā)導致的背景噪聲；反射和聚焦系統(tǒng)，被調(diào)制的軸對稱偏振光束被反射和聚焦系統(tǒng)聚焦到玻璃與樣品之間的界面上，以在玻璃-樣品界面上因為全反射而產(chǎn)生倏逝場，該倏逝場沿著玻璃界面?zhèn)鞑グl(fā)生干涉，沿著垂直方向強度以指數(shù)形式衰減，因此只對界面附近的樣品進行熒光激發(fā)，探測的厚度很薄，背景噪聲被極大抑制；反射和過濾系統(tǒng)，由倏逝場激發(fā)的熒光信號經(jīng)過反射和過濾系統(tǒng)后被聚焦到針孔陣列板上；光電探測器，布置于針孔陣列板后，以探測信號；信號分析處理系統(tǒng)，對信號進行分析處理。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1 (a)是初始偏振方位角為-45°的柱矢量光束(P=I)，圖1 (b)是徑向偏振光，圖1 (C)是切向偏振光，圖1 (d)是P=2的柱矢量光束，圖1 (e)是P=3的柱矢量光束，圖1 (f)是P=4的柱矢量光束，其中箭頭表示對應位置線偏振的方位。
[0012]圖2(a)是基于軸對稱偏振光束的全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)結(jié)構(gòu)示意圖，圖2(b)是差動共焦檢測系統(tǒng)，圖2(c)是基于旋轉(zhuǎn)棱鏡的光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，以及圖2(d)是基于電控偏轉(zhuǎn)器的光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)。
[0013]圖3(a)和圖3(b)是生成高級次軸對稱偏振光束的兩種典型方法。
[0014]圖4 (a)-圖4 (b)是偏振級次為4的兩種高級次軸對稱偏振光束在玻璃_樣品界面附近的倏逝場強度分布，圖4(c)-圖4(d)是偏振級次為10的兩種高級次軸對稱偏振光束在玻璃-樣品界面附近的倏逝場強度分布。
[0015]圖5是針孔陣列板的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0016]在本發(fā)明中，通過采用具有空間偏振變化的軸對稱偏振光束，調(diào)控入射激光光束的振幅、相位及偏振分布，可調(diào)控倏逝場的分布，獲得更小的“熒光探針”，提高探測的空間分辨率，實現(xiàn)了三維超分辨聚焦。
[0017]軸對稱偏振光束是一類具有軸對稱偏振分布特性的矢量光束，對稱軸為光束的傳播軸。在光束橫截面上任意一點(中心點除外)都為線偏振，沿圓周方向的偏振方位變化滿足如下關系，
[0018]
【權(quán)利要求】
1.一種基于高級次軸對稱偏振光束的全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，包括: 激光器，發(fā)出激光束； 針孔濾波器，對激光器發(fā)出的激光束進行空間濾波； 準直透鏡，將經(jīng)過空間濾波的激光束準直為平行光束； 偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，對所述平行光束進行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得高級次軸對稱偏振光束； 光瞳濾波器和環(huán)形光闌，對獲得的高級次軸對稱偏振光束進行振幅及相位調(diào)制，其中環(huán)形光闌的作用是阻擋低于全反射臨界角的光束入射到聚焦物鏡中，使得只有超過臨界角的光束入射到玻璃-樣品界面上，從而極大抑制了由于透射光熒光激發(fā)導致的背景噪聲；反射和聚焦系統(tǒng)，被調(diào)制的軸對稱偏振光束被反射和聚焦系統(tǒng)聚焦到玻璃與樣品之間的界面上，以在玻璃-樣品界面上因為全反射而產(chǎn)生倏逝場，該倏逝場沿著玻璃界面?zhèn)鞑グl(fā)生干涉，沿著垂直方向強度以指數(shù)形式衰減，因此只對界面附近的樣品進行熒光激發(fā)，探測的厚度很薄，背景噪聲被極大抑制， 反射和過濾系統(tǒng)，由倏逝場激發(fā)的熒光信號經(jīng)過反射和過濾系統(tǒng)后被聚焦到針孔陣列板上， 光電探測器，布置于針孔陣列板后，以探測信號， 信號分析處理系統(tǒng)，對信號進行分析處理。
2.如權(quán)利要求1所述的全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，其中，所述偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)包括:棱鏡，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束；和一對透鏡，所述一對透鏡組成望遠鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏轉(zhuǎn)角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關，使?jié)M足偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小的光束入射進聚焦物鏡。
3.如權(quán)利要求1所述的全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，其中，所述光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)包括:電控偏轉(zhuǎn)器，用于將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束；一對透鏡，所述一對透鏡組成望遠鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束。
4.如權(quán)利要求1所述的全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，其中，高級次軸對稱偏振光束的偏振級次小于5，并且聚焦系統(tǒng)透鏡數(shù)值孔徑高于0.95。
5.一種基于高級次軸對稱偏振光束的全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，包括如下步驟: 激光器發(fā)出激光束； 針孔濾波器對激光器發(fā)出的激光束進行空間濾波； 準直透鏡將經(jīng)過空間濾波的激光束準直為平行光束； 偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)對所述平行光束進行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得高級次軸對稱偏振光束； 光瞳濾波器和環(huán)形光闌對獲得的高級次軸對稱偏振光束進行振幅及相位調(diào)制，其中環(huán)形光闌用于阻擋低于全反射臨界角的光束入射到聚焦物鏡中，使得只有超過臨界角的光束入射到玻璃-樣品界面上，從而極大抑制了由于透射光熒光激發(fā)導致的背景噪聲； 反射和聚焦系統(tǒng)，被調(diào)制的軸對稱偏振光束被反射和聚焦系統(tǒng)聚焦到玻璃與樣品之間的界面上，以在玻璃-樣品界面上因為全反射而產(chǎn)生倏逝場，該倏逝場沿著玻璃界面?zhèn)鞑グl(fā)生干涉，沿著垂直方向強度以指數(shù)形式衰減，只對界面附近的樣品進行熒光激發(fā)，探測的厚度很薄，背景噪聲被極大抑制； 反射和過濾系統(tǒng)，由倏逝場激發(fā)的熒光信號經(jīng)過反射和過濾系統(tǒng)后被聚焦到針孔陣列板上； 光電探測器，布置于針孔陣列板后，以探測信號； 信號分析處理系統(tǒng)，對信號進行分析處理。
6.如權(quán)利要求5所述的全內(nèi)反射突光顯微成像方法,其中,所述偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)包括:棱鏡，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束；和一對透鏡，所述一對透鏡組成望遠鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏轉(zhuǎn)角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關，使?jié)M足偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小的光束入射進聚焦物鏡中。
7.如權(quán)利要求5所述的全內(nèi)反射突光顯微成像方法,其中,所述光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)包括:電控偏轉(zhuǎn)器，用于將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束；一對透鏡，所述一對透鏡組成望遠鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束。
8.如權(quán)利要求5所述的全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，其中，高級次軸對稱偏振光束的偏振級次小于5，并且聚焦`系統(tǒng)透鏡數(shù)值孔徑高于0.95。
【文檔編號】G01N21/64GK103439305SQ201310381350
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】周哲海, 祝連慶, 婁小平, 王君, 張蔭民, 劉謙哲, 孟曉辰 申請人:北京信息科技大學