專利名稱：變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用電激發(fā)信號(hào)的條件閾值來(lái)衡量獨(dú)立閾值以下變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法，尤其涉及一種在基于微電極陣列的神經(jīng)信號(hào)激勵(lì)與探測(cè)系統(tǒng)下研究獨(dú)立閾值以下變濃度的藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法，屬于神經(jīng)科學(xué)與生物電子學(xué)的交叉領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)是人體內(nèi)起主導(dǎo)作用的功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對(duì)于神經(jīng)科學(xué)方面的研究一直是現(xiàn)代科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前關(guān)于藥物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用方面的研究主要是從分子、細(xì)胞、動(dòng)物三個(gè)水平進(jìn)行，其中細(xì)胞水平的研究由于具有快速、簡(jiǎn)便、易操作等特點(diǎn)受到研究者的廣泛關(guān)注。而藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞的放電活動(dòng)、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、膜受體、離子通道的改變等方面。1972年，Thomas等人引入了微電極陣列(MEA)的概念，自此科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了各種形式的微電極陣列，用來(lái)對(duì)包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細(xì)胞進(jìn)行電信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)。微電極陣列的出現(xiàn)，為神經(jīng)科學(xué)的研究提供了一種新的細(xì)胞外記錄方法。現(xiàn)在國(guó)際上眾多科學(xué)家都在應(yīng)用微電極陣列進(jìn)行藥理、毒理、藥物篩選方面的研究，如美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)研究小組應(yīng)用微電極陣列研究軟骨藻酸對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的自發(fā)放電活動(dòng)的影響；德國(guó)羅斯托克大學(xué)研究小組應(yīng)用微電極陣列研究免疫抑制劑環(huán)孢霉素A對(duì)大鼠腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電活動(dòng)的影響。但是，目前國(guó)際上應(yīng)用微電極陣列進(jìn)行的藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞放電活動(dòng)影響的研究主要集中在藥物單獨(dú)作用下對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自發(fā)放電活動(dòng)的影響，表現(xiàn)為峰電位幅值、峰電位頻率、爆發(fā)電位頻率、爆發(fā)電位持續(xù)時(shí)間等參數(shù)與藥物濃度之間的變化曲線，進(jìn)一步來(lái)確定待測(cè)藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞放電的影響(興奮作 用或抑制作用)。但是這些研究需要長(zhǎng)時(shí)程觀察藥物施加前后神經(jīng)細(xì)胞放電活動(dòng)的變化，并且研究的藥物濃度范圍只是閾值濃度以上范圍內(nèi)的，無(wú)法研究待測(cè)藥物在閾值以下濃度時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞放電的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種能夠快速確定神經(jīng)細(xì)胞放電性能的變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法。本發(fā)明所述方法采用以下技術(shù)方案:步驟I取帶有生物相容性玻璃套環(huán)(2)的微電極陣列芯片(I)；步驟2將體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞制備成每毫升10000 100000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，再將I 2ml的細(xì)胞懸液加入到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中，并使神經(jīng)細(xì)胞的部分胞壁結(jié)構(gòu)與微電極陣列(3)的微電極接觸，形成生物電接口 ；步驟3使用光學(xué)顯微鏡觀察微電極陣列芯片(I)的微電極陣列上的神經(jīng)細(xì)胞，并選定微電極陣列上有神經(jīng)細(xì)胞跨接的兩個(gè)電極分別作為激勵(lì)電極和探測(cè)電極，將微電極陣列芯片(I)放于微電極陣列MEA系統(tǒng)的支架(7)上，隨后用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中原有的培養(yǎng)液，取含有I μ g/ml濃度的藥物培養(yǎng)液Iml添加到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中；令11=1, η為當(dāng)前檢測(cè)次數(shù)，步驟4由微電極陣列MEA系統(tǒng)產(chǎn)生電壓幅值為ImV的激發(fā)脈沖信號(hào)并施加到激勵(lì)電極上，使用微電極陣列MEA系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)探測(cè)電極上電信號(hào)的變化，以ImV為增量由低到高逐漸改變激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值，直到微電極陣列MEA系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到探測(cè)電極上產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)，將產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)時(shí)的激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值作為當(dāng)前藥物濃度下神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的電激發(fā)信號(hào)條件閾值；隨后用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中的藥物培養(yǎng)液，并令η=η+1，步驟5將藥物加到培養(yǎng)液中，配制得到質(zhì)量濃度為I μ g/ml+ (η-1)*1 μ g/ml的藥物培養(yǎng)液，如果藥物培養(yǎng)液的濃度I μ g/ml+ (n-1) *1 μ g/ml小于藥物的獨(dú)立閾值，則取濃度為I μ g/ml+ (η-1)*1 μ g/ml的藥物培養(yǎng)液Iml添加到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中，返回步驟4，否則，檢測(cè)結(jié)束。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):I)本發(fā)明將電信號(hào)與藥物同時(shí)作為神經(jīng)細(xì)胞的激發(fā)因子，將電激發(fā)信號(hào)條件閾值作為一種尺度來(lái)衡量獨(dú)立閾值以下變濃度藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞放電性能的影響。相比于其他應(yīng)用微電極陣列研究藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞放電活動(dòng)作用的方法，本發(fā)明不必長(zhǎng)時(shí)間觀察并記錄神經(jīng)細(xì)胞的峰電位和爆發(fā)電位參數(shù)變化，根據(jù)獲得的電壓信號(hào)激發(fā)條件閾值與藥物濃度之間的變化曲線，可以快速確定獨(dú)立閾值以下各濃度的待測(cè)藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞放電的影響程度。2)本發(fā)明提供了一種研究獨(dú)立閾值以下變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有方法只能研究獨(dú)立閾值及以上濃度藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞放電性能影響的缺陷。通過(guò)獲得電壓信號(hào)激發(fā)條件閾值與藥物濃度之間的變化曲線，定量的研究獨(dú)立閾值以下的個(gè)濃度藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞放電性能的影響。3)本發(fā)明提供了一 種當(dāng)待測(cè)藥物的種類確定、其濃度-激發(fā)電壓條件閾值變化曲線已知而濃度未知時(shí)，利用測(cè)量得到的神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位激發(fā)電壓的條件閾值來(lái)確定培養(yǎng)液中待測(cè)藥物濃度的方法。


圖1是本發(fā)明中使用的電信號(hào)激勵(lì)脈沖信號(hào)波形圖。圖2是本發(fā)明中應(yīng)用微電極陣列芯片培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的示意圖。圖3是本發(fā)明應(yīng)用的神經(jīng)信號(hào)激勵(lì)與探測(cè)系統(tǒng)示意圖。圖4是本發(fā)明實(shí)施的流程圖。圖5是本發(fā)明實(shí)施例中PC12類神經(jīng)細(xì)胞的電信號(hào)激發(fā)條件閾值與乙酰膽堿濃度關(guān)系折線圖。圖6是本發(fā)明驗(yàn)證例中PC12類神經(jīng)細(xì)胞的平均峰電位發(fā)放數(shù)目與乙酰膽堿濃度關(guān)系折線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法，操作如下
步驟I取帶有生物相容性玻璃套環(huán)(2)的微電極陣列芯片(I);步驟2將體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞制備成每毫升10000 100000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，再將I 2ml的細(xì)胞懸液加入到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中，并使神經(jīng)細(xì)胞的部分胞壁結(jié)構(gòu)與微電極陣列(3)的微電極接觸，形成生物電接口 ；步驟3使用光學(xué)顯微鏡觀察微電極陣列芯片(I)的微電極陣列上的神經(jīng)細(xì)胞，并選定微電極陣列上有神經(jīng)細(xì)胞跨接的兩個(gè)電極分別作為激勵(lì)電極和探測(cè)電極，將微電極陣列芯片(I)放于微電極陣列MEA系統(tǒng)的支架(7)上，隨后用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中原有的培養(yǎng)液，取含有I μ g/ml濃度的藥物培養(yǎng)液Iml添加到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中；令η=1, η為當(dāng)前檢測(cè)次數(shù)，步驟4由微電極陣列MEA系統(tǒng)產(chǎn)生電壓幅值為ImV的激發(fā)脈沖信號(hào)并施加到激勵(lì)電極上，使用微電極陣列MEA系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)探測(cè)電極上電信號(hào)的變化，以ImV為增量由低到高逐漸改變激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值，直到微電極陣列MEA系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到探測(cè)電極上產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)，將產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)時(shí)的激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值作為當(dāng)前藥物濃度下神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的電激發(fā)信號(hào)條件閾值；隨后用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中的藥物培養(yǎng)液，并令η=η+1，步驟5將藥物加到培養(yǎng)液中，配制得到質(zhì)量濃度為I μ g/ml+ (η_1)*1 μ g/ml的藥物培養(yǎng)液，如果藥物培養(yǎng)液的濃度I μ g/ml+ (n-1) *1 μ g/ml小于藥物的獨(dú)立閾值，則取濃度為I μ g/ml+ (η-1)*1 μ g/ml的藥物培養(yǎng)液Iml添加到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中，返回步驟4，否則，檢測(cè)結(jié)束。本實(shí)施例中應(yīng)用的藥物為神經(jīng)遞質(zhì)、受體拮抗劑、受體激動(dòng)劑、離子通道阻斷劑、免疫抑制劑、酶抑制劑、抗過(guò)敏藥物、抗癲癇藥、麻醉藥、β -淀粉樣物質(zhì)、抗氧化物、酒精及有毒物質(zhì)中的一種，所述神經(jīng)遞質(zhì)為多巴胺DA、去甲腎上腺素NE、腎上腺素Ε、5-羥色胺、Y-氨基丁酸GABA、甘氨 酸、谷氨酸、組胺及乙酰膽堿中的一種；所述受體拮抗劑為荷包牡丹堿，DL-2-氨基-5-磷羧基戊酸ΑΡ5、環(huán)噻嗪、苦味毒及鹽酸美金剛胺中的一種；所述受體激動(dòng)劑天門冬氨酸NMDA、地佐環(huán)平ΜΚ-801、喹喔啉NBQX及SDF-1 α中的一種；所述離子通道阻斷劑為河豚毒素、釹蝎毒、4-氨基吡啶、利諾吡啶及普瑞巴林中的一種；所述免疫抑制劑為環(huán)孢霉素Α、環(huán)磷酰胺、甲氨喋呤及順鉬化合物中的一種；所述酶抑制劑為膽堿酯酶抑制劑和甲硫氨酸亞礬胺中的一種；所述抗過(guò)敏藥物為撲爾敏、苯海拉明、氯雷他定、西替利嗪、咪唑斯汀、地氯雷他定及左西替利嗪中的一種；所述抗癲癇藥為左乙拉西坦、加巴噴丁及奧卡西平中的一種；所述麻醉藥為嗎啡、利多卡因、大麻素、海洛因及阿片中的一種；所述抗氧化物為甲硫氨酸和左旋肉堿中的一種；所述有毒物質(zhì)為擬除蟲菊酯、避蚊胺、軟骨藻酸、蜘蛛毒素、三甲基氯化錫ΤΝΤ、甲基氯化汞、對(duì)硫磷、對(duì)氧磷及醋酸鋅中的一種。本實(shí)施例中藥物的獨(dú)立閾值的確定方法如下:步驟5.1取帶有生物相容性玻璃套環(huán)(2)的微電極陣列芯片(I)；步驟5.2取與上述步驟2中相同的神經(jīng)細(xì)胞，將體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞制備成每毫升10000 100000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，再將I 2ml的細(xì)胞懸液加入到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中，并使神經(jīng)細(xì)胞的部分胞壁結(jié)構(gòu)與微電極陣列(3)的微電極接觸，形成生物電接Π ；步驟5.3將微電極陣列芯片(I)放于微電極陣列MEA系統(tǒng)的支架(7)上，隨后用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中存在的培養(yǎng)液，取含有I μ g/ml濃度的藥物培養(yǎng)液Iml添加到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中；$m=l，m為當(dāng)前檢測(cè)次數(shù)，步驟5.4使用微電極陣列MEA系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所有探測(cè)電極上電信號(hào)的變化，檢測(cè)是否有標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位產(chǎn)生，若產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位，則把此時(shí)的藥物濃度作為該藥物的獨(dú)立閾值，停止檢測(cè)；若未產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位，則用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中的藥物培養(yǎng)液,并令m=m+l,繼續(xù)步驟5.5 ；步驟5.5將藥物加到培養(yǎng)液中，配制得到質(zhì)量濃度為I μ g/ml+ (m_l )*1 μ g/ml的藥物培養(yǎng)液，返回步驟5.4。實(shí)施例2PC12類神經(jīng)細(xì)胞是指小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子作用后向神經(jīng)細(xì)胞分化的類神經(jīng)細(xì)胞，具有交感神經(jīng)細(xì)胞的功能。本實(shí)施例介紹了一種變濃度乙酰膽堿作用下PC12類神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法。第一步，制備細(xì)胞懸液并接種到微電極陣列芯片上。使用膠頭滴管將培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的PC12類神經(jīng)細(xì)胞從瓶壁上吹下，使其懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞懸液取出放入50ml離心管內(nèi)，使用IOml移液槍將離心管內(nèi)的細(xì)胞懸液混勻，然后使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)上述細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，通過(guò)加入PC12類神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度調(diào)整為IX IO4個(gè)/ml，取I 2ml細(xì)胞懸液添加到由德國(guó)MCS公司購(gòu)買的微電極陣列芯片I的生物相容性玻璃套環(huán)2內(nèi)，微電極陣列芯片上事先已加入I 2ml PDL液包被12小時(shí)，使PC12類神經(jīng)細(xì)胞在微電極陣列芯片I上培養(yǎng)一段時(shí)間；第二步，獲得乙酰膽堿的獨(dú)立閾值。PC12類神經(jīng)細(xì)胞在芯片I上培養(yǎng)3天以后，在光學(xué)顯微鏡下觀察PC12類神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，將存在PC12類神經(jīng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并形成細(xì)胞間連接的微電極陣列芯片I放于微電極陣列系統(tǒng)的微電極陣列支架7上，事先將購(gòu)買的乙酰膽堿粉末溶解在 PC12類神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，按照I μ g/ml的濃度梯度配制成I μ g/ml 10 μ g/ml的10種乙酰膽堿培養(yǎng)液，選定乙酰膽堿的起始濃度為I μ g/ml，首先將生物相容性玻璃套環(huán)2內(nèi)原有的培養(yǎng)基小心吸出，并將濃度為I μ g/ml的乙酰膽堿培養(yǎng)液加入到微電極陣列芯片I的生物相容性玻璃套環(huán)2內(nèi)，同時(shí)通過(guò)微電極陣列系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微電極陣列芯片I上所有微電極探測(cè)到的PC12類神經(jīng)細(xì)胞的電信號(hào)，若PC12類神經(jīng)細(xì)胞未產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位，則按照I μ g/ml的濃度梯度增加乙酰膽堿的濃度，直至PC12類神經(jīng)細(xì)胞初次產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位為止，將使PC12類神經(jīng)細(xì)胞初次產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位的乙酰膽堿濃度作為乙酰膽堿的獨(dú)立閾值；第三步，獲得PC12類神經(jīng)細(xì)胞在獨(dú)立閾值以下變濃度乙酰膽堿作用下的電信號(hào)激發(fā)條件閾值，在光學(xué)顯微鏡下觀察已在芯片I上培養(yǎng)3天的PC12類神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并形成細(xì)胞間連接的微電極陣列芯片1，如圖2所示，選擇在兩個(gè)電極之間有神經(jīng)細(xì)胞跨接的電極分別作為激勵(lì)電極4和探測(cè)電極6，然后將微電極陣列芯片I放于微電極陣列系統(tǒng)的微電極陣列支架7上,按照第二步方法事先配制I μ g/ml 8μ g/ml的8種乙酰膽堿培養(yǎng)液，通過(guò)第二步已得到乙酰膽堿的獨(dú)立閾值為8 μ g/ml，選定乙酰膽堿的起始濃度為I μ g/ml，首先將生物相容性玻璃套環(huán)2內(nèi)原有的培養(yǎng)基小心吸出，并將濃度為I μ g/ml的乙酰膽堿培養(yǎng)液加入到微電極陣列芯片I的生物相容性玻璃套環(huán)2內(nèi)，通過(guò)微電極陣列MEA系統(tǒng)支架7上的刺激信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生如圖1所示的電荷平衡雙向非對(duì)稱激發(fā)電壓脈沖，其中電信號(hào)激發(fā)電壓幅值可調(diào)，在生物相容性玻璃套環(huán)2中加入乙酰膽堿培養(yǎng)液的同時(shí)，由微電極陣列MEA系統(tǒng)產(chǎn)生電壓幅值為ImV的激發(fā)脈沖信號(hào)并施加到激勵(lì)電極4上，使用微電極陣列MEA系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)探測(cè)電極6上電信號(hào)的變化，以ImV為增量由低到高逐漸改變激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值，直到微電極陣列MEA系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到探測(cè)電極6上產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)，將產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)時(shí)的激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值作為I μ g/ml濃度乙酰膽堿作用下PC12類神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的電激發(fā)信號(hào)條件閾值；隨后按照I μ g/ml的濃度梯度依次增加乙酰膽堿的濃度直至8 μ g/ml獨(dú)立閾值，并按照上述I μ g/ml濃度下電激發(fā)信號(hào)條件閾值的獲得方法，得到2 μ g/ml 8 μ g/ml濃度乙酰膽堿作用下的電壓信號(hào)激發(fā)條件閾值。如表I所示，分別得到I μ g/ml 8μ g/ml濃度乙酰膽堿作用下，電壓信號(hào)激發(fā)PC12類神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的條件閾值；為了實(shí)驗(yàn)的完整性，在未將乙酰膽堿加入微電極陣列芯片之前，通過(guò)微電極陣列MEA系統(tǒng)支架7上的刺激信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生如圖1所示的電荷平衡雙向非對(duì)稱激發(fā)電壓脈沖，首先將電壓幅值為ImV的激發(fā)脈沖信號(hào)施加到激勵(lì)電極4上，使用微電極陣列MEA系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)探測(cè)電極6上電信號(hào)的變化，以ImV為 增量由低到高逐漸改變激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值，直到微電極陣列MEA系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到探測(cè)電極6上產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)，當(dāng)前的激發(fā)脈沖信號(hào)電壓幅值則為
Oμ g/ml乙酰膽堿作用下的電壓信號(hào)激發(fā)條件閾值，如表I所示。根據(jù)電信號(hào)激發(fā)條件閾值與乙酰膽堿濃度關(guān)系折線圖，如圖4所示，可以看出在乙酰膽堿濃度在I 2 μ g/mL時(shí)，PC12類神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生響應(yīng)的電信號(hào)激發(fā)幅值為33、30mV，與未加乙酰膽堿時(shí)的電信號(hào)激發(fā)幅值35mV比較接近，當(dāng)再加大乙酰膽堿的濃度時(shí)，PC12類神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生響應(yīng)所需的電信號(hào)激發(fā)幅值逐漸減小，并且濃度越大時(shí)，每增加一個(gè)單位的濃度，電信號(hào)激發(fā)幅值減少量逐漸減少，直到濃度為8 μ g/ml時(shí)，乙酰膽堿單獨(dú)作用也能產(chǎn)生動(dòng)作電位，此時(shí)為乙酰膽堿的獨(dú)立閾值。同時(shí)根據(jù)電信號(hào)激發(fā)條件閾值與乙酰膽堿濃度關(guān)系折線圖可以看出，乙酰膽堿對(duì)PC12類神經(jīng)細(xì)胞具有興奮性作用，并且這種興奮作用具有濃度依賴特性，當(dāng)加入乙酰膽堿的濃度逐漸增加之后，PC12神經(jīng)細(xì)胞受電信號(hào)激發(fā)產(chǎn)生動(dòng)作電位的激發(fā)幅值也逐漸降低，表明乙酰膽堿對(duì)PC12類神經(jīng)細(xì)胞的放電性能具有增強(qiáng)作用。本實(shí)施例中根據(jù)獨(dú)立閾值以下8種濃度乙酰膽堿作用下PC12類神經(jīng)細(xì)胞的電壓信號(hào)激發(fā)條件閾值，快速確定了乙酰膽堿作用下PC12類神經(jīng)細(xì)胞放電性能的變化。表I不同乙酰膽堿濃度下，電信號(hào)對(duì)PC12類神經(jīng)細(xì)胞的激發(fā)條件閾值
權(quán)利要求
1.一種變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法，其特征在于， 步驟I取帶有生物相容性玻璃套環(huán)(2)的微電極陣列芯片(I); 步驟2將體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞制備成每毫升10000 100000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，再將I 2ml的細(xì)胞懸液加入到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中，并使神經(jīng)細(xì)胞的部分胞壁結(jié)構(gòu)與微電極陣列(3)的微電極接觸，形成生物電接口 ； 步驟3使用光學(xué)顯微鏡觀察微電極陣列芯片(I)的微電極陣列上的神經(jīng)細(xì)胞，并選定微電極陣列上有神經(jīng)細(xì)胞跨接的兩個(gè)電極分別作為激勵(lì)電極和探測(cè)電極，將微電極陣列芯片(I)放于微電極陣列MEA系統(tǒng)的微電極陣列支架(7)上,隨后用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中原有的培養(yǎng)液，取含有I μ g/ml濃度的藥物培養(yǎng)液Iml添加到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中；令η=1, η為當(dāng)前檢測(cè)次數(shù)， 步驟4由微電極陣列MEA系統(tǒng)產(chǎn)生電壓幅值為ImV的激發(fā)脈沖信號(hào)并施加到激勵(lì)電極上，使用微電極陣列MEA系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)探測(cè)電極上電信號(hào)的變化，以ImV為增量由低到高逐漸改變激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值，直到微電極陣列MEA系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到探測(cè)電極上產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)，將產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)時(shí)的激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值作為當(dāng)前藥物濃度下神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的電激發(fā)信號(hào)條件閾值；隨后用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中的藥物培養(yǎng)液，并令η=η+1， 步驟5將藥物加到培養(yǎng)液中，配制得到質(zhì)量濃度為I μ g/ml+ (η-1)*1 μ g/ml的藥物培養(yǎng)液，如果藥物培養(yǎng)液的濃度I μ g/ml+ (n-1) *1 μ g/ml小于藥物的獨(dú)立閾值,則取濃度為I μ g/ml+ (n-1) *1 μ g/ml的藥物培養(yǎng)液Iml添加到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中，返回步驟4，否則，檢測(cè)結(jié)束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法，其特征在于 ，所述藥物為神經(jīng)遞質(zhì)、受體拮抗劑、受體激動(dòng)劑、離子通道阻斷劑、免疫抑制劑、酶抑制劑、抗過(guò)敏藥物、抗癲癇藥、麻醉藥、β_淀粉樣物質(zhì)、抗氧化物、酒精及有毒物質(zhì)中的一種，所述神經(jīng)遞質(zhì)為多巴胺DA、去甲腎上腺素NE、腎上腺素Ε、5-羥色胺、Y -氨基丁酸GABA、甘氨酸、谷氨酸、組胺及乙酰膽堿中的一種；所述受體拮抗劑為荷包牡丹堿，DL-2-氨基-5-磷羧基戊酸ΑΡ5、環(huán)噻嗪、苦味毒及鹽酸美金剛胺中的一種；所述受體激動(dòng)劑天門冬氨酸NMDA、地佐環(huán)平ΜΚ-801、喹喔啉NBQX及SDF-1 α中的一種；所述離子通道阻斷劑為河豚毒素、釹蝎毒、4-氨基吡啶、利諾吡啶及普瑞巴林中的一種；所述免疫抑制劑為環(huán)孢霉素Α、環(huán)磷酰胺、甲氨喋呤及順鉬化合物中的一種；所述酶抑制劑為膽堿酯酶抑制劑和甲硫氨酸亞礬胺中的一種；所述抗過(guò)敏藥物為撲爾敏、苯海拉明、氯雷他定、西替利嗪、咪唑斯汀、地氯雷他定及左西替利嗪中的一種；所述抗癲癇藥為左乙拉西坦、加巴噴丁及奧卡西平中的一種；所述麻醉藥為嗎啡、利多卡因、大麻素、海洛因及阿片中的一種；所述抗氧化物為甲硫氨酸和左旋肉堿中的一種；所述有毒物質(zhì)為擬除蟲菊酯、避蚊胺、軟骨藻酸、蜘蛛毒素、三甲基氯化錫ΤΝΤ、甲基氯化汞、對(duì)硫磷、對(duì)氧磷及醋酸鋅中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法，其特征在于，所述藥物的獨(dú)立閾值的確定方法如下: 步驟5.1取帶有生物相容性玻璃套環(huán)(2)的微電極陣列芯片(I)； 步驟5.2將體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞制備成每毫升10000 100000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，再將I 2ml的細(xì)胞懸液加入到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中，并使神經(jīng)細(xì)胞的部分胞壁結(jié)構(gòu)與微電極陣列(3)的微電極接觸，形成生物電接口 ； 步驟5.3將微電極陣列芯片(I)放于微電極陣列MEA系統(tǒng)的支架(7)上，隨后用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中存在的培養(yǎng)液，取含有I μ g/ml濃度的藥物培養(yǎng)液Iml添加到生物相容性玻璃套環(huán)(2)中；令111=1, m為當(dāng)前檢測(cè)次數(shù)， 步驟5.4使用微電極陣列MEA系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所有探測(cè)電極上電信號(hào)的變化，檢測(cè)是否有標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位產(chǎn)生，若產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位，則把此時(shí)的藥物濃度作為該藥物的獨(dú)立閾值，停止檢測(cè)；若未產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)動(dòng)作電位，則用移液槍吸出生物相容性玻璃套環(huán)(2)中的藥物培養(yǎng)液，并令m=m+l，繼續(xù)步驟5.5 ； 步驟5.5將藥物加到培養(yǎng)液中，配制得到質(zhì)量濃度為I μ g/ml+μ g/ml的藥物培養(yǎng)液，返回步驟5. 4。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種變濃度藥物作用下神經(jīng)細(xì)胞放電性能的檢測(cè)方法，其特征在于首先將體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液加入到微電極陣列芯片的生物相容性玻璃套環(huán)中，并使神經(jīng)細(xì)胞的部分胞壁結(jié)構(gòu)與微電極陣列的微電極接觸，形成生物電接口，將1μg/ml濃度的藥物添加到生物相容性玻璃套環(huán)中，將微電極陣列芯片放入微電極陣列系統(tǒng)支架上，由微電極陣列MEA系統(tǒng)產(chǎn)生1mV的激發(fā)脈沖信號(hào)激勵(lì)神經(jīng)細(xì)胞，以1mV為增量由低到高逐漸改變激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值，將神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)作電位信號(hào)時(shí)的激發(fā)脈沖信號(hào)的電壓幅值作為當(dāng)前藥物濃度下的電激發(fā)信號(hào)條件閾值；隨后按照1μg/ml濃度梯度改變藥物濃度，繼續(xù)探測(cè)相應(yīng)的電信號(hào)激發(fā)條件閾值。
文檔編號(hào)G01N27/92GK103245724SQ20131019115
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月21日
發(fā)明者呂曉迎, 王志功, 李賢 申請(qǐng)人:東南大學(xué)