專利名稱：一種優(yōu)秀冰雪運動員eb病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用流式細胞術鑒定優(yōu)秀冰雪運動員愛潑斯坦-巴爾病毒(epstein-barr virus, EB)轉(zhuǎn)化細胞凋亡鑒定方法。
背景技術：
細胞永生化技術發(fā)展到今天已有了長足的進步，EB病毒、猴空泡病毒40 (Simianvacuolating virus40, SV40)都是永生化細胞常用的轉(zhuǎn)化病毒。EB病毒轉(zhuǎn)化優(yōu)秀冰雪運動員外周血B淋巴細胞建立的永生細胞株讓原本有一定壽命的人體細胞能夠不間斷地繁殖下去，使一些特殊細胞的增殖能力加強，細胞凋亡率減小。優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞可以永久的保存人類與杰出運動能力相關的基因資源，同時解決以往實驗研究的接力式進行與標本的暫時性采集中存在的矛盾，以便有效的對同一研究對象進行持久的連續(xù)性研究。EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡表現(xiàn)出與普通細胞凋亡相同的形態(tài)特征和生活化特征，但因其細胞凋亡率很小，許多檢測方法難以檢測或檢測結果準確率很低。細胞凋亡鑒定主要是利用細胞形態(tài)學特點和生化特征來進行的。通常是通過光學顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡對組織或細胞進行各種染色來觀察凋亡現(xiàn)象，其次是采用原位末端標記法(Terminal deoxynucIeotidyl trasnferase-mediated deoxyuridine triphosphatenick-end labelling assay, TUNEL)和DNA瓊脂糖凝膠電泳法來分析凋亡情況,但這些方法都存在檢測費用昂貴、主觀性太強且不可定量檢測等弊端。近年來，隨著流式細胞分析術的不斷發(fā)展，應用該項技術檢測細胞凋亡得到充分的應用。異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate, FITC)與碘化丙唳(Propidium iodide, PI)復染法，即 Annexin V-FITC/PI雙標記法能夠定量分析細胞凋亡，磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)能與連接素V(Annexin V)發(fā)生特異性結合。PI為核酸熒光染料，不能透過正常細胞膜，只能進入已經(jīng)破損的細胞膜。細胞發(fā)生凋亡時，其細胞膜的磷脂對稱性改變而使PS暴露于細胞膜外(即PS外翻)，且凋亡細胞仍然保持其細胞膜的完整性，因而能與Annexin V (熒光素標記的Annexin V,如FITC-Annexin V)結合,而不能結合核酸突光染料PI,仍保留細胞膜結構的壞死細胞雖PS不發(fā)生翻轉(zhuǎn)，但由于其細胞膜的通透性發(fā)生了改變，Annexin V仍能進入細胞內(nèi)與細胞膜內(nèi)表面的PS結合，但同時也能被PI著色；晚期凋亡的細胞因PS外翻和膜通透性發(fā)生了改變，被Annexin V和PI標記，也呈Annexin V+/PI+;正常細胞因胞膜完整且不發(fā)生PS翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象,所以不能被Annexin V和PI標記,表現(xiàn)為雙陰性。Annexin V-FITC/PI雙標結合流式細胞術檢測法克服了單染檢測結果不準確的缺點，并且可定量分析優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡情況，可定量區(qū)分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡定量分析方法；提供一種優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡鑒定方法步驟。


圖1流式細胞術檢測優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡率Cl:壞死和機械性損傷細胞C2:早期凋亡細胞C3:活細胞C4:晚期凋亡細胞
具體實施例方式(I)制備單細胞懸液，收集EB病毒轉(zhuǎn)化細胞于流式管中，1200rpm，離心8min。(2)用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗漆細胞二次(1200rpm 離心 8min)收集(1-5) X IO5 細胞。(3)每個樣品加入100 μ I的連接緩沖液(Binding Buffer)懸浮細胞。(4)同時加入5μ1 FITC和5μ I PI雙染，混勻。(5)用已知可使EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡的藥物(如喜樹堿)誘導細胞凋亡，作為陽性對照。檢測前分別用5μ I FITC和PI染色。(6)室溫，避光，反應 5-10min。(7)首先在488nm共聚焦下觀察細胞的凋亡情況。(8)補充400μ1 Binding Buffe，400目篩網(wǎng)過篩，Ih內(nèi)進行流式細胞術定量檢測。(9)結果判斷:凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/P1-);右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)(FITC+/P1-)。
權利要求
1.一種優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡定量分析方法，其主要特征是采用 AnnexinV-FITC/PI雙標并結合流式細胞術分析檢測優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞的凋 亡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡鑒定方法。一種優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡鑒定方法，其實施步驟見具體實施方式
部分。本發(fā)明為優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡鑒定提供了新的研究手段，可定量分析優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化細胞凋亡情況，并且可定量區(qū)分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，經(jīng)電鏡檢驗及Tunel法檢驗其效果和準確性可靠。
文檔編號G01N15/14GK103196817SQ201310121689
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權日2013年4月10日
發(fā)明者陳偉光, 田小健, 馬喜強, 王會, 孫博, 關偉軍 申請人:哈爾濱體育學院