一種用于膠質(zhì)瘤早期診斷的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及腫瘤診斷試劑盒，具體涉及一種可用于膠質(zhì)瘤早期診斷的試劑盒，該試劑盒包括鼠抗人B7-H4生物素標(biāo)記單抗、鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化酶工作液等組分，對(duì)采集的腦脊液樣本進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)腦脊液中的B7-H4分子，做出相應(yīng)的診斷，該試劑盒可以定量檢測(cè)腦脊液中B7-H4蛋白表達(dá)量，從而預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，篩查高危人群，早期診斷膠質(zhì)瘤患者，鑒別膠質(zhì)瘤與其他顱內(nèi)占位病變。其靈敏度為70.8％，特異度為100％，鑒別低級(jí)別與高級(jí)別膠質(zhì)瘤的靈敏度為87.5％，特異度為75.0％。本發(fā)明的方法不與人其他細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)，為膠質(zhì)瘤的準(zhǔn)確診斷與防治提供了非常有力的技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種用于膠質(zhì)瘤早期診斷的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及腫瘤診斷試劑盒，具體涉及一種新型的可用于膠質(zhì)瘤早期診斷的試劑盒，該試劑盒通過(guò)檢測(cè)腦脊液中的B7-H4分子，不僅可以對(duì)高危人群進(jìn)行篩查，而且能夠指導(dǎo)腫瘤分期，為尋找靈敏、特異的膠質(zhì)瘤腦脊液標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)。

【背景技術(shù)】
[0002]研究顯示，在原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤中，腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率最高，接近40.5%。膠質(zhì)瘤占兒童腫瘤的20%，也是實(shí)體瘤患兒死亡的首要病因。據(jù)調(diào)查，膠質(zhì)瘤發(fā)病高峰在30-40歲，具有生存期短、復(fù)發(fā)率及死亡率高等特點(diǎn)。尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其2年生存率為27.2%，5年生存率僅為9.8%，盡管近年來(lái)的綜合治療(包括手術(shù)、放療、化療)取得了很大進(jìn)步，但最新的研究顯示其中位生存期仍不到20個(gè)月。因此，如何能夠?qū)δz質(zhì)瘤高危人群進(jìn)行篩查及早期診斷，以便及時(shí)開始治療、延長(zhǎng)患者生存期，成為越來(lái)越多的科學(xué)家和醫(yī)生關(guān)注的課題。
[0003]膠質(zhì)瘤臨床表現(xiàn)主要包括顱內(nèi)壓增高及神經(jīng)功能缺失等癥狀體征，特異性不高，因此，當(dāng)前膠質(zhì)瘤的術(shù)前診斷主要依靠影像學(xué)技術(shù)，以MRI平掃加增強(qiáng)為主，CT為輔，此外，PET,SPECT和MRI特殊功能檢查如MRS、PW1、DW1、DTI等也可用于鑒別診斷、術(shù)前評(píng)估、復(fù)發(fā)檢測(cè)，但這些影像學(xué)診斷依據(jù)仍處于經(jīng)驗(yàn)性標(biāo)準(zhǔn)的階段，尚不能滿足對(duì)腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行高危人群篩查、早期診斷、與其他顱內(nèi)占位病變鑒別的需求。
[0004]B7-H4作為B7家族中的新型負(fù)性共刺激分子，其在腫瘤免疫中的作用近年來(lái)備受矚目。研究表明T淋巴細(xì)胞的充分活化是腦腫瘤免疫的關(guān)鍵。T細(xì)胞的活化至少需要兩個(gè)信號(hào):第一信號(hào)由T細(xì)胞表面的抗原特異性受體和抗原呈遞細(xì)胞(APC)或腫瘤細(xì)胞表面的MHC抗原肽復(fù)合物結(jié)合所提供；第二信號(hào)則由APC上的共刺激分子(costimulatorymolecules)與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合產(chǎn)生，該信號(hào)能影響T細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞因子分泌。共刺激分子可分為正性和負(fù)性，保持正負(fù)共刺激信號(hào)內(nèi)在平衡對(duì)于維持機(jī)體免疫系統(tǒng)功能正常、避免T細(xì)胞不必要的激活或抑制意義重大，而腫瘤細(xì)胞往往通過(guò)低表達(dá)正性共刺激分子或高表達(dá)負(fù)性共刺激分子來(lái)逃過(guò)機(jī)體的免疫監(jiān)視。B7家族包含了許多重要的協(xié)同刺激分子，如B7-1、B7-2、B7-H1等，可促進(jìn)或抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，對(duì)B細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。DM Kuang等發(fā)現(xiàn)在肝癌基質(zhì)中B7-H1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞能抑制腫瘤特異性T細(xì)胞免疫，并且該群巨噬細(xì)胞在肝癌中的聚集密度與肝癌病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。對(duì)于新近發(fā)現(xiàn)的B7-H4,已有研究確認(rèn)了腦腫瘤干細(xì)胞(brain tumor stemcells)可以通過(guò)B7-H1/B7-H4途徑發(fā)生免疫逃逸。
[0005]隨著對(duì)B7-H4研究的深入，有部分學(xué)者開始著眼于B7-H4與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。Arigami等發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中B7-H4的含量與胃癌病人的分期、5年生存率顯著相關(guān)，并可以作為胃癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，此外，他們還研究了外周血淋巴細(xì)胞B7-H4表達(dá)量的生存分析，并得到了類似的結(jié)果。Chen等進(jìn)行了食管鱗狀上皮細(xì)胞癌的免疫組化，經(jīng)分析也證實(shí)了 B7-H4高表達(dá)的腫瘤病人呈現(xiàn)更差的預(yù)后。腎癌、黑色素瘤領(lǐng)域也相繼證明了 B7-H4在腫瘤預(yù)后方面的重要性。其中，最引人矚目的是Irish等的研究，他們發(fā)現(xiàn)卵巢癌中B7-H4的表達(dá)獨(dú)立于CA125，若將血清B7-H4單獨(dú)用于診斷，特異度為97%時(shí)靈敏度可達(dá)45%，而如果將B7-H4與CA125聯(lián)合，靈敏度可提高至65%優(yōu)于傳統(tǒng)的CA125診斷方法。這些都提示B7-H4將可作為一種新型腫瘤標(biāo)志物。
[0006]ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)技術(shù)是將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。其基本原理是首先制備酶標(biāo)抗原或抗體，即使抗原或抗體與某種酶連接，既保留其免疫活性，又保留酶的活性，然后把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，洗滌純化固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物，使得結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例，最后加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化變成的有色產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。因此，鑒于ELISA法具有操作簡(jiǎn)單、敏感度高、可定量的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的 申請(qǐng)人:擬通過(guò)用ELISA檢測(cè)腦脊液B7-H4含量，建立一種能對(duì)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行早期篩查、診斷、鑒別診斷的方法，這對(duì)膠質(zhì)瘤的預(yù)防、治療均有重大意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供新的膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)志物B7-H4，本發(fā)明通過(guò)研究負(fù)性共刺激分子B7-H4在膠質(zhì)瘤病人腦脊液中的表達(dá)情況，提出了 B7-H4可作為膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)志物；
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于膠質(zhì)瘤早期診斷的試劑盒，本發(fā)明中，將B7-H4膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)志物用于膠質(zhì)瘤診斷、篩查和評(píng)估預(yù)后，能解決當(dāng)前膠質(zhì)瘤早期診斷困難、鑒別診斷過(guò)于依賴病理的問(wèn)題并應(yīng)用于相關(guān)治療方案和預(yù)后評(píng)估。
[0009]本發(fā)明研究顯示，人腦腫瘤干細(xì)胞能表達(dá)B7-H4，對(duì)鼠GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的相關(guān)實(shí)驗(yàn)揭示CD133陽(yáng)性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞較CD133陰性的腫瘤細(xì)胞表達(dá)更高的B7-H4，在體外明顯抑制T細(xì)胞的免疫功能，在體內(nèi)促進(jìn)裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，研究還顯示，CDllb陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞也表達(dá)B7-H4。
[0010]進(jìn)一步,本發(fā)明進(jìn)行了 B7-H4的臨床研究,通過(guò)western blot發(fā)現(xiàn)高級(jí)別膠質(zhì)瘤相比低級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)更多的B7-H4蛋白質(zhì)，隨后的qRT-PCR也從mRNA水平上證實(shí)了上述結(jié)果。更進(jìn)一步，為了更直觀地展示B7-H4在腫瘤組織中的表達(dá)情況，本發(fā)明中，對(duì)正常腦組織以及不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本實(shí)施了免疫組化和免疫熒光染色，驗(yàn)證了 B7-H4隨著腫瘤級(jí)別增高表達(dá)增多而在正常組織中幾乎不表達(dá)的現(xiàn)象，更重要的是，在根據(jù)B7-H4染色情況對(duì)64例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO IV級(jí))患者進(jìn)行生存分析后，結(jié)果顯示，腫瘤組織高表達(dá)B7-H4的病人具有相對(duì)不良的預(yù)后，提示B7-H4或許能夠用于指導(dǎo)膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后。
[0011]鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是腦組織里的主要免疫細(xì)胞，本發(fā)明中，分選純化了腦組織以及外周血中的這類細(xì)胞，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析表明，高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的B7-H4陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞顯著升高。
[0012]本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)正常人、不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者腦脊液中B7-H4的含量，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析揭示B7-H4與膠質(zhì)瘤的相關(guān)性，為膠質(zhì)瘤的臨床體液學(xué)診斷提出了 B7-H4可作為膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)志物。
[0013]本發(fā)明公開了一種膠質(zhì)瘤診斷試劑盒及其制備方法和應(yīng)用，該試劑盒可以準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)腦脊液中的B7-H4，進(jìn)而能夠?qū)Ω髌谀z質(zhì)瘤做出及時(shí)的輔助診斷，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0014]本發(fā)明中，用于膠質(zhì)瘤早期診斷及鑒別診斷的試劑盒，包括鼠抗人B7-H4單抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗、通用試劑Tween-20、顯色底物ABTS、酶標(biāo)板等。該試劑盒可以定量檢測(cè)腦脊液中B7-H4蛋白表達(dá)量，從而預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，篩查高危人群，早期診斷膠質(zhì)瘤患者,鑒別膠質(zhì)瘤與其他顱內(nèi)占位病變。其靈敏度高,可以檢測(cè)30pg/ml的B7-H4，特異性高，不與人其他細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)，為膠質(zhì)瘤的準(zhǔn)確診斷與防治提供了非常有力的技術(shù)基礎(chǔ)。
[0015]基于所述的B7-H4在腦脊液中的含量與膠質(zhì)瘤患者的腫瘤級(jí)別存在一定相關(guān)性，因此，本發(fā)明的試劑盒還用于評(píng)估膠質(zhì)瘤的預(yù)后。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1:Western blot檢測(cè)正常腦組織、不同級(jí)別膠質(zhì)瘤B7-H4表達(dá)情況。
[0017]圖2:免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)正常腦組織、不同級(jí)別膠質(zhì)瘤B7-H4表達(dá)情況。
[0018]圖3:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常腦組織、不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中B7-H4陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞比例。
[0019]圖4 =ELISA檢測(cè)膠質(zhì)瘤病人、非腫瘤病人腦脊液中B7-H4濃度。
[0020]圖5:本發(fā)明用于診斷膠質(zhì)瘤的ROC曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和相應(yīng)附圖做進(jìn)一步闡釋說(shuō)明，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，不用于限制本發(fā)明范圍。
[0022]實(shí)施例1、
[0023]一、Western blot檢測(cè)正常腦組織、不同級(jí)別膠質(zhì)瘤B7-H4表達(dá)情況:
[0024]蛋白質(zhì)樣品制備:腦組織剪碎后加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿
0.5-lmin。然后4°C, 12，OOOg離心15min。取上清液作為樣品；
[0025]電泳:制備SDS-PAGE電泳凝膠，樣品中加上樣緩沖液，冷卻至室溫后，將蛋白樣品上樣至凝膠進(jìn)行電泳；轉(zhuǎn)膜:電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5minX3次。預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中1min ;轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，上壓重物，將碳板上多余的液體吸干；接通電源，恒流300mA，轉(zhuǎn)移1.5h ;轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出；
[0026]抗體孵育:裁取待測(cè)膜條，用0.0lM PBS洗膜，5minX3次。加入封閉液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2h。棄封閉液，用0.01M PBS洗膜，5minX3次。加入兔抗人B7-H4—抗(I: 5000，Epitomics)，4°C放置12h以上；陰性對(duì)照，以I % BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同；棄一抗和1% BSA，用0.0lM PBS分別洗膜，5minX4次。加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2h。棄二抗，用0.0lM PBS洗膜，5minX4次；
[0027]顯色:加入顯色液，暗室中制備膠片；
[0028]結(jié)合圖1所示，根據(jù)顏色深淺可知，高級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)B7-H4多于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，而正常腦組織幾乎不表達(dá)；
[0029]二、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)正常腦組織、不同級(jí)別膠質(zhì)瘤B7-H4表達(dá)情況:
[0030]脫蠟和水化:將腦組織石蠟切片置于二甲苯I中30min，二甲苯II中20min，二甲苯III中1min,在無(wú)水乙醇中浸泡5mins, 95 %乙醇中浸泡5min, 80 %乙醇中浸泡5mins,60%乙醇中浸泡5min,單蒸水中浸泡5min ；
[0031]抗原修復(fù):取一定量的CB緩沖液于一耐高溫容器里，放進(jìn)微波爐中，powerlOX2min,使之沸騰，然后把切片小心放入其中，再緩緩放入微波爐中加熱，power3X5min,最后，放在室溫自然冷卻30_40min ；
[0032]染色:取出切片，TBS沖洗4-5次，甩干擦凈。加入30ul H202，于室溫濕盒中封閉30min，甩干擦凈；滴加鼠抗人 B7-H4—抗(I: 50，AbD Serotec) 40ul，4°C 過(guò)夜，TBST 沖洗4-5次，滴加生物素化二抗20ul，室溫孵育lh，TBS沖洗4_5次，滴加酶標(biāo)親和素20ul，室溫孵育30min，TBS沖洗4_5次，滴加30ul底物著色后迅速?zèng)_洗干凈，滴加I滴蘇木精，5-10min,脫水,封片,鏡檢；
[0033]結(jié)合圖2所示，棕黃色染色提示B7-H4陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)比可知，高級(jí)別膠質(zhì)瘤B7-H4陽(yáng)性細(xì)胞最多，而正常組織僅多于陰性對(duì)照；
[0034]三、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常腦組織、不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中B7-H4陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞比例:
[0035]分離小膠質(zhì)細(xì)胞:取新鮮的腦組織標(biāo)本(手術(shù)切除20h內(nèi))，剪碎，離心1500rpmX5min,棄上清，加入木瓜蛋白酶(lmg/ml) 4_5ml, 37°C消化30min,加血清終止消化后離心1500rpmX5min,棄上清，用1ml的1640培養(yǎng)基重懸，過(guò)40 μ m濾網(wǎng)于15ml離心管，離心1500rpmX 5min,棄上清，向離心管中依次加入70 % Percoll溶液4ml, 30 %Percoll 溶液 8ml,HBSS2ml,離心 500gX 30min,從 70%與 30% Percoll 溶液的界面吸取細(xì)胞，PBS重懸后離心1500rpmX 5min,棄上清；
[0036]免疫磁珠分選:用80 μ I的MACS緩沖液重懸上步驟所得細(xì)胞，加入包被抗人CDllb抗體的免疫磁珠20μ 1，4°C 15min, MACS緩沖液洗滌2次，離心棄上清，500 μ I MACS緩沖液重懸細(xì)胞，過(guò)柱，移柱出磁場(chǎng)，用Iml的MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽(yáng)性細(xì)胞；
[0037]流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):100 μ I PBS重懸細(xì)胞，加5 μ I APC結(jié)合的抗人⑶I Ib抗體和5μ IPE 結(jié)合的抗人 Β7-Η4 抗體(I: 5，eB1science)，4°C孵育 15min，PBS 洗 2 次，300 μ I多聚甲醛重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)；
[0038]結(jié)合圖3所示，流式圖右上角為Β7-Η4陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞，高級(jí)別膠質(zhì)瘤、低級(jí)別膠質(zhì)瘤、正常腦組織的Β7-Η4陽(yáng)性細(xì)胞比例依次降低。
[0039]實(shí)施例2、制備膠質(zhì)瘤早期診斷的試劑盒
[0040]所述試劑盒包括下述組分:
[0041 ] 1、固相96孔酶標(biāo)板；
[0042]2、鼠抗人 Β7-Η4 純化單抗(eB1science)；
[0043]3、鼠抗人B7-H4生物素標(biāo)記單抗(eB1science)；
[0044]4、鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化酶工作液(Abcam)；
[0045]5、標(biāo)準(zhǔn)品:B7_H4 蛋白(R&D Systems)；
[0046]6、ABTS 底物:ABTSlmg+0.1M, ρΗ5.0 檸檬酸緩沖液 2ml+3% H2024ul ；
[0047]7、洗滌液:0.05% Tween20-PBS ；
[0048]8、稀釋液:0.1 % BSA-PBS ;
[0049]9、終止液:2M H2S04。
[0050]試劑盒的檢測(cè)方法，包括:
[0051]標(biāo)準(zhǔn)品配制:將不同含量的B7-H4標(biāo)準(zhǔn)品溶解于稀釋液，達(dá)到0.1,0.5,2,10，25，50,100ng/ml 等濃度；
[0052]包被封閉:鼠抗人B7-H4純化單抗稀釋至2ug/ml，酶標(biāo)板每孔包被10ul的，4°C過(guò)夜。洗滌液清洗6次，加稀釋液200ul/孔，37°C靜置Ih ；
[0053]加樣:洗滌液清洗酶標(biāo)板6次，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，空白孔加樣品稀釋液10ul,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50ul,輕晃混勻，酶標(biāo)板上覆膜，37°C反應(yīng)2h ；
[0054]一抗孵育:棄去液體，甩干，每孔加50ul生物素標(biāo)記B7-H4抗體工作液(I: 100)，37攝氏度靜置Ih;
[0055]酶標(biāo)抗體孵育:棄去液體，甩干，洗滌6次，每次l-2min，350ul/孔，甩干，每孔加50ul鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化酶工作液(I: 1000)，37攝氏度靜置0.5h ;
[0056]顯色:洗滌液清洗酶標(biāo)板6次，每孔加10ul ABTS底物工作液(I: 1000)，37攝氏度避光顯色0.5h ;每孔加50ul終止液，終止反應(yīng)；
[0057]檢測(cè)含量:用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度值(0D值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計(jì)算出待測(cè)標(biāo)本的B7-H4濃度。
[0058]實(shí)施例3、試劑盒檢測(cè)腦脊液B7-H4濃度用于診斷膠質(zhì)瘤的靈敏度、特異度
[0059]收集標(biāo)本:首先征得2011-2012年就診于華山醫(yī)院神經(jīng)外科的56例病人(5例腦外傷，I例腦膜瘤，2例轉(zhuǎn)移瘤，16例低級(jí)別膠質(zhì)瘤，32例高級(jí)別膠質(zhì)瘤)的同意后,對(duì)他們進(jìn)行了腰穿，每人留取5ml腦脊液，儲(chǔ)存于_80°C冰箱；
[0060]檢測(cè)B7-H4濃度:腦脊液樣品在冰浴中解凍30-60min,離心1500rpmX 5min,取上清，按照實(shí)施例2中的方法，采用所述的試劑盒，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品制備、包被封閉、加樣、一抗孵育、酶標(biāo)抗體孵育、顯色、酶標(biāo)儀檢測(cè)等步驟，測(cè)量每個(gè)標(biāo)本的B7-H4濃度；
[0061 ] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(如圖4所示):使用GraphPad5.02軟件；腦脊液B7-H4濃度測(cè)定結(jié)果采用均值土SEM表示，可得非膠質(zhì)瘤組95.14±16.30ng/ml，低級(jí)別膠質(zhì)瘤組123.2±11.25ng/ml，高級(jí)別膠質(zhì)瘤組 291.4±29.51ng/ml，膠質(zhì)瘤組 235.3±23.02ng/ml ；組間采用t檢驗(yàn)比較，可得非膠質(zhì)瘤組B7-H4濃度顯著低于膠質(zhì)瘤組(P = 0.0175)及高級(jí)別膠質(zhì)瘤組(P = 0.0023)，低級(jí)別膠質(zhì)瘤組B7-H4濃度顯著低于高級(jí)別膠質(zhì)瘤組(P =
0.0003)，而非膠質(zhì)瘤組與低級(jí)別膠質(zhì)瘤組間無(wú)顯著差異(P = 0.1669)；
[0062]ROC曲線分析:采用SPSS Statistics20軟件；繪制診斷膠質(zhì)瘤的ROC曲線(如圖5A所示)，曲線下面積為0.854，選取約登指數(shù)(靈敏度+特異度-1)最大的點(diǎn)作為診斷膠質(zhì)瘤的臨界值，結(jié)果顯示，當(dāng)以腦脊液B7-H4濃度> 133.6170ng/ml作為診斷膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，靈敏度為70.8%，特異度為100% ;繪制比較低級(jí)別膠質(zhì)瘤與高級(jí)別膠質(zhì)瘤的ROC曲線(如圖5B所示)，曲線下面積為0.871，選取約登指數(shù)最大的點(diǎn)作為診斷膠質(zhì)瘤的臨界值，結(jié)果顯示，當(dāng)以腦脊液B7-H4濃度135.1305ng/ml作為鑒別低級(jí)別膠質(zhì)瘤與高級(jí)別膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，靈敏度為87.5%，特異度為75.0%。
[0063]實(shí)施例4、試劑盒的臨床應(yīng)用
[0064]某一疑似膠質(zhì)瘤患者術(shù)前進(jìn)行腰穿，采集4ml腦脊液，參考實(shí)施例2中的方法，采用本發(fā)明的試劑盒，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品制備、包被封閉、加樣、一抗孵育、酶標(biāo)抗體孵育、顯色、酶標(biāo)儀檢測(cè)等步驟，測(cè)量其B7-H4濃度；
[0065] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，得出該樣本的B7-H4濃度為149.4877ng/ml ;根據(jù)如實(shí)施例3所述的對(duì)56例膠質(zhì)瘤和非膠質(zhì)瘤病人腦脊液B7-H4濃度測(cè)定所指定的標(biāo)準(zhǔn)，即腦脊液B7-H4濃度≥133.6170ng/ml很可能為膠質(zhì)瘤,而濃度≥135.1305ng/ml時(shí)該膠質(zhì)瘤很可能為高級(jí)別，依據(jù)上述測(cè)得的B7-H4濃度，診斷該患者為高級(jí)別膠質(zhì)瘤；經(jīng)術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)，該患者為膠質(zhì)瘤WH O IV級(jí)。
【權(quán)利要求】
1.腦脊液B7-H4蛋白在制備膠質(zhì)瘤診斷制劑中的用途；所述的B7-H4蛋白作為膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)志物。
2.一種用于膠質(zhì)瘤早期診斷的試劑盒，其特征在于，包括以下組分:固相96孔酶標(biāo)板；鼠抗人B7-H4純化單抗(eB1science);鼠抗人B7-H4生物素標(biāo)記單抗(eB1science);鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化酶工作液(Abeam) ;B7-H4蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(R&D Systems) ;ABTS底物；0.05% Tween20-PBS 洗滌液；0.1% BSA-PBS 稀釋液；終止液。
3.—種檢測(cè)腦脊液中B7-H4蛋白濃度的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求2的試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣本腦脊液中B7-H4蛋白濃度，其包括步驟: 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制；包被封閉鼠抗人B7-H4 ;標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本加樣；一抗孵育；酶標(biāo)抗體孵育；底物顯色；酶標(biāo)儀檢測(cè)；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算樣本濃度。
4.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，腦脊液B7-H4蛋白濃度>133.6170ng/ml時(shí)，初步診斷為膠質(zhì)瘤。
5.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，腦脊液B7-H4蛋白濃度>135.1305ng/ml時(shí)，初步診斷為高級(jí)別膠質(zhì)瘤。
6.腦脊液B7-H4蛋白在制備不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤鑒別診斷制劑中的用途；所述的B7-H4蛋白作為膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)志物。
7.腦脊液B7-H4蛋白在制備評(píng)估膠質(zhì)瘤預(yù)后的制劑中的用途；所述的B7-H4蛋白作為膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)志物。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104076151SQ201310111327
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】周良輔, 毛穎, 姚瑜, 岳琪, 葉紅星, 阿普拉吉塔 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院