專利名稱：一種檢測微量牛免疫球蛋白g的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定牛血清、血漿及相關(guān)液體樣本中牛免疫球蛋白用的試劑盒，尤其是涉及一種檢測微量牛免疫球蛋白G的試劑盒。
背景技術(shù)：
牛血清是人用生物制品疫苗、動物疫苗產(chǎn)品中重要的原材料之一，其成分直接關(guān)系到人和動物的健康。生物醫(yī)藥領(lǐng)域中疫苗的快速發(fā)展，都是通過細胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的，在細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的主要成分動物血清(牛血清是應(yīng)用最為廣泛的動物血清)對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要的甚至是難以替代的作用。牛血清中的牛免疫球蛋白G(IgG)含量的高低對于細胞的表達和提供抗體的滴度非常重要，而現(xiàn)有的檢測牛免疫球蛋白G含量的免疫比濁法、酶免法的檢測靈敏度的最低檢測濃度僅能達到100 μ g/ml,不能達到ng級水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可精確檢測微量牛免疫球蛋白G的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
本發(fā)明所述的一種檢測微量牛免疫球蛋白G的試劑盒，包括反應(yīng)滴定微孔板和包含有標(biāo)準(zhǔn)品，樣品稀釋 液，發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液的檢測試劑，所述反應(yīng)滴定微孔板上包被有鼠抗牛IgG特異性單抗，所述檢測試劑還包括工作濃度為0.1 μδ/πι1的酶標(biāo)記鼠抗牛IgG特異性抗體，所用酶稀釋液中不含牛血清白蛋白(BSA)及牛血清成分。鼠抗牛IgG特異性單抗的獲取:使用牛IgG免疫BALB/C小鼠，利用雜交瘤抗體技術(shù)，獲得鼠抗牛IgG單抗細胞株，并通過特異性篩選而獲取。所述樣品稀釋液中不含牛血清白蛋白及牛血清成分。所述發(fā)光底物A液由發(fā)光劑、增強劑和氨基酸配制而成；所述發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶和穩(wěn)定劑配制而成。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法對牛免疫球蛋白(IgG)進行檢測，使用鼠抗牛特異性單抗，利用化學(xué)發(fā)光酶催化發(fā)光底物，使之發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，測定最終形成的光量子與樣品中待測定的牛免疫球蛋白(IgG)含量成正比。實驗表明，使用本發(fā)明試劑盒檢測微量牛免疫球蛋白IgG，各項指標(biāo)可達到:線性范圍:0-1200ng/ml ;靈敏度:99.8% ;精密度:分析內(nèi)精密度為2.5% (n=10)，分析間精密度為4.5% (n=10);特異性:99.5%。與常規(guī)免疫比濁法、酶聯(lián)免疫法檢測微量牛免疫球蛋白IgG相比具有顯著的優(yōu)勢。
具體實施例方式本發(fā)明所述的檢測微量牛免疫球蛋白G的試劑盒，包括包被有鼠抗牛IgG特異性單抗的96孔發(fā)光不透明聚苯乙烯白色反應(yīng)滴定微孔板，工作濃度為0.llPg/ml的辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗牛IgG特異性抗體(所用酶稀釋液中不含BSA及牛血清成份);標(biāo)準(zhǔn)品，樣品稀釋液(樣品稀釋液中不含BSA及牛血清成分)，由發(fā)光劑、增強劑和氨基酸配制而成的發(fā)光底物A液、由氨基酸氧化酶和穩(wěn)定劑配制而成的發(fā)光底物B液。96孔發(fā)光不透明聚苯乙烯白色反應(yīng)滴定微孔板包被鼠抗牛IgG特異性單抗:包被緩沖液采用PH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液；包被濃度2-4Pg/ml，包被量ΙΟΟμΙ/孔，0°C -4°C包被過夜；棄去孔內(nèi)液體，使用PBS-Tween洗液洗板孔I次；用pH7.4 PBS含2% Casein (m/V), ΙΟΟμΙ/孔，室溫封閉2h?？贵w標(biāo)記:取辣根過氧化物酶溶于三蒸水中，加入過碘酸鈉溶液活化，加入乙二醇反應(yīng)，將反應(yīng)混合物裝入透析袋，用醋酸緩沖液透析，加入待標(biāo)記物(鼠抗牛IgG特異性抗體)混勻，碳酸緩沖液調(diào)pH至堿性，加入NaHB4溶液反應(yīng)后，裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖液透析，分裝后加入蛋白保護劑，-20度保存。本發(fā)明試劑盒的使用方法如下:
一、實驗前準(zhǔn)備
1、取I包固體洗液用500ml蒸餾水溶解后備用。2、取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復(fù)至室溫(18-25 °C )。3、將恒溫箱或水浴鍋調(diào)至反應(yīng)溫度。4、提前30分鐘將發(fā)光底物A、B液等比例混合至本次試驗所需體積。二、實驗步驟
1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在反應(yīng)滴定微孔板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 μ 1，然后在第二至十孔加樣品稀釋液100 μ 1，混勻；然后從第二孔中各取100 μ I加到第三孔，混勻，取100 μ I加到第四孔，依次類推到第十孔，混勻，取100 μ I棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為100μ 1，濃度分別為1200ng/ml、600 ng/ml、300 ng/ml、150 ng/ml、75 ng/ml、37.5 ng/ml>18.75 ng/ml、9.375 ng/ml>4.6875 ng/ml、2.34375 ng/ml)。2、加樣:在反應(yīng)滴定微孔板上分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)和待測樣品孔。在待測樣品孔中先加樣品稀釋液90μ 1，然后再加待測樣品ΙΟμΙ (樣品最終稀釋度為10倍)。加樣時將樣品加于孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3、溫育:用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。4、洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)6次，拍干。5、加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100 μ 1，空白孔除外。6、溫育:操作同3。7、洗滌:操作同5。8、每孔加入混合后的發(fā)光底物100 μ 1，震蕩10秒后，室溫(18-25°C)避光反應(yīng)10分鐘。9、化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光強度。三、結(jié)果計算
采用以下函數(shù)擬合方式:以系列定標(biāo)品濃度值的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X軸)，以定標(biāo)品發(fā)光值的對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y軸)，建立(1g-1og)線性回歸曲線，由樣品發(fā)光值，在定標(biāo)曲線上進行計算，得到相應(yīng)的濃度值。四、檢測標(biāo)本情況:
權(quán)利要求
1.一種檢測微量牛免疫球蛋白G的試劑盒，包括反應(yīng)滴定微孔板和包含有標(biāo)準(zhǔn)品，樣品稀釋液，發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液的檢測試劑，其特征在于:所述反應(yīng)滴定微孔板上包被有鼠抗牛IgG特異性單抗，所述檢測試劑還包括工作濃度為0.llPg/ml的酶標(biāo)記鼠抗牛IgG特異性抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測微量牛免疫球蛋白G的試劑盒，其特征在于:所述樣品稀釋液中不含牛血清白蛋白及牛血清成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測微量牛免疫球蛋白G的試劑盒，其特征在于:所述發(fā)光底物A液由發(fā)光劑、增強劑和氨基酸配制而成；所述發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶和穩(wěn)定劑配制而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測微量牛免疫球蛋白G的試劑盒，包括反應(yīng)滴定微孔板和包含有標(biāo)準(zhǔn)品，樣品稀釋液，發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液的檢測試劑，所述反應(yīng)滴定微孔板上包被有鼠抗牛IgG特異性單抗，所述檢測試劑還包括工作濃度為0.11μg/ml的酶標(biāo)記鼠抗牛IgG特異性抗體,所用酶稀釋液中不含牛血清白蛋白(BSA)及牛血清成分。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法對牛免疫球蛋白(IgG)進行檢測，使用鼠抗牛特異性單抗，利用化學(xué)發(fā)光酶催化發(fā)光底物，使之發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，測定最終形成的光量子與樣品中待測定的牛免疫球蛋白(IgG)含量成正比。與常規(guī)免疫比濁法、酶聯(lián)免疫法檢測微量牛免疫球蛋白IgG相比具有顯著的優(yōu)勢。
文檔編號G01N21/76GK103197077SQ201310090750
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者趙巧輝, 蔡立超, 王格, 司國權(quán), 李桂林, 付光宇, 吳學(xué)煒 申請人:鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司