專利名稱：鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)試劑盒的制備及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)的酶聯(lián)免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備、使用方法。
背景技術(shù)：
鄰苯二甲酸酯類(PAEs)是增塑劑的主體，廣泛應(yīng)用于農(nóng)膜、黏合劑、服裝、農(nóng)藥、肥料、油漆、化妝品、兒童玩具等行業(yè)，具有三致(致癌、致畸、致突)作用，屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是環(huán)境中常見的痕量有機(jī)污染物之一。最常使用的為鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)JP苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DHEP)和鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)等。這幾種化合物已被美國國家環(huán)保局(USEPA)列為“優(yōu)先監(jiān)控污染物”。中國已將DMP、DBP、D0P列入優(yōu)先控制污染物黑名單?！秶绎嬘盟畼?biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)要求DOP < 0.008mg/L,DBP < 0.003mg/L,DEP < 0.3mg/L。《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB9685-2008)規(guī)定食品、食品添加劑中的DOP < 1.5mg/kg、DINP < 9.0mg/kg>DBP < 0.3mg/kg。由此可見,急需研制出方便、快捷、檢出限低的DBP測(cè)試方法已迫在 眉睫。目前最引起廣泛關(guān)注的是DBP的生殖毒性和發(fā)育毒性(包括胚胎毒性)。美國NTP的一系列研究表明，DBP可致雄性嚙齒類動(dòng)物睪丸標(biāo)志酶活性下降、重量減輕、曲細(xì)精管變萎縮、生殖道畸形等。2006年11月起,DBP被列入California Proposition65 (1986)可疑致畸物清單中，是一種可疑的內(nèi)分泌干擾素，曾用在指甲油中。所有主要生產(chǎn)商都從2006年秋季開始減少這種物質(zhì)在指甲油中的使用。DBP在兒童玩具和兒童保育用品中被永久禁止使用超過IOOOppm的濃度,在《2008年消費(fèi)品安全改善法》(Consumer Product SafetyImprovement Act of 2008, CPSIA)中sectionl08已有規(guī)定。DBP已廣泛滲透到人類生活的各個(gè)領(lǐng)域，所帶來的危害逐步被認(rèn)可，因此DBP測(cè)試方法及測(cè)試技術(shù)的研究也在逐步的深入。DBP與其他鄰苯二甲酸酯一樣，能引起中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的功能性變化，進(jìn)一步引起組織上的改變，有趨肝性，可引起輕度致敏作用。對(duì)人:最敏感的人可嗅到的閾濃度為0.00026mg/L，對(duì)眼的光感反射作用的閾濃度為0.00016mg/L，對(duì)腦生物電活動(dòng)的閾濃度為0.00011 0.00012mg/L。對(duì)皮膚和眼睛的作用:可經(jīng)完整皮膚吸收少量；皮膚及眼粘膜一次接觸后，并不引起刺激作用，而反復(fù)接觸則可見到嚴(yán)重的刺激。某些實(shí)驗(yàn)資料表明，它可引起烴度的致敏作用。對(duì)動(dòng)物:小白鼠吸入2小時(shí)氣霧劑的LD50 = 25mg/L。中毒期間可見對(duì)眼粘膜及上呼吸道粘膜的強(qiáng)烈刺激，呼吸困難，共濟(jì)失調(diào)，后肢麻痹；部分動(dòng)物呈現(xiàn)淺表的麻醉，陣攣性驚厥。DBP還具有中等程度的蓄積作用和輕度刺激作用。因此建立簡(jiǎn)便、快捷的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)檢測(cè)方法顯得尤為重要。近年來國內(nèi)外對(duì)食品塑料包裝材料中PAEs分析比較重視，研究較多，主要是提高檢測(cè)效率。其中前處理技術(shù)主要有凈化體積阻滯色譜(SEC)、凝膠色譜(GPC)、超臨界萃取(SFE)、固相萃取(SPE)、加速容積萃取(ASE);測(cè)試技術(shù)主要采用液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜發(fā)(LC-MS)、氣相色譜發(fā)(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)等，但檢測(cè)費(fèi)用昂貴，需要專業(yè)人員操作，樣品前處理繁瑣，難以進(jìn)行批量處理，很難滿足酒水、飲料行業(yè)快速診斷的需求。為此，研發(fā)靈敏度高、檢測(cè)線低、操作簡(jiǎn)便的快速診斷試劑盒顯得極為迫切。對(duì)城市污水和工業(yè)廢水中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的測(cè)定已有不少報(bào)道。然而，這些內(nèi)分泌干擾物在飲用水中的濃度通常在ng/L甚至更低，通常的氣相色譜和液相色譜方法由于靈敏度有限難于檢測(cè)。常用的方法是經(jīng)過溶劑萃取等富集手段后，采用GC/MS或GC/MS-MS測(cè)定。這種方法用于測(cè)定極性較強(qiáng)的酚類和高沸點(diǎn)的組分時(shí)，往往需要進(jìn)行煩瑣的前處理過程，難于適應(yīng)快速分析的需要。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫分析越來越受青睞，但國內(nèi)外有關(guān)免疫分析檢測(cè)鄰苯二甲酸酯類的較少。免疫分析具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，方便快捷，分析容量大檢測(cè)成本低，安全可靠等優(yōu)點(diǎn)可滿足簡(jiǎn)單、快速、靈敏檢測(cè)的需要。因此，開發(fā)了快速檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯試劑盒。本試劑盒的靈敏度可達(dá)0.09ppm，在低濃度的飲用水、飲料、酒類的檢測(cè)中很占優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
為了檢測(cè)在酒水中常見增塑劑污染現(xiàn)狀，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種鄰苯二甲酸二丁酯檢測(cè)試劑盒， 同時(shí)提供其制備方法及檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)捷、快速、準(zhǔn)確、靈敏，檢測(cè)限和適用范圍完全滿足目前檢測(cè)限量的要求。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)標(biāo)準(zhǔn)溶液，固相載體，酶標(biāo)記物，DBP抗試劑，底物顯色液，包被液，酶稀釋工作液，終止液及濃縮洗滌液。試劑盒的實(shí)現(xiàn)形式:其中，所述固相載體為微孔板，所述微孔板由鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)抗原包被，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，所述DBP抗試劑為DBP抗體，所述底物顯色液含四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，所述包被液為碳酸鹽緩沖液，所述酶稀釋工作液為含TWeen20的PBS溶液，所述終止液含濃硫酸，所述濃縮洗滌液為磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，所述抗原為鄰苯二甲酸二丁酯的高親和力的完全抗原優(yōu)選地，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的DBP抗抗體優(yōu)選地，DBP酶標(biāo)物的濃度:250ng/mL優(yōu)選地，DBP抗體濃度:200ng/ml優(yōu)選地，樣品稀釋液:PH9.6所述底物顯色液含有:四甲基聯(lián)苯胺(TMB)所述包被液含有:碳酸鈉0.1 0.3%碳酸氫鈉0.2 0.5%PH8.5 10優(yōu)選地，所述包被液含有:碳酸鈉0.15%碳酸氫鈉0.30%
PH9.6所述酶稀釋工作液含有:Teen20PBS優(yōu)選地，所述酶稀釋工作液含有:含0.1 % Teen20 的 PBS 溶液所述終止液含有:硫酸5% 25%優(yōu)選地，所述終止液含有:硫酸15%所述濃縮洗滌液含有:
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)標(biāo)準(zhǔn)溶液，固相載體，酶標(biāo)記物，DBP抗試劑，底物顯色液，包被液，酶稀釋工作液，終止液及濃縮洗滌液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板，所述微孔板由鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)抗原包被，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，所述DBP抗試劑為DBP抗體，所述底物顯色液含四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，所述包被液為碳酸鹽緩沖液，所述酶稀釋工作液為含TWeen20的PBS溶液，所述終止液含濃硫酸，所述濃縮洗滌液為磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述抗原為鄰苯二甲酸二丁酯的高親和力的完全抗原，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的DBP抗抗體，DBP酶標(biāo)物的濃度:250ng/mL, DBP 抗體濃度:200ng/ml，樣品稀釋液:PH9.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液含有:
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液含有:
6.一種檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: A.制備固相載體:將0.05mol/L的包被液與鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)完全抗原以適當(dāng)比例混合，將混合液負(fù)載與載體上，用洗滌液清洗酶標(biāo)板，拍干后用酶標(biāo)板保護(hù)液封閉保護(hù)上述洗滌后的載體。
B.制備辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠二抗:采用棋盤滴定法選擇最佳的酶標(biāo)記物的工作濃度。酶標(biāo)二抗溶于酶稀釋液中以制備二抗工作液。
C.制備DBP抗試劑:用一抗稀釋液配制200ng/ml的一抗溶液。
D.制備底物顯色液:以DMSO為稀釋液配制成較低濃度的TMB溶液即成。
E.制備濃縮洗滌液: 所述濃縮洗滌液含有:
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述濃縮液含有: Na2HPO4-12H20 2.2% (重量) NaH2PO4-2HzO 0.2% (重量) NaCl8.5% (重量)。
Tween200.5% (體積) Procl in 3000_1% (體積)
8.—種檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的方法，所述方法包括以下步驟: A.樣品前處理: a.瓶裝或桶裝飲用水 加入濃縮樣品稀釋液使其樣品稀釋成1.5倍即為待測(cè)液。
b.瓶裝或罐裝飲料、酒 取5ml樣品加入2ml色譜純正己烷混勻后靜止，取上清液Iml揮干，用Iml的35%的甲醇重溶即稀釋成0.4倍的待測(cè)液。
B.使用前述試劑盒及微孔板酶標(biāo)分析儀檢測(cè)定量樣品液鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
優(yōu)選地，所述步驟B包括: a.加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品:加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品40 60ii L到對(duì)應(yīng)微孔板中，加入DBP抗試劑40 60 ii L/孔，再加入酶標(biāo)物40 60 ii L/孔，混勻，用蓋板膜蓋板后室溫或37 V反應(yīng)30 60min。
b.洗板:揭開膜后，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液200 400u L/孔，充分洗滌數(shù)次，每隔30s,用吸水紙拍干。
c.顯色:加入顯色液50 IOOiiL/孔,用蓋板膜蓋板后室溫或37°C反應(yīng)10 15min。
d.測(cè)定:加入終止液40 60ii L/孔,混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處,測(cè)定每孔OD值。
e.結(jié)果判定:在微孔板酶標(biāo)儀上測(cè)定OD值，與根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，確定樣品中鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟B中反應(yīng)溫度為37°C，所述DBP標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的加入體積50 u I/孔,所述DBP抗試劑的加入體積為50 u I/孔,所述酶標(biāo)物加入體積為50 u L/孔，所述顯色液的加入體積為100 u L/孔，所述洗滌工作液加入體積為300 u L/孔，所述終止液的加入體積為50 u L/孔，所述反應(yīng)時(shí)間40min，所述顯色時(shí)間IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)的酶聯(lián)免疫分析測(cè)定試劑盒，所述試劑盒包括鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)標(biāo)準(zhǔn)溶液，固相載體，酶標(biāo)記物，DBP抗試劑，底物顯色液，包被液，酶稀釋工作液，終止液及濃縮洗滌液。本發(fā)明還公開了一種鄰苯二甲酸二丁酯酶聯(lián)免疫分析測(cè)定試劑盒的制備方法及檢測(cè)方法。使用本發(fā)明制備的鄰苯二甲酸二丁酯試劑盒，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好，線性好等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/63GK103226144SQ20131008721
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者時(shí)國慶, 李谷豐, 孫清 申請(qǐng)人:北京普贊生物技術(shù)有限公司