專利名稱：一種羅丹明b elisa檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種羅丹明B ELISA檢測方法。
背景技術(shù)：
羅丹明B (Rhodamine B，簡稱RHB)，又名四乙基羅丹明，玫瑰紅B，堿性玫瑰精，俗名花粉紅，深綠色晶體或紅紫色粉末，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料；由間羥基二乙基苯胺和鄰苯二甲酐縮合而成，分子式為C28H31ClN2O3，分子量:479.01其結(jié)構(gòu)式如式(I )所示:
Cl.(X。
jk
廣泛應(yīng)用于造紙、制漆、紡織、皮革和瓷器等工業(yè)的染色；同時，它還是一種常見的分析試劑，廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)保、礦業(yè)、鋼鐵和醫(yī)藥等領(lǐng)域，如用于測定金、汞、錳、鈷等，被測元素達30余種。羅丹明B具有潛在的毒性、致癌和致突變性，衛(wèi)生部《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》將其列為違禁添加物。但是，有些不法商販為了牟取高額利潤，將羅丹明B非法用于食品和調(diào)味品(如辣椒油、辣椒醬、花椒、臘腸等)染色，嚴重損害了廣大人民群眾的身體健康。目前國內(nèi)外對食品中羅丹明B的常用檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。但是由于色譜法的樣品前處理復(fù)雜繁瑣，并且儀器昂貴，成本高，很難實現(xiàn)對羅丹明B進行快速、高效的檢測和監(jiān)測。免疫檢測方法(immunoassay, IA)具有快速、簡便、靈敏度高、特異性強的特點,是目前食品安全快速檢測的重要方法之一，已經(jīng)在食品安全檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用。建立羅丹明B的IA檢測方法首先得制備羅丹明B的抗原及抗體，然后才能建立免疫檢測方法。專利《一種羅丹明B完全抗原的合成方法》(申請?zhí)?200910031727.5)和《一種羅丹明B酶聯(lián)免疫檢測方法》(申請?zhí)?201010196590.1)以羅丹明B為半抗原，與三丁胺和氯甲酸異丁酯反應(yīng)生成活潑中間體混合酸酐，然后與牛血清白蛋白(BSA)反應(yīng)制備免疫抗原羅丹明B-BSA，與卵清蛋白(OVA)反應(yīng)制備包被抗原羅丹明B-0VA，免疫動物獲得抗體，建立了羅丹明B的ELISA快速檢測方法。這種方法偶聯(lián)時間4h，條件需要冰浴，步驟繁瑣，所建立的檢測方法IC5tl為1.3 ng/mL。專利《羅丹明B人工抗原及其制備方法和應(yīng)用》(公開號:CN200910035980.8)則采用N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)將羅丹明B活化生成活潑酯衍生物，然后和蛋白連接，制備得羅丹明B-BSA免疫抗原和羅丹明B-OVA包被抗原，兩步操作，抗原制備比較繁瑣，而且未能提供該方法所得抗原和的抗體的特異性和靈敏度。因此，很有必要設(shè)計一種快速、簡便、反應(yīng)條件要求不高的偶聯(lián)方法，并且能建立特異性和靈敏度更高的羅丹明B免疫檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有羅丹明B檢測技術(shù)的不足，提供一種新的羅丹明BELISA檢測方法。所述ELISA檢測方法是利用新合成的人工抗原和抗體相互組合建立的。利用新合成的人工抗原和抗體建立的羅丹明BELISA檢測方法能方便、快捷、特異、準確地檢測出食品中是否含有羅丹明B
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種羅丹明B ELISA檢測方法，是利用抗體I或抗體2分別與包被原I或包被原2組合，建立ELISA檢測方法；
所述抗體I和抗體2是由免疫原I和免疫原2分別免疫新西蘭大白兔得到的；
所述免疫原I和包被原I的制備方法為:將羅丹明B分別和BSA、OVA溶于磷酸鹽緩沖溶液中，加入1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，常溫攪拌反應(yīng)20 40min，將反應(yīng)溶液用磷酸鹽緩沖溶液透析即得目的產(chǎn)物羅丹明B-BSA和羅丹明B-0VA，羅丹明B-BSA為免疫原1，羅丹明B-OVA為包被原I ;
所述免疫原2和包被原2的制備方法如下:為將羅丹明B異硫氰酸酯分別和BSA、0VA溶于碳酸鹽緩沖溶液中，常溫攪拌反應(yīng)20 40min，將反應(yīng)溶液用磷酸鹽緩沖溶液透析即得目的產(chǎn)物羅丹明B異硫氰酸酯-BSA和羅丹明B異硫氰酸酯-0VA，羅丹明B異硫氰酸酯-BSA為免疫原2，羅丹明B異硫氰酸酯-OVA為包被原2。所述羅丹明B、羅丹明B異硫氰酸酯、2種包被原和2種免疫原的結(jié)構(gòu)及反應(yīng)過程如圖1所示。磷酸鹽緩沖溶液配方=Na2HPO4.12H20 2.90 g, NaCl 8.50 g, KCl 0.20 g, KH2PO40.20 g,加蒸懼水定容至1000 mLo碳酸鹽緩沖溶液配方=Na2CO3 1.69 g，NaHCO3 2.95 g，加蒸餾水定容至1000 mL。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)作為強的縮合劑，半小時內(nèi)可將羅丹明B上的羧基與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)制備出免疫原和包被原，制備過程簡單而快捷。羅丹明B異硫氰酸酯作為半抗原，在堿性條件下，羅丹明B異硫氰酸酯上的異硫氰酸根與載體蛋白上的氨基反應(yīng)，形成共價偶聯(lián)，反應(yīng)時間也在半小時內(nèi)，制備過程簡單而快捷。將抗體I或抗體2分別與包被原I或包被原2組合，建立羅丹明BELISA檢測方法，優(yōu)選出特異性、靈敏度最高的組合。優(yōu)選地，特異性、靈敏度最高的羅丹明B ELISA檢測方法的組合為抗體2與包被原I的組合。優(yōu)選地，SI中所述羅丹明B與牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)的質(zhì)量份數(shù)比為80 120:1。
優(yōu)選地，S2中所述羅丹明B異硫氰酸酯與牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)的質(zhì)量份數(shù)比為80 120:1。優(yōu)選地，SI中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺的用量按照與羅丹明B的質(zhì)量份數(shù)比為I 8:1的比例確定。1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺作為強的縮合劑，其用量的多少能夠影響羅丹明B和載體蛋白的偶聯(lián)效果，加入量過多會產(chǎn)生浪費，加入量過少會降低羅丹明B和載體蛋白的偶聯(lián)效率。優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖溶液pH值為7.2 7.6，濃度為0.01 0.1M/L。優(yōu)選地，所述碳酸鹽緩沖溶液的PH值為9.0 9.8，濃度為0.01 0.1M/L。本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)作為強的縮合劑，半小時內(nèi)將羅丹明B上的羧基與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)制備出免疫原和包被原；同時選取羅丹明B異硫氰酸酯作為半抗原，堿性條件下，半抗原上的異硫氰酸根與載體蛋白上的氨基反應(yīng)，形成共價偶聯(lián)，時間也在半小時內(nèi)。設(shè)計的偶聯(lián)方法簡便快速，獲得質(zhì)量更好的抗原、抗體，建立了一種更加靈敏的檢測模式，提供了一種檢測羅丹明B的有效方法。且用該抗原免疫動物所得抗體與本發(fā)明中的抗原特殊組合后，半抑制濃度(IC5tl)為0.09 ng/mL，檢測的線性范圍(IC2tl IC8(l)0.008 1.15 ng/mL。從而可更好地應(yīng)用于快速檢測食品中非法添加的羅丹明B，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1.兩種羅丹明B免疫原和包被原的結(jié)構(gòu)及反應(yīng)過程。圖2.羅丹明B免疫原1、包被原I紫外掃描鑒定曲線。圖3.羅丹明B免疫原2、包被原2紫外掃描鑒定曲線。圖4.羅丹明B抗體和包被原兩兩組合間接競爭ELISA標準曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明實施例采用的試劑和原料為常規(guī)市購試劑和原料。實施例1:羅丹明B免疫原I的合成
稱取10 mg的羅丹明B和15 mg牛血清白蛋白(BSA) —起溶于2 mL磷酸鹽緩沖溶液中，室溫攪拌均勻，將20 mg的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)投入上述羅丹明B、BSA和磷酸鹽緩沖溶液的混合溶液中，室溫攪拌30 min，將反應(yīng)后溶液裝于透析袋，用磷酸鹽緩沖溶液于4°C透析3天，期間換透析液6次，即得到目的產(chǎn)物羅丹明B-BSA (免疫原I)。磷酸鹽緩沖溶液的配方:Na2HPO4.12Η20 2.90 g,NaCl 8.50 g，KCl 0.20 g，KH2PO4
0.20 g,加蒸懼水定容至1000 mLo實施例2:羅丹明B包被原I的合成
大致與實施例1相同，但采用卵清蛋白(OVA)作載體蛋白，得到目的產(chǎn)物羅丹明B-OVA (包被原I)。
實施例3:羅丹明B免疫原I和包被原I的鑒定
取羅丹明B、BSA、0VA、免疫原I和包被原I分別進行紫外(200 600 nm)掃描鑒定，并通過比較偶聯(lián)前后的各物質(zhì)的最高吸光值(見圖2)，發(fā)現(xiàn)羅丹明B免疫原I的吸收曲線與羅丹明B、BSA明顯不同，是兩者的累加吸收特征，說明羅丹明B已經(jīng)與BSA成功偶聯(lián)制得免疫原I。包被原I亦成功制備。免疫原I和包被原I紫外鑒定光譜圖如圖2所示。實施例4:羅丹明B免疫原2的合成
稱取10 mg羅丹明B異硫氰酸酯和15 mg牛血清白蛋白(BSA)—起溶于pH 9.2的碳酸鹽緩沖液中，常溫攪拌反應(yīng)I h，將反應(yīng)后溶液裝于透析袋，用磷酸鹽緩沖溶液于4°C透析3天，期間換透析液6次，即得到目的產(chǎn)物羅丹明B異硫氰酸酯-BSA (免疫原2)，分裝后-20°C保存。碳酸鹽緩沖液的配方=Na2CO3 1.69 g，NaHCO3 2.95 g，加蒸餾水定容至1000 mL。磷酸鹽緩沖溶液的配方同實施例1。實施例5:羅丹明B包被原2的合成
大致與實施例4相同，但采用卵清蛋白(OVA)作載體蛋白，得到目的產(chǎn)物羅丹明B異硫氰酸酯-OVA (包被原2)。實施例6:羅丹明B免疫原2和包被原2的鑒定 大致與實施例3相同。但采用不同的分析物進行掃描。免疫原2和包被原2紫外鑒定光譜圖如圖3所示。實施例7:羅丹明B抗體檢測及抗原抗體組合模式選擇 1.羅丹明B抗體的制備
本實施例選用2只7周齡、體重2公斤左右、健康的新西蘭大白兔，分別編號。2種免疫原各免疫I只新西蘭大白兔，實驗免疫劑量為0.5 mg/只，在兔背部皮下多點免疫，每三周加強免疫I次。初次免疫選用完全佐劑與免疫原等體積混合乳化后免疫，加強免疫則選用不完全佐劑。2.羅丹明B抗體效價的測定
從第3次加強免疫開始，每次第8天采血，經(jīng)放置、離心后得到血清，血清適當(dāng)稀釋后用間接競爭ELISA法測定效價。四免后，兔子獲得高效價的抗體。免疫原I所獲得的抗體I效價最高為1:8000，免疫原2所獲得的抗體2效價最高為1:256000。3.羅丹明B抗原抗體最優(yōu)組合模式的選擇
分別以2種抗體和2種包被原交叉組合，采用用方陣滴定法確定羅丹明B包被原工作濃度和羅丹明B抗體稀釋倍數(shù)(表I)。用不同濃度的羅丹明B標準品溶液做實驗溶液，其濃度如下:0 ng/mL,0.004 ng/mL、0.03 ng/mL、0.24 ng/mL、1.95 ng/mL、15.63 ng/mL、125 ng/mL、I M<g/mL,米用 4 組平行實驗。采用間接競爭ELISA方法:確定各組合的最低檢測限(L0D值)、半數(shù)抑制量(IC5tl值)和檢測范圍(IC2tl IC8tl),具體結(jié)果見表I。間接競爭ELISA方法:用上述工作濃度的包被酶標板，將實驗溶液與抗體溶液同時加入到酶標板小孔中，同時設(shè)置空白孔和陰性對照孔，37°C溫育40 min，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌6次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打；加入稀釋好的酶標二抗溶液，37°C溫育30min，用洗滌液洗滌6次，拍干；加入底物顯色溶液，37°C溫育lOmin，加入終止液終止顯色，用酶標儀在波長450 nm處測定吸光值A(chǔ)，以吸光值A(chǔ)為縱坐標，以羅丹明B實驗溶液濃度的1glO值為橫坐標，繪制半對數(shù)標準曲線圖(圖4)。結(jié)果表明標準曲線具有完整的反S形狀，并且有上平臺和下平臺，標準曲線的平行測定次數(shù)4次，實驗重復(fù)性良好，相對標準偏差在10%以內(nèi)。免疫原2制備的抗體2和包被原I的組合所得IC5tl值為0.09 ng/mL, LOD值為
0.002 ng/mL，檢測范圍(IC2tl IC80)為0.008 1.15 ng/mL，該組合具有最低檢測限和較聞靈敏度，為最優(yōu)組合。表1羅丹明B抗體和包被原兩兩組合的性能比較
權(quán)利要求
1.一種羅丹明B ELISA檢測方法，其特征在于，利用抗體I或抗體2分別與包被原I或包被原2組合，建立ELISA檢測方法； 所述抗體1和抗體2是由免疫原I和免疫原2分別免疫新西蘭大白兔得到的； 所述免疫原I和包被原I的制備方法為:將羅丹明B分別和BSA、OVA溶于磷酸鹽緩沖溶液中，加入1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，常溫攪拌反應(yīng)20 40min，將反應(yīng)溶液用磷酸鹽緩沖溶液透析即得目的產(chǎn)物羅丹明B-BSA和羅丹明B-OVA，羅丹明B-BSA為免疫原1，羅丹明B-OVA為包被原I ; 所述免疫原2和包被原2的制備方法如下:為將羅丹明B異硫氰酸酯分別和BSA、0VA溶于碳酸鹽緩沖溶液中，常溫攪拌反應(yīng)20 40min，將反應(yīng)溶液用磷酸鹽緩沖溶液透析即得目的產(chǎn)物羅丹明B異硫氰酸酯-BSA和羅丹明B異硫氰酸酯-0VA，羅丹明B異硫氰酸酯-BSA為免疫原2，羅丹明B異硫氰酸酯-OVA為包被原2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述羅丹明BELISA檢測方法，其特征在于，利用抗體2和包被原I組合建立的羅丹明B ELISA檢測方法靈敏度最高，特異性最強。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述羅丹明BELISA檢測方法，其特征在于，所述羅丹明B與BSA或OVA的質(zhì)量份數(shù)比為80 120:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述羅丹明BELISA檢測方法，其特征在于，所述羅丹明B異硫氰酸酯與BSA或OVA的質(zhì)量份數(shù)比為80 120:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述羅丹明BELISA檢測方法，其特征在于，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺的用量按照與羅丹明B的質(zhì)量份數(shù)比為I 8:1的比例確定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖溶液PH值為7.2 7.6，濃度為 0.01 ~0.1M/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，所述碳酸鹽緩沖溶液PH值為9.0 9.8，濃度為 0.01 ~0.1M/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羅丹明BELISA檢測方法。所述方法是采用新合成的人工抗原和抗體組合建立的。所述的羅丹明B人工抗原是將羅丹明B或羅丹明B異硫氰酸酯與BSA或OVA偶聯(lián)獲得特異性、靈敏性較好的人工抗原，免疫獲得抗體，基于獲得的人工抗原和抗體篩選靈敏性和特異性最優(yōu)的組合建立羅丹明BELISA檢測方法，通過該組合建立的ELISA檢測方法可更好地應(yīng)用于快速檢測食品中非法添加的羅丹明B，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/566GK103197061SQ20131007717
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月12日
發(fā)明者雷紅濤, 孫遠明, 唐秋實, 王弘, 沈玉棟, 楊金易, 徐振林 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)