專利名稱:激光差動共焦圖譜顯微成像方法與裝置的制作方法
技術領域:
本發(fā)明屬于光學顯微成像及光譜測量技術領域,涉及一種激光差動共焦圖譜顯微成像方法與裝置,可用于各類樣品的三維形貌重構及微區(qū)光譜探測。
背景技術:
1990年G.J.Puppels等在Nature期刊報道其發(fā)明的將拉曼光譜探測技術與激光共焦顯微技術結合的激光共焦拉曼光譜顯微技術,是拉曼技術的一次革命性突破。該技術既繼承了共焦顯微術的高分辨層析成像特征,又可以對樣品進行光譜分析,因此可以實現(xiàn)對樣品微區(qū)光譜的高分辨層析探測。此顯著優(yōu)點使激光共焦拉曼光譜顯微技術在光譜測試領域獨樹一幟,并且迅速發(fā)展為一種極其重要的樣品結構與成分分析的重要手段,使之廣泛應用于化學、生物學、醫(yī)學、物理學、地質學、法庭取證、刑偵學等學科的前沿基礎研究中。目前,典型的激光共焦拉曼光譜探測儀的原理如圖2所示,激光沿光路依次經過第一聚光鏡、第一針孔、第八聚光鏡、第一分光系統(tǒng)、四分之一波片、物鏡后,聚焦在被測樣品上,激發(fā)出載有樣品光譜特性的拉曼散射光;移動被測樣品,使對應被測樣品不同區(qū)域的拉曼散射光再次通過四分之一波片并被第一分光系統(tǒng)反射,經過第四聚光鏡、第四針孔、第五聚光鏡后聚焦進入第一光譜儀進行光譜探測?,F(xiàn)代科技的快速發(fā)展對微區(qū)光譜探測能力及空間分辨探測能力提出了更高的要求,若要提高空間分辨力,必須對系統(tǒng)進行精確定焦。在光學探測系統(tǒng)中,當測量聚焦光斑位于焦點時其尺寸最小,激發(fā)光強最強,因此為了獲得高空間分辨力,必須能夠捕獲到激發(fā)光強最強處的光譜,從而獲得其最佳空間分辨力和最優(yōu)的光譜探測能力。如圖1所示,現(xiàn)有的共焦顯微技術在激光激發(fā)焦點O附近的BB'區(qū)域內,均能激發(fā)出樣品的拉曼光譜,并能被針孔后的光譜探測系統(tǒng)探測。因而共焦拉曼光譜顯微技術的實際探測位置往往處于共焦曲線中離焦的BA和A' B'區(qū),從而導致實際探測的“微區(qū)”遠大于測量光束焦點O處光斑尺寸,同時,應用拉曼光譜進行共焦定位信噪比較低,并且由于針孔的遮擋作用會進一步降低拉曼光譜的能量,而擴大針孔尺寸提高光譜通過率則會增加共焦軸向定位曲線的半高寬,降低其定位精度,而現(xiàn)有共焦拉曼系統(tǒng)中的共焦針孔尺寸通常在150 μ m 200 μ m之間,所用針孔尺寸相對較大,亦不能很好的起到定焦作用。上述原因限制了共焦拉曼光譜顯微系統(tǒng)探測微區(qū)光譜的能力,制約了其在更精細微區(qū)光譜測試與分析場合中的應用,因而提高系統(tǒng)的定焦精度是提高其空間分辨力的關鍵。1996 年 Kimberley F 等人在《Description and Theory of a Fiber-OpticConfocal and Super-Focal Raman Microspectrometer))中提出用光纖束代替共焦拉曼光譜顯微鏡的針孔的方法,實現(xiàn)“針孔”尺寸的非機械調節(jié),其在擴大“針孔”時,并不降低系統(tǒng)的光譜分辨力;2007 年 E Kenwood Blvd 等在《Very efficient fluorescent backgroundsuppression in confocal Raman microscopy Department of Physics))中提出通過使用3-4ps的皮秒激光器結合相應的瞬時曝光技術使樣品測量的熒光背景降低了約3個數量級,提高了共焦拉曼光譜顯微術的分辨力;2008年N.Everall等在《The Influenceof Out-of-Focus Sample Regions on the Surface Specificity of Confocal RamanMicroscopy》中指出采用大數值孔徑(NA=1.4)油浸物鏡,可獲得了比傳統(tǒng)共焦拉曼光譜儀更高的軸向分辨力和信噪比,但是這種方法需要對樣品進行制片,不能實現(xiàn)非接觸和無損測量,限制了系統(tǒng)的應用范圍;2009年M.J.Pelletier和Neil J.Everall等在((Controlof Out-of-Focus Light Intensity in Confocal Raman microscopy using opticalpreprocessing》中提出利用校正物鏡或結構光瞳掩模消除了離焦位置拉曼散射的光譜強度的干擾,提高了光譜探測效率,大大降低了共焦拉曼系統(tǒng)離焦拉曼光譜對其有效深度分辨力的影響。上述研究,主要集中在共焦拉曼光譜顯微系統(tǒng)涉及的光源系統(tǒng)、光譜探測系統(tǒng)、聚焦物鏡系統(tǒng)、光譜信息處理等方面,雖然改善了光譜系統(tǒng)的總體性能,但在共焦拉曼光譜系統(tǒng)空間分辨能力的方面卻沒顯著改善,提高拉曼光譜系統(tǒng)的空間分辨力仍是懸而未決的問題。在物理化學、生物醫(yī)學、薄膜和藥物等研究領域,分析樣品的化學成分、空間分布、表面物理化學性質時常以圖像的形式來獲取樣品更多的信息,因此需要將拉曼光譜探測由單點分析方式拓展到對一定區(qū)域范圍內樣品進行探測分析,即拉曼光譜成像。然而,為了獲得更精確、更豐富的測量信息,拉曼光譜成像時既需較長的單點激發(fā)拉曼光譜探測時間,又需對樣品進行多點拉曼光譜探測,其結果勢必使拉曼光譜成像需要較長的探測時間,常達幾個小時才能完成成像。但是,儀器長時間成像過程中受環(huán)境溫度、振動、空氣抖動等的影響較大,易使儀器系統(tǒng)產生漂移,從而導致樣品被探測位置離焦;由于現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測技術不具備實時焦點跟蹤能力,因而在整個成像過程中,無法補償樣品的探測位置偏移引入的離焦誤差,制約了共焦拉曼光譜成像技術空間分辨能力的提高。共焦拉曼光譜探測技術在毒品探測、寶玉石真?zhèn)舞b別、油氣勘探、化學分析以及考古等研究領域對其探測聚焦光斑的尺寸要求有所差異,而現(xiàn)有的共焦拉曼探測技術無法精確控制聚焦光斑尺寸的大小,其結果亦限制了共焦拉曼光譜成像技術在各領域中的應用。現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測儀器中,系統(tǒng)收集到的樣品散射光束中包含的拉曼散射光極其微弱,只有系統(tǒng)收集到的樣品散射光束中包含的瑞利光束的10_3 10_6倍,因此,在共焦拉曼光譜探測中如何利用現(xiàn)有光譜探測系統(tǒng)中遺棄的強于拉曼散射光IO3 IO6倍的瑞利光束進行輔助探測是改善共焦拉曼光譜探測技術空間分辨力的新途徑?;谏鲜銮闆r,本發(fā)明提出差動共焦探測系統(tǒng)利用現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測系統(tǒng)收集到的樣品散射光中遺棄的強于樣品拉曼散射光IO3 IO6倍的瑞利光束進行高精度探測,使其與光譜探測系統(tǒng)有機融合,進行空間位置信息和光譜信息的同時探測,以期實現(xiàn)高空間分辨力、測量聚焦光斑尺寸可控的“圖譜合一”的差動共焦圖譜成像與探測,而實現(xiàn)高空間分辨力的光譜探測是目前光譜顯微測試領域亟待解決的問題,具有極其重要的理論和學術價值。本發(fā)明專利的具體思路是:將激光差動共焦技術與光譜探測技術有機結合,差動共焦系統(tǒng)利用系統(tǒng)收集到的樣品散射光中的瑞利光束對聚焦光斑的焦點進行實時跟蹤與空間位置探測,光譜探測系統(tǒng)利用系統(tǒng)收集到的樣品的散射光中的拉曼散射光進行光譜探測,然后再將差動共焦探測系統(tǒng)信號與拉曼光譜探測系統(tǒng)信號有機融合,從而實現(xiàn)激光差動共焦拉曼光譜系統(tǒng)的焦點跟蹤探測和光斑尺寸可控探測,即實現(xiàn)拉曼光譜的高空間分辨探測。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測技術空間分辨力難以提高的不足,提出一種具有高空間分辨力的激光差動共焦圖譜顯微層析成像方法和裝置。本發(fā)明的目的是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明提供的激光差動共焦圖譜顯微成像方法,a)通過激發(fā)光束產生系統(tǒng)產生激發(fā)光,經過第一分光系統(tǒng)、物鏡后,聚焦在被測樣品上,并激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品光譜特性的拉曼散射光,激發(fā)出的拉曼散射光和瑞利光被系統(tǒng)收集回光路中,經過物鏡后被第一分光系統(tǒng)反射至二向色分光系統(tǒng),經二向色分光系統(tǒng)分光后,拉曼散射光和瑞利光相互分離,瑞利光被反射進入差動共焦探測系統(tǒng),拉曼散射光透射進入光譜探測系統(tǒng),利用差動共焦曲線過零點與焦點位置精確對應這一特性,通過零點觸發(fā)來精確捕獲激發(fā)光斑焦點位置的光譜信息,實現(xiàn)高空間分辨的光譜探測;b)只對接收到的瑞利光信號進行差動相減處理時,系統(tǒng)可以進行高空間分辨的三維尺度層析成像;只對接收到的拉曼散射光的光譜信號進行處理時,系統(tǒng)可以進行光譜探測;同時對接收到的瑞利光和拉曼散射光的信號進行處理時,系統(tǒng)可以進行高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像,即被測樣品幾何位置信息和光譜信息的高空間分辨的“圖譜合一”;c)差動共焦曲線過零點處精確對應物鏡的焦點0,測量過程中可以實時對被測樣品進行精確跟蹤定焦,保證被測樣品在整個測量過程中始終處于焦點位置,抑制環(huán)境溫度和振動等因素對光譜測量的影響,從而提高測量精度;d)差動共焦曲線過零點處對應測量物鏡焦點0,此處聚焦光斑尺寸最小,探測的區(qū)域最小,線性區(qū)域BB'其他位置對應物鏡的離焦區(qū)域,在焦前或焦后BB'區(qū)域內的聚焦光斑尺寸隨離焦量增大而增大,利用此特點,通過調整樣品的z向離焦量,并根據實際測量精度需求來控制聚焦光斑的尺寸,實現(xiàn)對樣品探測區(qū)域大小可控。本發(fā)明的探測方法中,激發(fā)光束可以是偏振光束:線偏光、圓偏光、徑向偏振光等;還可以是由光瞳濾波技術生成的結構光束,其與光瞳濾波技術聯(lián)用可以壓縮測量聚焦光斑尺寸,提高系統(tǒng)橫向分辨力。本發(fā)明的探測方法中,該系統(tǒng)還可以探測熒光、布里淵散射光、康普頓散射光等散射光譜本發(fā)明提供了一種激光差動共焦圖譜顯微成像裝置,包括激發(fā)光束產生系統(tǒng)、第一分光系統(tǒng)、物鏡、三維掃描工作臺、二向色分光系統(tǒng)、光譜探測系統(tǒng)、差動共焦探測系統(tǒng)及數據處理模塊;其中,第一分光系統(tǒng)、物鏡、三維掃描工作臺沿光路依次放置在激發(fā)光束產生系統(tǒng)出射方向,二向色分光系統(tǒng)位于第一分光系統(tǒng)的反射方向,光譜探測系統(tǒng)位于二向色分光系統(tǒng)的透射方向,差動共焦探測系統(tǒng)位于二向色分光系統(tǒng)的反射方向,數據處理模塊與光譜探測系統(tǒng)和差動共焦探測系統(tǒng)連接,用于融合并處理光譜探測系統(tǒng)與差動共焦探測系統(tǒng)采集到的數據。本發(fā)明的裝置中,光譜探測系統(tǒng)可以是普通光譜探測系統(tǒng),包括沿光路依次放置的第七聚光鏡、位于第七聚光鏡焦點位置的第二光譜儀及位于第二光譜儀后的第五探測器,用于被測樣品的表層光譜探測;還可以是共焦光譜探測系統(tǒng),包括沿光路依次放置的第四聚光鏡、位于第四聚光鏡焦點位置的第四針孔、位于第四針孔后的第五聚光鏡、位于第五聚光鏡焦點位置的第一光譜儀及位于第一光譜儀后的第三探測器,提高系統(tǒng)信噪比和空間分辨力,以及對被測樣品的層析光譜探測。本發(fā)明的裝置中,激發(fā)光束產生系統(tǒng)還可以包括偏振調制器及光瞳濾波器,用于產生偏振光及結構光束。本發(fā)明的裝置中,用于壓縮激發(fā)光斑的光瞳濾波器可以位于偏振調制器與第一分光系統(tǒng)之間,還可以位于第一分光系統(tǒng)與物鏡之間。本發(fā)明的裝置中,激發(fā)光束產生系統(tǒng)還可以放在第一分光系統(tǒng)的反射方向,二向色分光系統(tǒng)沿光路依次放在第一分光系統(tǒng)的透射方向,光譜探測系統(tǒng)位于二向色分光系統(tǒng)的透射方向,差動共焦探測系統(tǒng)位于二向色分光系統(tǒng)的反射方向,數據處理模塊連接差動共焦探測系統(tǒng)與光譜探測系統(tǒng)。本發(fā)明的裝置中,還可以包括第四分光系統(tǒng)及位于第四分光系統(tǒng)反射方向的顯微觀察系統(tǒng),用于被測樣品粗貓;其中,第四分光系統(tǒng)可以位于激發(fā)光束產生系統(tǒng)與第一分光系統(tǒng)之間,還可以位于第一分光系統(tǒng)與物鏡之間。本發(fā)明的裝置中,數據處理模塊包括用于處理位置信息的差動相減模塊和用于融合位置信息和光譜信息的數據融合模塊。有益效果本發(fā)明對比已有技術具有以下創(chuàng)新點:I)利用差動共焦系統(tǒng)軸向響應曲線的過零點與焦點位置精確對應這一特性,通過零點觸發(fā)來精確捕獲激發(fā)光斑焦點位置的光譜信息,實現(xiàn)高空間分辨的光譜探測;2)利用二向色分光裝置對系統(tǒng)收集到的瑞利光和載有被測樣品信息的拉曼散射光進行分光,瑞利光進入差動共焦探測系統(tǒng),拉曼散射光進入拉曼光譜探測系統(tǒng),實現(xiàn)光能的完全利用,使微弱的拉曼散射光能夠無損的進入拉曼光譜探測系統(tǒng),提高系統(tǒng)光譜探測靈敏度,實現(xiàn)樣品幾何位置信息和光譜信息的高空間分辨“圖譜合一”;3)利用差動共焦技術對測量聚焦光斑進行高精度定位,并對焦點位置進行實時跟蹤,消除溫度和振動等環(huán)境影響,實現(xiàn)調控并使拉曼光譜系統(tǒng)探測可以始終精確對應最小激發(fā)聚焦光斑區(qū)域的樣品光譜,大幅提高現(xiàn)有共焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)光譜探測能力和幾何位置探測能力,即實現(xiàn)高空間分辨;4)利用差動共焦響應曲線線性區(qū)域對應不同聚焦光斑尺寸的特性,對聚焦光斑位置進行精確調控,進而控制測量聚焦光斑的尺寸,便于對不同測試需求的樣品進行測試與分析,即實現(xiàn)測量聚焦光斑尺寸可調;5)將差動共焦顯微系統(tǒng)與拉曼光譜成像系統(tǒng)在結構和功能上相融合,既可實現(xiàn)樣品微區(qū)幾何參數的層析成像,又可實現(xiàn)樣品微區(qū)的光譜探測,即同時實現(xiàn)微尺度層析成像、圖譜層析成像和光譜測試三種成像模式,并顯著改善成像測試系統(tǒng)的抗干擾能力、線性和離焦特性。本發(fā)明對比已有技術具有以下顯著優(yōu)點:I)融合差動共焦技術和光譜探測技術,利用差動共焦系統(tǒng)對焦點的精確定位,大幅提高光譜探測的空間分辨力;
2)利用差動共焦響應曲線的離焦區(qū)域,調控聚焦光斑尺寸,可滿足不同測試需求,使系統(tǒng)具有通用性;3)差動共焦焦點觸發(fā)探測技術,可顯著抑制系統(tǒng)的非線性、樣品反射率和表面傾斜等對測量結果的影響,以利于實現(xiàn)微細結構高分辨力、高抗干擾能力、高精度和高層析能力的測量等。
圖1為差動共焦與共焦顯微軸向響應示意圖;圖2為共焦拉曼光譜成像方法示意圖;圖3為激光差動共焦圖譜顯微成像方法示意圖;圖4為激光差動共焦圖譜顯微成像裝置示意圖;圖5為具有非共焦光譜探測系統(tǒng)的激光差動共焦圖譜顯微成像裝置示意圖;圖6為具有顯微功能的激光差動共焦圖譜顯微成像裝置示意圖;圖7為具有顯微功能的反射式激光差動共焦圖譜顯微成像裝置示意圖;圖8為激光差動共焦圖譜顯微成像方法與裝置實施例圖;其中,1-激發(fā)光束產生系統(tǒng),2-激光器,3-第一聚光鏡、4-第一針孔、5-第八聚光鏡、6-偏振調制器,7-光瞳濾波器,8-第一分光系統(tǒng)、9-1/4波片,10-物鏡,11-被測樣品,12-三維掃描工作臺,13- 二向色分光系統(tǒng),14-差動共焦探測系統(tǒng),15-第二分光系統(tǒng)、16-第二聚光鏡、17-第二針孔、18-第一探測器、19-第三聚光鏡、20-第三針孔、21-第二探測器、22-光譜探測系統(tǒng)、23-第四聚光鏡、4-第四針孔,25-第五聚光鏡、26-第一光譜儀、27-入射狹縫,28-平面反射鏡,29-第一凹面反射聚光鏡、30-光譜光柵、31-第二凹面反射聚光鏡,32-出射狹縫、33-第三探測器、34-數據處理模塊、35-差動相減模塊、36-數據融合模塊、37-顯微觀察系統(tǒng)、38-柯勒照明系統(tǒng),39-第三分光系統(tǒng)、40-第四分光系統(tǒng)、41-第六聚光鏡、42-第四探測器、43-差動共焦曲線、44-共焦拉曼曲線、45-共焦曲線、46-第七聚光鏡、47-第二光譜儀、48-第五探測器。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明的基本思想是利用差動共焦探測和光譜探測相結合實現(xiàn)“圖譜合一”的光譜探測。如圖3所示,激發(fā)光束產生系統(tǒng)I產生激發(fā)光,經過第一分光系統(tǒng)8、物鏡10后,聚焦在被測樣品11上,并激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品光譜特性的拉曼散射光,激發(fā)出的拉曼散射光和瑞利光被系統(tǒng)收集回光路中,經過物鏡10后被第一分光系統(tǒng)8反射至二向色分光系統(tǒng)13,經二向色分光系統(tǒng)13分光后,拉曼散射光和瑞利光相互分離,瑞利光被反射進入差動共焦探測系統(tǒng)14進行位置探測,拉曼散射光透射進入光譜探測系統(tǒng)22進行光譜探測。如圖4所示,本裝置包括沿光路依次放置的激發(fā)光束產生系統(tǒng)1、第一分光系統(tǒng)8、物鏡10、被測樣品11、三維掃描工作臺12,位于第一分光系統(tǒng)8反射方向的二向色分光系統(tǒng)13,位于二向色分光系統(tǒng)13透射方向的光譜探測系統(tǒng)22及反射方向的差動共焦探測系統(tǒng)14,還包括連接光譜探測系統(tǒng)22和差動共焦探測系統(tǒng)14的數據處理模塊34。把圖4中光譜探測系統(tǒng)22替換為包括第七聚光鏡46、第二光譜儀47及第五探測器48的普通光譜系統(tǒng),即構成圖5。在圖4中第一分光系統(tǒng)8與物鏡10之間添加第四分光系統(tǒng)40,第四分光系統(tǒng)40反射方向添加顯微觀察系統(tǒng)37,即構成圖6。把圖6中的激發(fā)光束產生系統(tǒng)I放置于第一分光系統(tǒng)8的反射方向,二向色分光系統(tǒng)13放置于第一分光系統(tǒng)8的透射方向,即構成圖7。實施例本實施例中,偏振調制器6為徑向偏振光產生器,第一分光系統(tǒng)8為保偏分光棱鏡,第二分光系統(tǒng)15為保偏分光棱鏡,第三分光系統(tǒng)39為寬帶分光棱鏡,第四分光系統(tǒng)40為保偏分光棱鏡,二向色分光系統(tǒng)13為Notch filter,光譜探測系統(tǒng)22為拉曼光譜探測系統(tǒng)。如圖8所示,激光差動共焦圖譜顯微成像方法,其測試步驟如下:首先,柯勒照明系統(tǒng)38產生均勻白光,白光透過寬帶分光棱鏡39后,被保偏分光棱鏡40反射,經過物鏡10聚焦在被測樣品11上,白光被反射回原光路,經物鏡10后被保偏分光棱鏡40、寬帶分光棱鏡39分別反射后,經過第六聚光鏡41后進入第四探測器42,通過觀察第四探測器42中的圖像對測樣品11進行粗瞄,以確定被測樣品11需要觀測的區(qū)域對被測樣品11進行粗定位。然后,激光器2發(fā)出的光束經第一聚光鏡3、第一針孔4、第八聚光鏡后5準直擴束為平行光,光束經過徑向偏振光產生器6后成為徑向偏振光,徑向偏振光經光瞳濾波器7后光束被調制,透過保偏分光棱鏡8后,通過物鏡10形成壓縮光斑聚焦在被測樣品11上,并激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品11光譜特性的拉曼散射光,被測樣品11可通過增強拉曼光譜納米粒子等拉曼增強技術進行處理,以提高拉曼散射光的強度。移動被測樣品11,使瑞利光及對應被測樣品11不同區(qū)域的拉曼散射光被系統(tǒng)收集回原光路,經過物鏡10并透射過保偏分光棱鏡40后,被保偏分光棱鏡8反射進入探測部分,其中,拉曼散射光透射過Notch filterl3進入拉曼光譜探測系統(tǒng)22,拉曼光譜探測系統(tǒng)22為共焦拉曼光譜探測系統(tǒng),拉曼散射光被第四聚光鏡23會聚到第四針孔24,經過第五聚光鏡25會聚進入第一光譜儀26,拉曼散射光經入射狹縫27,平面反射鏡28和第一凹面反射聚光鏡29反射后到達光譜光柵30,光束經過光譜光柵30衍射后,被第二凹面反射聚光鏡31反射聚焦到出射狹縫32上,最后入射到第三探測器33。由于光柵的衍射作用,拉曼光譜中不同波長的光相互分離,從出射狹縫32出來的光線為單色光,當光譜光柵30轉動時,從出射狹縫32出射的光波長不同,通過監(jiān)測第三探測器33的響應值和光柵旋轉的角度即可得到被測樣品11的拉曼光譜;瑞利光被Notch filterl3反射進入差動共焦探測系統(tǒng)14,經保偏分光棱鏡15透射的瑞利光被分為兩束,經保偏分光棱鏡15反射的瑞利光被第二聚光鏡16聚焦,進入距第二聚光鏡16焦點前距離為M位置的第二針孔17后被第一探測器18接收;經保偏分光棱鏡15透射的瑞利光被第三聚光鏡19聚焦,進入距第三聚光鏡19焦點后距離為M的第三針孔20,繼而被第三針孔20后的第二探測器21接收。測量過程中,對被測樣品11進行軸向和橫向掃描時,差動共焦探測系統(tǒng)14中兩個第二探測器21和第一探測器18,分別測得反應被測樣品11凹凸變化的強度響應為V,U,+Um)和I2 ( V , U, -Um),將所得強度響應I1 ( V , U, +Um)和I2 ( V , U, -Um)傳送到差動相減模塊35進行差動相減處理,獲得差動共焦強度響應I ( V,u,uM):I ( V , u, uM) = I1 ( V , u, +uM) -12 ( V,u, _uM)(I)從而實現(xiàn)被測樣品11幾何位置的顯微層析成像,式(I)中,V為橫向歸一化光學坐標,U為軸向歸一化光學坐標,Um為針孔的離焦量;拉曼光譜探測系統(tǒng)22中第三探測器33探測到的載有被測樣品11光譜信息的拉曼散射光光譜信號為I ( λ ) ( λ為波長)。將I ( λ )、I ( V,u,uM)傳送到數據融合模塊36進行數據處理,從而獲得包含被測樣品11位置信息I ( V,u,uM)和光譜信息I(A)的四維測量信息I ( V,U,λ )。對被測樣品11沿X、y向掃描,物鏡10沿z向掃描,重復上述步驟,測得對應物鏡焦點位置附近的一組i個包含位置信息I ( V,U,uM)和光譜信息I ( λ )的序列測量信息(Ii(A), Ii(Vju)I ;利用可分辨區(qū)域δ i對應的位置信息Ii ( V,u,uM),找出對應δ i區(qū)域的光譜信息Ii(X)值,再依據V與橫向位置坐標(x,y)的關系以及u與軸向位置坐標z的關系,重構反映被測物微區(qū)S i三維尺度和光譜特性的信息Ii (xi; yi; Zi, Ai);對應最小可分辨區(qū)域δ min的三維尺度和光譜特性可由式(2)確定:
權利要求
1.光差動共焦圖譜顯微成像方法,其特征在于: a)通過激發(fā)光束產生系統(tǒng)(I)產生激發(fā)光,經過第一分光系統(tǒng)(8)、物鏡(10)后,聚焦在被測樣品(11)上,并激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品(11)光譜特性的拉曼散射光,激發(fā)出的拉曼散射光和瑞利光被系統(tǒng)收集回光路中,經過物鏡(10)后被第一分光系統(tǒng)(8)反射至二向色分光系統(tǒng)(13),經二向色分光系統(tǒng)(13)分光后,拉曼散射光和瑞利光相互分離,瑞利光被反射進入差動共焦探測系統(tǒng)(14),拉曼散射光透射進入光譜探測系統(tǒng)(22),利用差動共焦曲線(43)過零點與焦點位置精確對應這一特性,通過零點觸發(fā)來精確捕獲激發(fā)光斑焦點位置的光譜信息,實現(xiàn)高空間分辨的光譜探測; b)只對接收到的瑞利光信號進行差動相減處理時,系統(tǒng)可以進行高空間分辨的三維尺度層析成像;只對接收到的拉曼散射光的光譜信號進行處理時,系統(tǒng)可以進行光譜探測;同時對接收到的瑞利光和拉曼散射光的信號進行處理時,系統(tǒng)可以進行高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像,即被測樣品幾何位置信息和光譜信息的高空間分辨的“圖譜合一”; c)差動共焦曲線(43)過零點處精確對應物鏡(10)的焦點O,測量過程中可以實時對被測樣品(11)進行精確跟蹤定焦,保證被測樣品(11)在整個測量過程中始終處于焦點位置,抑制環(huán)境溫度和振動等因素對光譜測量的影響,從而提高測量精度; d)差動共焦曲線(43)過零點處對應測量物鏡(10)焦點O,此處聚焦光斑尺寸最小,探測的區(qū)域最小,線性區(qū)域BB’其他位置對應物鏡(10)的離焦區(qū)域,在焦前或焦后BB’區(qū)域內的聚焦光斑尺寸隨離焦量增大而增大,利用此特點,通過調整樣品的z向離焦量,并根據實際測量精度需求來控制聚焦光斑的尺寸,實現(xiàn)對樣品探測區(qū)域大小可控。
2.據權利I所述的激光差動共焦圖譜顯微成像方法,其特征在于:激發(fā)光束是偏振光束:線偏光、圓偏光、徑向偏振光;或是由光瞳濾波技術生成的結構光束,其與光瞳濾波技術聯(lián)用可以壓縮測量聚焦光斑尺寸,提高系統(tǒng)橫向分辨力。
3.據權利I所述的激光 差動共焦圖譜顯微成像方法,其特征在于:該系統(tǒng)還可以探測熒光、布里淵散射光、康普頓散射光等散射光譜。
4.光差動共焦圖譜顯微成像裝置,其特征在于:包括激發(fā)光束產生系統(tǒng)(I)、第一分光系統(tǒng)(8)、物鏡(10)、三維掃描工作臺(12)、二向色分光系統(tǒng)(13)、光譜探測系統(tǒng)(22)、差動共焦探測系統(tǒng)(14)及數據處理模塊(34);其中,第一分光系統(tǒng)(8)、物鏡(10)、三維掃描工作臺(12)沿光路依次放置在激發(fā)光束產生系統(tǒng)(I)出射方向,二向色分光系統(tǒng)(13)位于第一分光系統(tǒng)(8)的反射方向,光譜探測系統(tǒng)(22)位于二向色分光系統(tǒng)(13)的透射方向,差動共焦探測系統(tǒng)(14)位于二向色分光系統(tǒng)(13)的反射方向,數據處理模塊(34)與光譜探測系統(tǒng)(22)和差動共焦探測系統(tǒng)(14)連接,用于融合并處理光譜探測系統(tǒng)(22)與差動共焦探測系統(tǒng)(14)采集到的數據。
5.據權利4所述的激光差動共焦圖譜顯微成像裝置,其特征在于:光譜探測系統(tǒng)(22)是普通光譜探測系統(tǒng),包括沿光路依次放置的第七聚光鏡(46)、位于第七聚光鏡(46)焦點位置的第二光譜儀(47)及位于第二光譜儀(47)后的第五探測器(48),用于被測樣品的表層光譜探測;或是共焦光譜探測系統(tǒng),包括沿光路依次放置的第四聚光鏡(23)、位于第四聚光鏡(23)焦點位置的第四針孔(24)、位于第四針孔(24)后的第五聚光鏡(25)、位于第五聚光鏡(25)焦點位置的第一光譜儀(26)及位于第一光譜儀(26)后的第三探測器(33),提高系統(tǒng)信噪比和空間分辨力,以及對被測樣品的層析光譜探測。
6.據權利4所述的激光差動共焦圖譜顯微成像裝置,其特征在于:激發(fā)光束產生系統(tǒng)(I)還可以包括偏振調制器(6)及光瞳濾波器(7),用于產生偏振光及結構光束。
7.據權利6所述的激光差動共焦圖譜顯微成像裝置,其特征在于:用于壓縮激發(fā)光斑的光瞳濾波器(X)可以位于偏振調制器(6)與第一分光系統(tǒng)(8)之間,還可以位于第一分光系統(tǒng)⑶與物鏡(10)之間。
8.據權利4所述的激光差動共焦圖譜顯微成像裝置,其特征在于:激發(fā)光束產生系統(tǒng)(I)還可以放在第一分光系統(tǒng)(8)的反射方向,二向色分光系統(tǒng)(13)沿光路依次放在第一分光系統(tǒng)(8)的透射方向,光譜探測系統(tǒng)(22)位于二向色分光系統(tǒng)(13)的透射方向,差動共焦探測系統(tǒng)(14)位于二向色分光系統(tǒng)(13)的反射方向,數據處理模塊(34)連接差動共焦探測系統(tǒng)(14)與光譜探測系統(tǒng)(22)。
9.據權利4所述的激光差動共焦圖譜顯微成像裝置,其特征在于:還可以包括第四分光系統(tǒng)(40)及位于第四分光系統(tǒng)(40)反射方向的顯微觀察系統(tǒng)(37),用于被測樣品粗貓;其中,第四分光系統(tǒng)(40)可以位于激發(fā)光束產生系統(tǒng)(I)與第一分光系統(tǒng)(8)之間,還可以位于第一分光系統(tǒng)(8)與物鏡(10)之間。
10.據權利4所述的激光差動共焦圖譜顯微成像裝置,其特征在于:數據處理模塊(34)包括用于處理位置信息的差 動相減模塊(35)和用于融合位置信息和光譜信息的數據融合模塊(36)。
全文摘要
本發(fā)明屬于光學顯微成像及光譜測量技術領域,涉及一種高空間分辨激光差動共焦圖譜成像方法與裝置。本發(fā)明的核心思想是融合差動共焦探測和光譜探測技術,并利用二向色分光系統(tǒng)(13)對瑞利光和拉曼散射光進行無損分離,其中,拉曼散射光進行光譜探測,瑞利光進行幾何位置探測,利用差動共焦曲線(43)過零點與焦點位置精確對應這一特性,通過過零點觸發(fā)來精確捕獲激發(fā)光斑焦點位置的光譜信息,實現(xiàn)高空間分辨的光譜探測,構成一種可實現(xiàn)樣品微區(qū)高空間分辨光譜探測的方法和裝置。本發(fā)明具有定位準確,高空間分辨,光譜探測靈敏度高和測量聚焦光斑尺寸可控等優(yōu)點,在生物醫(yī)學、法庭取證等領域有廣泛的應用前景。
文檔編號G01B11/24GK103091299SQ20131002695
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月21日 優(yōu)先權日2013年1月21日
發(fā)明者趙維謙, 崔晗, 邱麗榮, 王允 申請人:北京理工大學