專(zhuān)利名稱(chēng)：基于鉑納米顆粒模擬酶的免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料和生物分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析方法。
背景技術(shù)：
免疫分析技術(shù)因其獨(dú)有的特異性，在臨床診斷和環(huán)境檢測(cè)等方面得到廣泛地應(yīng)用。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)自1971年建立以來(lái)，便由于其所具有的快速、靈敏、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，得到迅速的發(fā)展和應(yīng)用，逐步成為應(yīng)用最廣泛的免疫分析方法之一，涉及免疫學(xué)檢驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域。但是，如果它所用到的蛋白酶的一些本質(zhì)的缺點(diǎn)可以被克服，比如說(shuō)蛋白酶容易失活、穩(wěn)定性不高等，那么酶聯(lián)免疫分析的性能將可能被進(jìn)一步的提高。此夕卜，提取和純化蛋白酶往往是耗時(shí)、昂貴和復(fù)雜的；制備和純化酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物也是非常復(fù)雜和昂貴的。因此，人們?cè)谂Φ貙ふ姨烊坏鞍酌傅母黝?lèi)替代品(即人工模擬酶)用于免疫分析。納米科學(xué)和納米技術(shù)的出現(xiàn)，為人工模擬酶的發(fā)展開(kāi)闊了新的視野。納米材料由于它們具有比表面積大等優(yōu)點(diǎn)使他們成為很吸引人的高效催化劑。到目前為止，很多納米材料已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有模擬酶的催化活性。比如，四氧化三鐵磁性納米顆粒、帶正電荷的金納米顆粒、氧化石墨烯和單壁碳納米管等已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有本質(zhì)的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性。[J. Xieet al. , TrAC Anal. Chem. , 2012, 39: 114]而且已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道一些納米材料模擬酶可以替代天然蛋白酶應(yīng)用于免疫分析，展現(xiàn)出優(yōu)秀的穩(wěn)定性。但是，目前這些納米材料模擬酶催化活性還不夠高，往往需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的修飾才能標(biāo)記到抗體上。這些不足導(dǎo)致了基于這些納米材料模擬酶的免疫分析的靈敏度往往不夠高、檢測(cè)線(xiàn)不夠低，使得其無(wú)法達(dá)到實(shí)際臨床免疫學(xué)檢測(cè)低豐度蛋白的需求。因此在模擬酶免疫分析中，催化活性高、穩(wěn)定性好、易于標(biāo)記生物分子的納米材料模擬酶標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)具有極其重要的意義。在這些納米材料模擬酶中，鉬納米顆粒因其著名的優(yōu)秀催化性能成為關(guān)注的重點(diǎn)。依據(jù)已有的報(bào)道，鉬納米顆粒具有高效的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性，可以催化過(guò)氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺顯藍(lán)色[M. Ma et al. , Colloids Surf. A, 2011，373: 6]。而且鉬納米顆粒易于與生物分子偶聯(lián)，具有良好的生物相容性、水溶性和化學(xué)穩(wěn)定性。在納米生物檢測(cè)領(lǐng)域中，鉬納米顆粒不僅可以作為信號(hào)載體放大檢測(cè)信號(hào)，還可以作為標(biāo)記物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)[J. Zhou et al. , Biosens. Bioelectron. 2012, 35: 394] [J. Zhang etal. , Biosens. Bioelectron. 2010, 26: 418]。因此,利用鉬納米顆粒作為過(guò)氧化物模擬酶代替辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行比色免疫分析具有重大的實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析新方法，該分析方法主要用于血清中低豐度蛋白含量的檢測(cè)。利用鉬納米顆粒模擬酶催化活性高、穩(wěn)定性高、易于標(biāo)記等特點(diǎn)，在對(duì)其進(jìn)行抗體標(biāo)記形成納米探針復(fù)合物之后，可以建立一種無(wú)酶、高靈敏且性能穩(wěn)定的免疫分析方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析方法包括如下步驟
(1)制備鉬納米顆粒模擬酶；
(2)將鉬納米顆粒模擬酶標(biāo)記到抗體上制成鉬標(biāo)抗體納米探針；
(3)將已包被在酶標(biāo)微孔板上的抗體、待測(cè)樣品以及鉬標(biāo)抗體納米探針通過(guò)夾心型免疫分析反應(yīng)模式形成免疫復(fù)合物；將所述免疫復(fù)合物與游離的鉬標(biāo)抗體納米探針進(jìn)行分離。(4)加入鉬納米顆粒模擬酶的最適底物液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)微孔的吸光度值。再根據(jù)吸光度值的強(qiáng)弱用以定量待測(cè)樣品。步驟(I)和(2)所述的鉬納米顆粒模擬酶是通過(guò)硼氫化鈉還原氯鉬酸鉀得到的；所述的鉬納米顆粒模擬酶粒徑為3 5nm,其表面帶負(fù)電荷。步驟(2)所述鉬納米顆粒模擬酶與抗體的結(jié)合為正負(fù)電荷相吸作用結(jié)合、疏水作用結(jié)合和化學(xué)鍵作用結(jié)合。步驟(3)所述酶標(biāo)微孔板是高親和力的96孔聚苯乙烯微孔板；所述待測(cè)樣品為大分子目標(biāo)物；所述夾心型免疫分析模式的完成采取兩步法即待測(cè)樣品、已包被在酶標(biāo)微孔板上的抗體混合發(fā)生免疫反應(yīng)形成一種免疫復(fù)合物，在與鉬標(biāo)抗體納米探針混合發(fā)生免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物。 步驟(4)所述鉬納米顆粒模擬酶的最適底物液為含有濃度為7. 63M的過(guò)氧化氫和濃度為O. 92ImM的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鈉_磷酸緩沖液(pH 4. O)。本發(fā)明的基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析方法的測(cè)定原理是，首先將抗體包被到微孔板上，加入待測(cè)樣品，再加入鉬標(biāo)抗體納米探針?lè)跤瑥亩谖⒖装迳闲纬煽贵w-抗原-抗體夾心型免疫復(fù)合物。當(dāng)待測(cè)樣品含量低時(shí)，結(jié)合在微孔板上的鉬標(biāo)抗體納米探針就少，顯色反應(yīng)減弱；吸光度值降低，反之結(jié)合在微孔板上的鉬標(biāo)抗體納米探針就多，顯色反應(yīng)增強(qiáng)，吸光度值升高。從而達(dá)到定量分析的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下
(I)本發(fā)明提供了一種將鉬納米顆粒作為過(guò)氧化物模擬酶代替辣根過(guò)氧化物酶應(yīng)用于比色免疫分析檢測(cè)大分子目標(biāo)物(主要用于血清中低豐度蛋白含量的檢測(cè))的方法。本方法具有檢測(cè)線(xiàn)低、靈敏度和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。(2)本發(fā)明使用無(wú)機(jī)納米材料作為模擬酶，克服了傳統(tǒng)生物活性酶標(biāo)記方法中生物酶易失活、易變性等缺點(diǎn)，可望為疾病早期診斷等重要領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)，具備顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。(3)與辣根過(guò)氧化物酶相比，鉬納米顆粒是一種無(wú)機(jī)納米材料，它性能更穩(wěn)定、制備方法更簡(jiǎn)單、成本更低、標(biāo)記抗體更容易，并且易于大規(guī)模制備。(4)與已報(bào)道的基于模擬酶的免疫分析相比，本發(fā)明的基于鉬納米顆粒模擬酶的比色免疫分析具有更低的檢測(cè)線(xiàn)、更高的靈敏度。本發(fā)明方法對(duì)于兔免疫球蛋白G的檢出限為O. 4 ng ι ΙΛ線(xiàn)性范圍是5 ng mL—1到250 ng mL'


圖1是鉬納米顆粒模擬酶的透射電鏡 圖2是抗體(a)、鉬納米顆粒(b)和鉬標(biāo)抗體納米探針復(fù)合物(C)的紅外光譜 圖3是基于鉬納米顆粒模擬酶免疫分析的示意 圖4是基于鉬納米顆粒模擬酶免疫分析顯色檢測(cè)兔免疫球蛋白G標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施示例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但是不能以此限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11.鉬納米顆粒模擬酶制備
在攪拌的狀態(tài)下，往IOmL的90°C的二次水中加入400mL濃度為IOmM的氯鉬酸鉀(K2PtCl6)溶液。I分鐘后，往上述混合液中加入IOOmL l%(w/w)的檸檬酸鈉，然后再過(guò)I分鐘，加入400mL新鮮配制的含有l(wèi)%(w/w)檸檬酸鈉和O. 08%(w/w)硼氫化鈉的混合液。將上述反應(yīng)液置于90°C油浴中加熱10分鐘，得到鉬納米顆粒模擬酶貯備液。通過(guò)透射電鏡圖表征所制備的鉬納米顆粒模擬酶，如圖1所示。從圖1可以看出，所制備的鉬納米顆粒大小分布均勻,粒徑分布在3飛nm之間。2.鉬標(biāo)抗體納米探針復(fù)合物的制備
首先，將1. OmL所制備的鉬納米顆粒模擬酶用濃度為O. OlM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到8-9。第二，將20 μ L濃度為100 μ g/mL的羊抗兔IgG抗體加入上述鉬納米顆粒溶液中，然后將混合液在4°C攪拌下孵育5小時(shí)。第三，5小時(shí)后，在混合液中加入10 μ L濃度為10wt %的牛白蛋白溶液，然后在4°C下孵育過(guò)夜封閉鉬納米顆粒上剩余的結(jié)合位點(diǎn)。最后，將上述混合液在SOOOrmp轉(zhuǎn)速和4°C下離心20min，小心去除上層清夜，得到的沉淀再分散在ImL含有1. O wt %牛白蛋白和O.1 wt %疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH=7. 4)中，儲(chǔ)存于4°C。通過(guò)紅外光譜表征所制備的鉬標(biāo)抗體納米探針復(fù)合物，如圖2所示。有圖2可知，抗體在1645 CnT1左右處有特征的紅外吸收峰(曲線(xiàn)a)，鉬納米顆粒在1645 cnT1左右處沒(méi)有明顯紅外吸收峰(曲線(xiàn)b)，鉬標(biāo)抗體納米探針復(fù)合物在1645 cnT1左右處出現(xiàn)抗體的特征吸收峰(曲線(xiàn)C)，表明抗體成功標(biāo)記到鉬納米顆粒上。3.比色免疫分析檢測(cè)兔IgG (本實(shí)施例以兔免疫球蛋白G (兔IgG)作為模型目標(biāo)分析物)
圖3是本發(fā)明的基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析過(guò)程示意圖。首先，在高親和力的96孔酶標(biāo)微孔板上每孔加入50 μ 的羊抗兔IgG (濃度為I μ g mL—1，包被緩沖液為O. 05M的碳酸鹽緩沖液，pH 9. 6)在4°C下孵育過(guò)夜，然后將上述的微孔板用PBST緩沖液洗滌3次，再每孔加入300 41^封閉液(1.0 wt %牛白蛋白)置于37°C下孵育I h后用PBST緩沖液洗滌3次。其次，加入50μ —系列的兔IgG標(biāo)準(zhǔn)樣品在37 °C下孵育I h，用PBST緩沖液洗滌4次，然后加入50 μ 上述所制備的鉬標(biāo)抗體納米探針復(fù)合物置于37°C下孵育I h后用PBST緩沖液洗滌4次。最后，每孔加入IOOPL底物液(含有7. 63 M的過(guò)氧化氫和O. 921mM的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺， 所用緩沖液為pH 4. O的檸檬酸鈉-磷酸緩沖液)，室溫下顯色5 min后，用酶標(biāo)儀在650 nm處讀取吸光度值。根據(jù)吸光度值和兔IgG濃度變化的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)于兔血清中免疫球蛋白G的檢出限為0.4 ng ml/1,線(xiàn)性范圍是5 ng ml/1至250 ng mL'該方法與傳統(tǒng)生物活性酶標(biāo)記的方法相比，本發(fā)明使用無(wú)機(jī)納米材料作為模擬酶，克服了傳統(tǒng)生物活性酶標(biāo)記方法中生物酶易失活、易變性等缺點(diǎn)，可望為疾病早期診斷等重要領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析方法，其特征在于所述方法包括如下步驟 (1)制備鉬納米顆粒模擬酶； (2)將鉬納米顆粒模擬酶標(biāo)記到抗體上制成鉬標(biāo)抗體納米探針； (3)將已包被在酶標(biāo)微孔板上的抗體、待測(cè)樣品以及鉬標(biāo)抗體納米探針通過(guò)夾心型免疫分析反應(yīng)模式形成免疫復(fù)合物；將所述免疫復(fù)合物與游離的鉬標(biāo)抗體納米探針進(jìn)行分離； (4)加入鉬納米顆粒模擬酶的最適底物液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)微孔的吸光度值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析方法，其特征在于步驟(1)和(2)所述的鉬納米顆粒模擬酶是通過(guò)硼氫化鈉還原氯鉬酸鉀得到的；所述的鉬納米顆粒模擬酶粒徑為3飛nm，其表面帶負(fù)電荷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析方法，其特征在于步驟(2)所述鉬納米顆粒模擬酶與抗體的結(jié)合為正負(fù)電荷相吸作用結(jié)合、疏水作用結(jié)合和化學(xué)鍵作用結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析方法，其特征在于步驟(3)所述酶標(biāo)微孔板是高親和力的96孔聚苯乙烯微孔板；所述待測(cè)樣品為大分子目標(biāo)物；所述夾心型免疫分析模式的完成采取兩步法即待測(cè)樣品、包被在酶標(biāo)微孔板上的抗體混合發(fā)生免疫反應(yīng)形成一種免疫復(fù)合物，再與鉬標(biāo)抗體納米探針混合發(fā)生免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于鉬納米顆粒模擬酶的免疫分析方法，其特征在于步驟(4)所述鉬納米顆粒模擬酶的最適底物液為含有濃度為7. 63M的過(guò)氧化氫和濃度為O.921mM的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鈉-磷酸緩沖液；所述檸檬酸鈉_磷酸緩沖液的PH值為4.0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于鉑納米顆粒模擬酶的免疫分析方法，其包括如下步驟1、通過(guò)硼氫化鈉還原法制備鉑納米顆粒模擬酶。2、將鉑納米顆粒模擬酶標(biāo)記到抗體上，制成鉑標(biāo)抗體納米探針。3、將已包被在酶標(biāo)微孔板上的抗體、待測(cè)樣品以及鉑標(biāo)抗體納米探針通過(guò)夾心型免疫分析反應(yīng)模式形成免疫復(fù)合物；4、加入顯色底物液進(jìn)行顯色檢測(cè)。本方法可用于比色免疫檢測(cè)大分子目標(biāo)物，本發(fā)明涉及納米探針復(fù)合物制備工藝簡(jiǎn)單，成本低，免疫檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、顯色快速、靈敏度高，為臨床免疫學(xué)檢測(cè)提供了一種無(wú)酶、靈敏且性能穩(wěn)定的新方法。
文檔編號(hào)G01N33/545GK103063832SQ20131000186
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者唐點(diǎn)平, 高壯強(qiáng), 楊黃浩, 陳國(guó)南 申請(qǐng)人:福州大學(xué)