一種齊考諾肽及其雜質(zhì)的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于有效分離和分析齊考諾肽及其雜質(zhì)的高效液相色譜（HPLC）方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種齊考諾肽及其雜質(zhì)的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于有效分離和分析齊考諾肽及其雜質(zhì)的高效液相色譜(HPLC)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]齊考諾肽(Ziconotide)是一種鈣離子通道抑制劑，具有鎮(zhèn)痛的作用。齊考諾肽對(duì)那些使用阿片類(lèi)及非留體類(lèi)鎮(zhèn)痛劑無(wú)效的嚴(yán)重慢性疼痛患者會(huì)產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用，而且不會(huì)讓人上癮和產(chǎn)生抗藥性。
[0003]專(zhuān)利CN101709082中提及了一種固相合成齊考諾肽的制備工藝。在齊考諾肽的化學(xué)合成過(guò)程中，存在幾個(gè)關(guān)鍵的中間步驟，所以在最終產(chǎn)品中可能殘留相應(yīng)的中間體，因此建立分離分析方法對(duì)其中間體及雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制是非常必要的。
[0004]齊考諾肽及其雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)如下:
[0005]I)齊考諾肽
[0006]Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-GIy-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-CyS-NH2, [二硫鍵(Disulfidebridges): 1-16, 8-20, 15-25]
[0007]2)雜質(zhì) A
[0008]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asn-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 [二硫鍵:1-16，8-20, 15-25]
[0009]2)雜質(zhì) B
[0010]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-D-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-CyS-NH2 [ 二硫鍵:1-16，8-20, 15-25]
[0011]3)雜質(zhì) C
[0012]D-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 [二硫鍵:1-16, 8-20, 15-25]
[0013]4)雜質(zhì) D
[0014]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr- Y -Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 [二硫鍵:1-16, 8-20, 15-25]
[0015]5)雜質(zhì) E
[0016]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-D-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cy s-Arg-Ser-Gly-Ly s-Cy S-NH2 [ 二硫鍵:1-16，8-20, 15-25]
[0017]6)雜質(zhì) F
[0018]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-D-Thr-Gly-Ser-Cy s-Arg-Ser-Gly-Ly s-Cy S-NH2 [ 二硫鍵:1-16，8-20, 15-25]
[0019]從以上各化合物結(jié)構(gòu)來(lái)看，其結(jié)構(gòu)非常相似，而從極性角度考慮，又有部分雜質(zhì)與齊考諾肽存在較大的極性差異，因此要想在同一色譜柱上實(shí)現(xiàn)各組分的完全有效分離是非常困難的。[0020]無(wú)疑，上述化合物在采用不同的色譜條件時(shí)，均可以單獨(dú)的分離檢測(cè)，但選用多個(gè)色譜條件分別分離檢測(cè)在人力物力上都存在極大的浪費(fèi)。因此，有必要尋找一種既能有效分離相似結(jié)構(gòu)化合物又能有效檢出弱極性物質(zhì)的色譜條件。本發(fā)明人通過(guò)大量研究，發(fā)現(xiàn)了適宜的色譜條件，可有效的分離分析以上各化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021]本發(fā)明提供了一種分離分析齊考諾肽及各雜質(zhì)的高效液相色譜法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)齊考諾肽與其中間體及雜質(zhì)的分離和分析測(cè)定。
[0022]本發(fā)明所說(shuō)的用高效液相色譜法分析分離齊考諾肽雜質(zhì)及其最終產(chǎn)品的方法，是選用柱色譜法，以緩沖液與有機(jī)溶劑不同比例配制的流動(dòng)相A、流動(dòng)相B為流動(dòng)相，梯度洗脫。用該方法可以快速有效的分離分析齊考諾肽和中間體及各雜質(zhì)。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中使用的流動(dòng)相的流速為流速為0.8-1.2ml/min。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相的流速為1.0ml/min。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中使用的色譜柱的填料為十八烷基鍵合硅膠填料。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑選自下列化合物:甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑為乙腈與甲醇。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑為乙腈。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液選自:磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉和磷酸氫二銨緩沖液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液為磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液為磷酸二氫鉀。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述緩沖液的pH為6-7ο在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液的PH為6.2-6.8。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液的pH為6.5。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述pH是使用三乙胺或磷酸調(diào)節(jié)。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液的濃度為2-50mmol/L。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液的濃度為10-30mmol/L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液的濃度為20mmol/L。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相A為含有0-15% (體積比)上述有機(jī)溶劑的緩沖液溶液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相A為含乙腈/緩沖液(10:90)(體積比)的溶液。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相A為含乙腈/磷酸二氫鉀緩沖液(10:90)(體積比)的溶液。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相B為含有40 - 60% (體積比)上述緩沖液的有機(jī)溶液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相B為含緩沖液/乙腈(50:50)的溶液。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相B為含磷酸二氫鉀緩沖液/乙腈(50:50)(體積比)的溶液。
[0032]本發(fā)明的梯度可以根據(jù)流動(dòng)相A、流動(dòng)相B各自所含的緩沖液、有機(jī)溶劑比例不同而改變。其改變的最終依據(jù)是:
[0033]0-25分鐘時(shí)，兩相混合后流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例為5%_20% ;在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩相混合后流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例為11.5-18%，例如11.5%、12%、13.6%、14%、16%和18%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩相混合后流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例為14-16%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在0-25分鐘期間，流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑的比例可以是變化的，例如勻速增加的；或者可以是不變的；
[0034]在25-40分鐘時(shí)間段內(nèi)，逐漸增加流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例至25%~35%,保持10分鐘。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例增加至27-32.5%，例如27%、28%和32.5%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例增加至28%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在25-40分鐘期間，流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例是勻速增加的。
[0035]然后在50-55分鐘時(shí)間段內(nèi)，將有機(jī)溶劑比例逐漸降回5-15%。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例降低至11.5-14%，例如11.5%、12%、14%和15%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例降低至14%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在50-55分鐘分鐘期間，流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例是勻速降低的。
[0036]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)流動(dòng)相A為0.01M磷酸二氫鉀水溶液(pH = 6.5):乙腈=90:10，流動(dòng)相B為0.01M磷酸二氫鉀水溶液(pH = 6.5):乙腈=50:50時(shí)，可表述為下表1所示。
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種分離和分析齊考諾肽及各雜質(zhì)的方法，包括: 在柱色譜法中，將分別以緩沖液與有機(jī)溶劑按不同比例配制的流動(dòng)相A和流動(dòng)相B按不同比例混合作為流動(dòng)相，梯度洗脫含齊考諾肽及各雜質(zhì)的樣品， 其中所述流動(dòng)相A為含有0-15體積％有機(jī)溶劑的緩沖液溶液，所述流動(dòng)相B為含有40-60體積％緩沖液的有機(jī)溶液； 其中所述齊考諾肽及各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)如下: 1)齊考諾肽
Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2, 二硫鍵:1-16, 8-20, 15-25 ； 2)雜質(zhì)A
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asn-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20, 15-25 ； 2)雜質(zhì)B
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-D-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25 ； 3)雜質(zhì)C
D-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25 ； 4)雜質(zhì)D
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr- Y -Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25 ； 5)雜質(zhì)E
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-D-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25 ； 6)雜質(zhì)F
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-D-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述柱色譜法的色譜柱填料為十八烷基鍵合硅膠填料。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流速為0.8-1.2ml/min ;優(yōu)選地，所述流速為1.0ml/min。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑選自下列化合物:甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇；優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為乙腈與甲醇；更優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為乙腈。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述緩沖液指由磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉或磷酸氫二銨水溶液；優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉；更優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸二氫鉀。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述緩沖液的pH為至6-7;優(yōu)選地，所述緩沖液的pH為6.2-6.8 ;更優(yōu)選地，所述緩沖液的pH為6.5。
7.權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述緩沖液的濃度為2mmOl/L-50mmOl/L;優(yōu)選地，所述緩沖液的濃度為10-30mmol/L ;更優(yōu)選地，所述緩沖液的濃度為20mmol/L。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流動(dòng)相A為含有O- 15%的權(quán)利要求4所述有機(jī)溶劑的緩沖液溶液；所述流動(dòng)相B為含有0-45%的權(quán)利要求5所述的緩沖液的有機(jī)溶液。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述流動(dòng)相A為乙腈:緩沖液=10:90)的溶液，流動(dòng)相B為含緩沖液:乙腈=50:50的溶液。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述梯度為: 0-25分鐘時(shí)間段內(nèi)，流動(dòng)相A和流動(dòng)相B混合后的流動(dòng)相中有機(jī)溶劑比例為5-20%，優(yōu)選11.5-18%，例如11.5%、12%、13.6%、14%、16%和18%，更優(yōu)選14-16%，在此期間有機(jī)溶劑的比例可以是變化的，例如勻速增加的，或者可以是不變的； 在25-40分鐘時(shí)間段內(nèi)，改變流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合比例逐漸將有機(jī)溶劑比例增加至25% -35%,并保持10分鐘，優(yōu)選27-32.5%，例如27%,28%和32.5%，更優(yōu)選28% ； 在50-55分鐘時(shí)間段內(nèi)，改變流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合比例逐漸將有機(jī)溶劑比例降回 5-15%，優(yōu)選 11.5-14%，例如 11.5%、12%、14% 和 15%，更優(yōu)選 14% ； 優(yōu)選地，所述增 加或減少均為勻速增加或減少。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103884808SQ201210562697
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】康旭, 宓鵬程, 馬亞平, 袁建成 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司