專利名稱：一種乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合了免疫磁微粒分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是以隱蔽形式存在HBV核心中的一種可溶性蛋白，其編碼基因相互重疊，是HBcAg的亞成分。在感染HBV后，HBeAg可與HBsAg同時(shí)或稍后出現(xiàn)于血中，其消失則稍早于HBsAg。HBsAg僅存在于HBsAg陽性者的血液中，通常伴有肝內(nèi)HBV DNA的復(fù)制，血中存在較多Dane顆粒和HBV DNA聚合酶活性增高，因此，HBeAg陽性是病毒活動(dòng)性復(fù)制的重要指標(biāo)，傳染性高。急性肝炎患者若HBeAg持續(xù)陽性10周以上，則易于轉(zhuǎn)為持續(xù)感染。目前用于檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。酶聯(lián)免疫分析法存在靈敏度低，線性范圍窄、不易實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化等方法學(xué)限制因素?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是在酶聯(lián)免疫分析法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)線性范圍寬、操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)因其具有上述諸多優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在實(shí)際的免疫檢測(cè)中，由于待測(cè)樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測(cè)物，是臨床檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測(cè)技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不影響被分離細(xì)胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場(chǎng)作用下可定向運(yùn)動(dòng)，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)乙型肝炎病毒e抗原準(zhǔn)確和高精確地定量測(cè)定。本發(fā)明同時(shí)還提供一種乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒的制備方法，該方法工藝穩(wěn)定，成本低，且所得試劑盒的精密度高。癌抗原所用的試劑盒的簡(jiǎn)便和低成本的制備方法。一種乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括
第一試劑含熒光素標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液；第二試劑含堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液；磁分離劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。優(yōu)選地，該堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體由堿性磷酸酶與乙型肝炎病毒e抗原抗體通過交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(Succinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexane-l-Carbo, SMCC)和 2_ 亞氨基硫燒鹽酸鹽(2-1minothiolane HCl, 2-1T)連接構(gòu)成。進(jìn)一步地，所述磁微粒試劑中，包被有熒光素抗體的磁微粒由熒光素抗體與磁微粒通過偶聯(lián)劑相化學(xué)偶聯(lián)。進(jìn)一步地，所述第一試劑中的熒光素標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的濃度為O. 5^1 μ g/mL，所述第一試劑的pH為7-9 ;所述第二試劑中的堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的濃度為O. 5"! μ g/mL,所述第二試劑的pH為7_9。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括有其它檢測(cè)所需的試齊U，例如底物溶液。但是諸如底物溶液等其它試劑可以另行購(gòu)買或配制，因此，雖然試劑盒中可以包括這些試劑，但它們對(duì)于本發(fā)明試劑盒來說并非必不可少。本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是一種上述的乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述第一試劑、所述第二試劑以及磁分離劑的步驟，其中所述第二試劑的制備過程如下①將乙型肝炎病毒e抗原抗體加入交聯(lián)劑2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中室溫靜置后，再加入甘氨酸溶液，再次室溫靜置，收集活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗體，于疒8°C下保存?zhèn)溆茫?②將堿性磷酸酶溶液加入交聯(lián)劑4- (N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置，收集活化后的堿性磷酸酶，于疒8°C下保存?zhèn)溆?；③將上述步驟①所得活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗體與步驟②所得活化后的堿性磷酸酶混合，靜置反應(yīng)，使生成堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用Supperdex200凝膠純化柱純化，選擇具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得所述第二試劑；其中，所述的乙型肝炎病毒e抗原抗體、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%,且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg。優(yōu)選地，步驟①中，取乙型肝炎病毒e抗原抗體，加入交聯(lián)劑2-1T溶液溶解，室溫靜置10mirT30min，加入甘氨酸溶液，室溫靜置2 lOmin，用G-25凝膠純化柱除鹽，收集活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗體，于2-8°C保存?zhèn)溆?。?yōu)選地，步驟②中，取濃度大于等于5mg/mL的堿性磷酸酶溶液，加入交聯(lián)劑SMCC溶液，室溫靜置2(T40min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，于2_8°C保存?zhèn)溆?。?yōu)選地，步驟③中，將上述活化的乙型肝炎病毒e抗原抗體與活化的堿性磷酸酶按分子摩爾比為I I 2混合，于2-8°C條件下靜置12-24h。其中適當(dāng)pH值的緩沖液可以為例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。進(jìn)一步地，所述的第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的pH為擴(kuò)10的緩沖液，然后按照熒光素與乙型肝炎病毒e抗原抗體的分子比為2(Γ200:1的比例，將所述含有熒光素的PH為擴(kuò)10的緩沖液與乙型肝炎病毒e抗原抗體的pH為擴(kuò)10的緩沖液混合，混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標(biāo)記的抗乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得所述的第一試劑。其中適當(dāng)pH值的緩沖液可以為例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。進(jìn)一步地，所述磁分離劑的制備方法如下將含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的存在下，室溫反應(yīng)2 18小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述的磁分離劑。其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5^2 μ m,每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量不低于O. 4mmol ;所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價(jià)大于1:100萬。優(yōu)選地，上述的具有適當(dāng)pH值的緩沖液為含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。本發(fā)明所述的熒光素可以是已知的各種熒光素，常用的有例如異硫氰酸熒光素，四乙基羅丹明，四甲基異硫氰酸羅丹明等。本發(fā)明同時(shí)還提供了一種采用上述的試劑盒應(yīng)用于乙型肝炎病毒e抗原定量檢測(cè)的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(I)免疫反應(yīng)在檢測(cè)管中加入待測(cè)樣本原液，依次加入第一試劑和第二試劑，混勻，在25 40°C下進(jìn)行第一次溫育，然后加入磁分離試劑，混勻，在25 40°C下進(jìn)行第二次 溫育；(2)洗滌使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；(3)加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度在檢測(cè)管中加入堿性磷酸酶催化的化學(xué)發(fā)光底物，去除磁場(chǎng)，充分混懸后檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度值。進(jìn)一步地，步驟(I)中所述第一次溫育的時(shí)間可以為l(T40min，通常為30min ;第二次溫育的時(shí)間可以為5 20min,通常為lOmin。由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，采取SMCC和2-1T作為交聯(lián)劑進(jìn)行堿性磷酸酶和乙型肝炎病毒e抗原抗體的偶聯(lián)時(shí)，具有和其它交聯(lián)劑相比更高的偶聯(lián)效率，在降低制備成本的同時(shí)，有利于提高檢測(cè)效果。因此，本發(fā)明的試劑盒中的三種試劑均可以通過穩(wěn)定的制備工藝制備得至IJ，生產(chǎn)成本低，且由于制備工藝的穩(wěn)定性，試劑盒分析批間差異小，檢測(cè)的分析間精密度提聞;2.本發(fā)明的試劑盒中的含有堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液的制備方法，能夠有效將乙型肝炎病毒e抗原抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，偶聯(lián)效率高，進(jìn)一步降低試劑盒的成本低和確保試劑盒的檢測(cè)效果。3、采取本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確度好，精密度高，靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，樣品無需預(yù)稀釋，操作簡(jiǎn)單省時(shí)。與采用進(jìn)口試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法在成本上具有顯著的優(yōu)勢(shì)。


圖1為測(cè)試校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為靈敏度評(píng)價(jià)擬合曲線；圖3為血清樣本檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性(其中橫坐標(biāo)X為實(shí)施例4制備得的試劑盒樣本測(cè)值，濃度單位為U/mL,縱坐標(biāo)γ為Diasorin公司試劑盒樣本測(cè)值,濃度單位為U/mL)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1第一試劑的制備(I)材料與儀器以磷酸鹽緩沖液保存的乙型肝炎病毒e抗原單克隆抗體(純度超過95wt%，濃度為2mg/mL);異硫氰酸熒光素(FITC)，碳酸鈉等試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；G_25凝膠純化柱采購(gòu)自GE公司。(2)制備步驟①用O. Γ0. 2mol/L pH 9. (TlO. O的碳酸鹽緩沖液配制O. 5mg/mL的FITC溶液；②按照乙型肝炎病毒e抗原抗體與FITC分子比為1:20的比例在抗體溶液中加入步驟①所配FITC溶液，混合均勻，室溫靜置12h小時(shí)，反應(yīng)生成e抗原抗體-FITC連接物；③將經(jīng)過步驟②的反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的FITC，得到含有乙型肝炎病毒e抗原抗體-FITC連接物(即FITC標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體)的溶液；④將步驟③所得含有乙型肝炎病毒e抗原抗體-FITC連接物的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA)pH 8. O的 O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到乙型肝炎病毒e抗原抗體-FITC連接物濃度為O. 5^1 μ g/mL,即為第一試劑。實(shí)施例2第二試劑的制備(I)材料與儀器以磷酸鹽緩沖液保存的乙型肝炎病毒e抗原單克隆抗體(純度超過95wt%，濃度為2mg/mL);以磷酸緩沖液保存的堿性磷酸酶(ALP溶液，ALP純度為約99%，比活性為約1500U/mg，濃度為10mg/mL);交聯(lián)劑SMCC, 2-1T購(gòu)自THERMO公司，TRIS等化學(xué)試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；G-25凝膠純化柱為GE公司產(chǎn)品。(2)制備步驟①取Img e抗原抗體，加入10mg/mL的偶聯(lián)劑2-1T溶液2-4 μ L，室溫靜置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10 μ L，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后CA125抗體，2-8 °C保存?zhèn)溆?；②?. 5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20 μ L，室溫靜置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后ALP，2-8°C保存?zhèn)溆?；③將上述活化的癌抗原e抗原抗體與活化的ALP混合，2_8°C條件下靜置12_24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化偶聯(lián)物，獲得CA125抗體-ALP連接物濃溶液，2_8°C保存?zhèn)溆?④將e抗原抗體-ALP連接物濃溶液用含0. 5%牛血清白蛋白(BSA) pH8. O的0. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到0. 5-1 μ g/mL，完成第二試劑的制備。實(shí)施例3磁分離試劑的制備(I)材料與儀器
磁微粒的懸浮液磁微粒含量5wt%，磁微粒含羧基(COOH)活性集團(tuán)，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩爾(mmol)，具有超順磁性，直徑在O. 5_2μπι之間?？笷ITC抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，純度為90wt%以上，稀釋效價(jià)超過1:100萬；2-嗎啉乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、TRIS和其他試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純。(2)制備步驟①取IOOmg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用O. 05mol/L, pH 4. 5 5MES緩沖液IOmL重懸；②加入2 4mg的抗FITC抗體，室溫混懸3(T60min ；③加入O. 5 ImL新鮮配制的10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸2 12h ；④磁分離，去上清，用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA) pH 8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液重懸到lmg/mL, pH 8. O,即為磁分離試劑。實(shí)施例4乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒該試劑盒包括按照實(shí)施例1方法制備的第一試劑(濃度為O. 75 μ g/mL), 5OmL ；按照實(shí)施例2方法制備的第二試劑(濃度為O. 75 μ g/mL), 50mL ；按照實(shí)施例3方法制備的磁分離試劑50mL。實(shí)施例5乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒該試劑盒包括按照實(shí)施例1方法制備的第一試劑(濃度為O. 5 μ g/mL), 50mL ；按照實(shí)施例2方法制備的第二試劑(濃度為O. 5 μ g/mL), 50mL ；按照實(shí)施例3方法制備的磁分離試劑50mL。實(shí)施例6乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒該試劑盒包括按照實(shí)施例1方法制備的第一試劑(濃度為I μ g/mL), 50mL ；按照實(shí)施例2方法制備的第二試劑(濃度為I μ g/mL), 50mL ；按照實(shí)施例3方法制備的磁分離試劑50mL。實(shí)施例7采取實(shí)施例4的試劑盒進(jìn)行乙型肝炎病毒e抗原的定量檢測(cè)(I)檢測(cè)步驟①免疫反應(yīng)在檢測(cè)管中加入30 μ L待測(cè)樣本(血清)原液，然后加入50μ L第一試劑，50 μ L第二試劑，混勻，37± I ° C條件下溫育30min ;加入50 μ L磁分離試劑，混勻，37±1°C條件下溫育IOmin ；②洗滌使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入300 μ L的清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；此步驟重復(fù)3次；③加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度在檢測(cè)管中加入100 μ L堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物溶液(北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司APCL-1 )，震蕩使磁微粒充分混懸，在5min內(nèi)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。(2)繪制校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖1。
(3)靈敏度評(píng)價(jià)檢測(cè)“O”濃度樣本，重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并計(jì)算M+2SD值，根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M+2SD值帶入上述方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為最低檢測(cè)限。本方法的靈敏度不小于2U/mL。其中A點(diǎn)發(fā)光值分別參見表1:表I
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，所述試劑盒包括第一試劑含熒光素標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液；第二試劑含堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液；磁分離劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體由堿性磷酸酶與乙型肝炎病毒e抗原抗體通過交聯(lián)劑4- (N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽連接構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于所述第一試劑中的熒光素標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的濃度為O.5^1 μ g/mL，所述第一試劑的pH為7-9 ;所述第二試劑中的堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的濃度為O. 5"! μ g/mL,所述第二試劑的pH為7_9。
4.一種如權(quán)利要求3所述的乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述含有熒光素標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液、所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液以及所述包被有熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的步驟，其特征在于所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液的制備過程如下①將乙型肝炎病毒e抗原抗體加入交聯(lián)劑2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中室溫靜置后，再加入甘氨酸溶液，再次室溫靜置，收集活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗體，于2l°C下保存?zhèn)溆?；②將堿性磷酸酶溶液加入交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置，收集活化后的堿性磷酸酶，于疒8°C下保存?zhèn)溆?；③將上述步驟①所得活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗體與步驟②所得活化后的堿性磷酸酶混合，靜置反應(yīng)，使生成堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用Supperdex200凝膠純化柱純化,選擇具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得所述第二試劑；其中，所述的乙型肝炎病毒e抗原抗體、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過lOOOu/mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟①中，取乙型肝炎病毒e抗原抗體，加入偶聯(lián)劑2-1T溶液溶解，室溫靜置10mirT30min，加入甘氨酸溶液，室溫靜置2^10min,用G-25凝膠純化柱除鹽，收集活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗體，于2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于步驟②中，取濃度大于等于5mg/mL的堿性磷酸酶溶液，加入4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置2(T40min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，于2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的pH為CIO的緩沖液，然后按照熒光素與乙型肝炎病毒e抗原抗體的分子比為2(Γ200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為擴(kuò)10的緩沖液與乙型肝炎病毒e抗原抗體的pH為CIO的緩沖液混合，混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得第一試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述磁分離劑的制備方法如下使含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的存在下，室溫反應(yīng)2 18小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述的磁分離劑；其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5 2 μ m，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量大于等于O. 4mmol ;所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%,稀釋效價(jià)大于1:100萬。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或7或8所述的制備方法，其特征在于所述的具有適當(dāng)pH值的緩沖液為含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。
10.采用權(quán)利要求Γ3中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒用于對(duì)乙型肝炎病毒e抗原定量檢測(cè)的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)免疫反應(yīng)在檢測(cè)管中加入待測(cè)樣本原液，依次加入第一試劑和第二試劑，混勻，在25 4(TC下進(jìn)行第一次溫育，然后加入磁分離試劑，混勻，在25 4(TC下進(jìn)行第二次溫育；(2)洗滌使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；(3)加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度在檢測(cè)管中加入堿性磷酸酶催化的化學(xué)發(fā)光底物，去除磁場(chǎng)，充分混懸后檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法，試劑盒包括含有熒光素標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液、包被有熒光素抗體的磁微粒的懸浮液，以及含有堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液。本發(fā)明使得能夠以更低成本和更高準(zhǔn)確度和精密度對(duì)乙型肝炎病毒e抗原進(jìn)行定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103048454SQ20121055017
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者于大為, 程曉蕾 申請(qǐng)人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司