專(zhuān)利名稱(chēng)：天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥檢測(cè)方法，具體涉及一種天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
麝香具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛藥理活性，現(xiàn)有研究顯示麝香的抗炎活性與麝香中特有的糖肽有關(guān)，不同文獻(xiàn)報(bào)道其抗炎糖肽分子量各不相同，不同來(lái)源的麝香其多肽成分有顯著性差異。常規(guī)的電泳分析體系Tris-甘氨酸-SDS-PAGE電泳分析分辨大分子物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍在l(T200kDa，對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量小于IOkDa的多肽分辨率低。利用含有SDS的凝膠中加入高濃度脲時(shí)可利用SDS-PAGE對(duì)小分子多肽進(jìn)行分析的分離效果不甚理想，且重現(xiàn)性較差，且小分子多肽在固定染色的過(guò)程中容易丟失。并且由于麝香樣品蛋白含量較低，且麝香為貴重藥材，在進(jìn)行鑒別研究中不能采用先提取出其蛋白質(zhì)成分，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)的方法；另一方面，麝香樣品 提取物中含有大量的色素類(lèi)成分，難以在微量樣品檢測(cè)中有效去除。研究中發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的人工麝香凝膠電泳方法不適用于天然麝香樣品，故采用Tricine-SDS-PAGE電泳，建立麝香多肽電泳方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法。本發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:1、天然麝香凝膠電泳分析樣品的制備稱(chēng)取天然麝香樣品0.003、.008重量份，加入I體積份乙醚，超聲提取15 25min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加0.05體積份電泳上樣緩沖液(IX)，超聲提取15 25min，在4500rpm, 10°C條件下離心15 25min,取上清,加0.02%溴酹藍(lán),沸水浴3 8min,即得電泳樣品;2、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析方法(I)電泳溶液準(zhǔn)備:(a)去離子水溶解100 150重量份Tris，用HCl調(diào)PH值至7-9，定容至500體積份，制得正極緩沖液(IOX);(b)去離子水溶解50 70重量份Tris，8(Tl00重量份1^(^1^，3 8重量份505，定容至500體積份，制得負(fù)極緩沖液(10 X );(C)去離子水溶解150 200重量份Tris，l 2重量份SDS，用HCl調(diào)PH值至疒9，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液(3X )；(d) 40^60%丙烯酰胺，Γ2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(e)4(T60%丙烯酰胺，Γδ%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液；
(f)0.2 I體積份lmol/L, PH為6.8的Tris-HCl, 2^4體積份甘油，I 3體積份10%SDS，0.6^1體積份β -巰基乙醇，0.5^1.5體積份1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10體積份，制得上樣緩沖液^X);(g) 0.2 I體積份lmol/L, PH為6.8的Tris-HCl，2 4體積份甘油，I 3體積份10%SDS，0.6 1體積份β -巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60體積份，制得上樣緩沖液(IX);(2)凝膠制備:分離膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，0.2^0.6重量份甘油，0.5^1.5體積份6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2 4體積份，臨用時(shí)加入0.005、.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005、.002體積份TEMED ；夾層膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ)0.5^1.5體積份，0.5^0.8體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2 4體積份，臨用時(shí)加入0.005、.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005、.002體積份TEMED ；濃縮膠2體積份:0.4^0.6體積份凝膠緩沖液(3X)，0.Γθ.2體積份3C儲(chǔ)液，去離子水稀釋至廣3體積份，臨用時(shí)加入0.005、.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005 0.002 體積份 TEMED ；(3 )電泳條件:120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部Icm處(4)染色方法采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制:固定液:量取 甲醇30-60體積份，冰醋酸5-20體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；染色液:稱(chēng)取0.5^1.0重量份AgNO3溶于3飛體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入0.36%Na0H 15 30體積份，再加入氨水2體積份混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至100體積份；顯色液:0.3^0.8體積份I %檸檬酸，0.03、.08體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份；終止液:量取冰醋酸I體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；3、具體染色步驟:(a)電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定0.5^1.5h，每l(T30min換一次液；(b)棄去固定液，凝膠以雙蒸水中漂洗3次，每次5 15min ；(c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色l(T20min ；(d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗2 4min ；(e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液；(f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色；(g)在蒸餾水中漂洗凝膠0.5^1.5h ；(h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存；從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量約為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶.
本發(fā)明天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法優(yōu)選如下步驟:1、天然麝香凝膠電泳分析樣品的制備
稱(chēng)取天然麝香樣品0.003重量份，加入I體積份乙醚，超聲提取20min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加0.05體積份電泳上樣緩沖液(IX),超聲提取20min,在4500rpm,10°C條件下離心20min,取上清,加0.02%溴酹藍(lán),沸水浴5min,即得電泳樣品；2、Tricine-SDS-PA重量份E凝膠電泳分析方法(I)電泳溶液準(zhǔn)備:(a)去離子水溶解100重量份Tris，用HCl調(diào)PH值至7.5，定容至500體積份，制得正極緩沖液(IOX);(b)去離子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS，定容至500體積份，制得負(fù)極緩沖液(10 X );(c)去離子水溶解160重量份Tris，1.5重量份SDS，用HCl調(diào)PH值至7.8，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液(3X )；(d) 56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(e) 52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(f) 0.8 體積份 lmol/L, PH 為 6.8 的 Tris-HCl, 2 體積份甘油，3 體積份 10%SDS,0.7體積份β -巰基乙醇，1.5體積份1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10體積份，制得上樣緩沖液(6Χ)；(g) 0.4 體積份 lmol/L, PH 為 6.8 的 Tris-HCl，2 體積份甘油，2.5 體積份 10%SDS,I體積份β -巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60體積份，制得上樣緩沖液(IX);(2)凝膠制備:分離膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，0.6重量份甘油，1.5體積份6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至4體積份，臨用時(shí)加入0.005體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.001體積份TEMED ；夾層膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，0.5體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2.5體積份，臨用時(shí)加入0.005體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.001體積份的TEMED ；濃縮膠2體積份:取上述制得的0.6體積份凝膠緩沖液(3Χ)，0.2體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2體積份，臨用時(shí)加入0.005體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.001 體積份 TEMED ；(3 )電泳條件:120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部Icm處；(4)染色方法采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制:固定液:量取甲醇50體積份，冰醋酸5體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；染色液:稱(chēng)取0.5重量份AgNO3溶于3體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入0.36%Na0H 18體積份，再加入氨水1.5體積份混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌,全部加入后,加雙蒸水至100體積份；顯色液:0.8體積份I %檸檬酸，0.06體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份；終止液:量取冰醋酸I體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；
3、具體染色步驟:(a)電泳結(jié)束后,將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定Ih,每IOmin換一次液；(b)棄去固定液,凝膠以雙蒸水中漂洗3次,每次IOmin ；(c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色20min ；(d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗3min ；(e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液；(f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色；(g)在蒸餾水中漂洗凝膠Ih ；(h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存；從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量約為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶.
本發(fā)明天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法還可以?xún)?yōu)選如下步驟:1、天然麝香凝膠電泳分析樣品的制備稱(chēng)取天然麝香樣品0.008重量份，加入I體積份乙醚，超聲提取18min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加0.05體積份電泳上樣緩沖液(IX),超聲提取22min,在4500rpm,1(TC條件下離心22min,取上清,加0.02%溴酹藍(lán),沸水浴4min,即得電泳樣品；2、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析方法(I)電泳溶液準(zhǔn)備:(a)去離子水溶解150重量份Tris，用HCl調(diào)PH值至9，定容至500體積份，制得正極緩沖液(IOX);(b)去離子水溶解70重量份Tris，95重量份Tricine，3重量份SDS，定容至500體積份，制得負(fù)極緩沖液(10 X );(c)去離子水溶解180重量份Tris，I重量份SDS，用HCl調(diào)PH值至8.5，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液(3X )；(d) 45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(e) 55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(f) 0.4 體積份 lmol/L，PH為 6.8 的 Tris-HCl，3.5 體積份甘油，1.5 體積份 10%SDS，0.8體積份β -巰基乙醇，0.7體積份1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10體積份，制得上樣緩沖液(6Χ)； (g) 0.8 體積份 lmol/L，PH為 6.8 的 Tris-HCl，2.5 體積份甘油，1.8 體積份 10%SDS，0.8體積份β-巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60體積份，制得上樣緩沖液(IX);(2)凝膠制備:分離膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，0.3重量份甘油，1.2體積份6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至3.5體積份，臨用時(shí)加入0.009體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0015體積份TEMED ；夾層膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ)1.2體積份，0.55體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至3.5體積份，臨用時(shí)加入0.008體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.001體積份TEMED ；濃縮膠2體積份:0.45體積份凝膠緩沖液(3 X)，0.18體積份3C儲(chǔ)液，去離子水稀釋至1. 5體積份，臨用時(shí)加入O. 008體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和O. 0008體積份TEMED ；(3)電泳條件120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部Icm處；(4)染色方法采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制固定液量取甲醇30體積份，冰醋酸20體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；染色液稱(chēng)取O. 6重量份AgNO3溶于3. 5體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入
O.36%Na0H 25體積份，再加入氨水1. 8體積份混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌,全部加入后,加雙蒸水至100體積份； 顯色液0. 7體積份I %檸檬酸，O. 04體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份；終止液量取冰醋酸I體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；3、具體染色步驟(a)電泳結(jié)束后,將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定1. 2h,每15min換一次液；(b)棄去固定液,凝膠以雙蒸水中漂洗3次,每次15min ；(c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色15min ；(d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗2min ；(e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液；(f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色；(g)在蒸餾水中漂洗凝膠O. 5h ；(h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存；從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量約為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶.本發(fā)明所述重量份與體積份的關(guān)系為g/ml的關(guān)系。本發(fā)明方法采用電泳上樣緩沖液直接提取分析，每個(gè)樣品的用量?jī)H需幾毫克，該方法為天然麝香的鑒別建立了一種簡(jiǎn)便可行的輔助手段。


附圖1 :天然麝香多肽電泳圖譜；A = Marker+胰島素；B J:天然麝香，批號(hào)依次為I 5，7 10下面實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例一天然麝香多肽電泳指紋圖譜分析取天然麝香，批號(hào)依次為1-5，7-10，按照實(shí)施例一的方法，檢測(cè)天然麝香的多肽電泳圖譜，電泳結(jié)果顯示，在研究的批次天然麝香中，除I個(gè)批次未能顯示74kDa蛋白條帶外(F泳道)，其余批次均含有分子量為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶。結(jié)果見(jiàn)附圖1 (其中A = Marker+胰島素；B J:天然麝香，批號(hào)依次為I 5，7 10)結(jié)論從電泳圖譜可以看出，天然磨香電泳圖譜中具有分子量約為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果。實(shí)施例1 :1、天然麝香凝膠電泳分析樣品的制備
稱(chēng)取天然磨香樣品0.003g,加入Iml乙醚,超聲提取20min,離心去上清,揮干乙醚，不溶物加0.05ml電泳上樣緩沖液(IX)，超聲提取20min，在4500rpm，10°C條件下離心20min,取上清，加0.02%溴酚藍(lán)，沸水浴5min，即得電泳樣品；2、Tricine-SDS-PAgE凝膠電泳分析方法(I)電泳溶液準(zhǔn)備:(a)去離子水溶解IOOg Tris，用HCl調(diào)PH值至7.5，定容至500ml，制得正極緩沖液(IOX)；(b)去離子水溶解55g Tris, 90g Tricine, 8g SDS,定容至500ml,制得負(fù)極緩沖液(IOX)；(c)去離子水溶解160g Tris,1.5g SDS,用HCl調(diào)PH值至7.8，定容至500ml，制得凝膠緩沖液(3X);(d) 56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(e) 52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(f)0.8ml lmol/L，PH 為 6.8 的 Tris-HCl，2ml 甘油，3ml 10%SDS，0.7ml β -巰基乙醇，1.5ml 1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10ml，制得上樣緩沖液^X)；(g) 0.4ml lmol/L，PH 為 6.8 的 Tris-HCl，2ml 甘油，2.5ml 10%SDS，Iml β -巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60ml，制 得上樣緩沖液(IX);(2)凝膠制備:分離膠3ml:取上述制得的凝膠緩沖液(3X) lml，0.6g甘油，1.5ml 6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至4ml，臨用時(shí)加入0.005ml的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0Olml TEMED ；夾層膠3ml:取上述制得的凝膠緩沖液(3X) lml，0.5ml 3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2.5ml,臨用時(shí)加入0.005ml的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0Olml的TEMED ；濃縮膠2ml:取上述制得的0.6ml凝膠緩沖液(3X)，0.2ml 3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2ml，臨用時(shí)加入0.005ml的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0Olml TEMED ；(3)電泳條件:120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部Icm處；(4)染色方法采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制:固定液:量取甲醇50ml，冰醋酸5ml，加雙蒸水稀釋至IOOml ；染色液:稱(chēng)取0.5g AgNO3溶于3ml雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入0.36%Na0H 18ml,再加入氨水1.5ml混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至IOOml ；顯色液:0.8ml I %檸檬酸，0.06ml甲醛，加雙蒸水至IOOml ；終止液:量取冰醋酸1ml，加雙蒸水稀釋至IOOml ；3、具體染色步驟:(a)電泳結(jié)束后,將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定Ih,每IOmin換一次液；(b)棄去固定液,凝膠以雙蒸水中漂洗3次,每次IOmin ；(c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色20分鐘；
(d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗3min ；(e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液；(f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色；(g)在蒸餾水中漂洗凝膠Ih ；(h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存。從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量約為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶.
實(shí)施例2:1、養(yǎng)殖麝香凝膠電泳分析樣品的制備稱(chēng)取養(yǎng)殖磨香樣品0.008g,加入Iml乙醚,超聲提取20min,離心去上清,揮干乙醚，不溶物加0.05ml電泳上樣緩沖液(IX)，超聲提取22min，在4500rpm，10°C條件下離心22min,取上清，加0.02%溴酚藍(lán)，沸水浴4min，即得電泳樣品；2、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析方法(I)電泳溶液準(zhǔn)備:(a)去離子水溶解150g Tris，用HCl調(diào)PH值至9，定容至500ml，制得正極緩沖液(IOX)；(b)去離子水溶解70g Tris, 95gTricine, 3g SDS,定容至500ml,制得負(fù)極緩沖液(IOX)；(c)去離子水溶解180g Tris,lg SDS，用HCl調(diào)PH值至8.5，定容至500ml，制得凝膠緩沖液(3X);(d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(f) 0.4ml lmol/L，PH 為 6.8 的 Tris-HCl，3.5ml 甘油，1.5ml 10%SDS, 0.8ml β -巰基乙醇，0.7ml 1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10ml，制得上樣緩沖液^X)；(g) 0.8ml lmol/L，PH 為 6.8 的 Tris-HCl，2.5ml 甘油，2.5ml 10%SDS，0.8ml β -巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60ml，制得上樣緩沖液(IX);(2)凝膠制備:分離膠3ml:取上述制得的凝膠緩沖液(3X) lml，0.3g甘油，1.2ml6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至3.5ml，臨用時(shí)加入0.009ml的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0015mlTEMED ；夾層膠3ml:取上述制得的凝膠緩沖液(3X)1.2ml, 0.55ml3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至3.5ml,臨用時(shí)加入0.008ml的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0Olml TEMED ；濃縮膠2ml:0.45ml凝膠緩沖液(3X)，0.18ml 3C儲(chǔ)液，去離子水稀釋至1.5ml，臨用時(shí)加入0.008ml的10%過(guò)硫 酸銨溶液和0.0008ml TEMED ；(3)電泳條件:120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部Icm處；(4)染色方法采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制:固定液:量取甲醇30ml，冰醋酸20ml，加雙蒸水稀釋至IOOml ；染色液:稱(chēng)取0.6gAgN03溶于3.5ml雙蒸水中；取潔凈燒杯,加入0.36%Na0H 25ml,再加入氨水1.8ml混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至IOOml ；顯色液0. 7ml I %梓檬酸，O. 04ml甲醒，加雙蒸水至IOOml ；終止液量取冰醋酸1ml，加雙蒸水稀釋至IOOml ；3、具體染色步驟(a)電泳結(jié)束后,將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定1. 2h,每15min換一次液；(b)棄去固定液,凝膠以雙蒸水中漂洗3次,每次15min ；(c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色15min ；(d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗2min ；(e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液；(f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色；(g)在蒸餾水中漂洗凝膠O. 5h ；(h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存。從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量約為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶。
權(quán)利要求
1.一種天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟: A、天然麝香凝膠電泳分析樣品的制備 稱(chēng)取天然麝香樣品0.003、.008重量份，加入I體積份乙醚，超聲提取15 25min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加0.05體積份電泳上樣緩沖液(IX)，超聲提取15 25min，在4500rpm, 10°C條件下離心15 25min,取上清,加0.02%溴酹藍(lán),沸水浴3 8min,即得電泳樣品; B、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析方法 (O電泳溶液準(zhǔn)備: (a)去離子水溶解100 150重量份Tris，用HCl調(diào)PH值至7_9，定容至500體積份，制得正極緩沖液(IOX); (b)去離子水溶解5(Γ70重量份Tris，8(Tl00重量份Tricine，3 8重量份SDS，定容至500體積份，制得負(fù)極緩沖液(10 X ); (c)去離子水溶解15(Γ200重量份Tris，Γ2重量份SDS，用HCl調(diào)PH值至7 9，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液(3 X ); (d)40^60%丙烯酰胺，Γ2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液； (e)40^60%丙烯酰胺，Γ5%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液； (f)0.2 I體積份ImoI/L, PH為6.8的Tris-HCl，2 4體積份甘油，I 3體積份10%SDS,0.6^1體積份β巰基乙醇，0.5^1.5體積份1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10體積份，制得上樣緩沖液(6Χ)； (g)0.2 I體積份ImoI/L, PH為6.8的Tris-HCl，2 4體積份甘油，I 3體積份10%SDS,0.6 1體積份β_巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60體積份，制得上樣緩沖液(IX)； (2)凝膠制備: 分離膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，0.2^0.6重量份甘油，0.5^1.5體積份6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2 4體積份，臨用時(shí)加入0.005、.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005、.002體積份TEMED ； 夾層膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ)0.5^1.5體積份，0.5^0.8體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2 4體積份，臨用時(shí)加入0.005、.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005、.002體積份TEMED ； 濃縮膠2體積份:0.4^0.6體積份凝膠緩沖液(3X)，0.Γ0.2體積份3C儲(chǔ)液，去離子水稀釋至廣3體積份，臨用時(shí)加入0.005、.02體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0005、.002體積份TCMED ； (3)電泳條件:120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部Icm處 (4)染色方法 采用靈敏度高的銀染，以下`溶液臨用前配制: 固定液:量取甲醇30-60體積份，冰醋酸5-20體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份； 染色液:稱(chēng)取0.5^1.0重量份AgNO3溶于3飛體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入0.36%Na0H 15 30體積份，再加入氨水2體積份混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至100體積份； 顯色液:0.3^0.8體積份I %檸檬酸，0.03、.08體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份；終止液:量取冰醋酸I體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份； C、具體染色步驟: (a)電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定0.5^1.5h，每l(T30min換一次液； (b)棄去固定液，凝膠以雙蒸水中漂洗3次，每次5 15min； (c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色I(xiàn)OlOmin； (d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗2 4min； (e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液； (f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色； (g)在蒸餾水中漂洗凝膠0.5^1.5h ； (h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存； 從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶。
2.如權(quán)利要求1所述的天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟: A、天然麝香凝膠電泳分析樣品的制備 稱(chēng)取天然麝香樣品0.003重量份，加入I體積份乙醚，超聲提取20min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加0.05體積份電泳上樣緩沖液(IX)，超聲提取20min，在4500rpm，10°C條件下離心20min,取上清,加0.02%溴酹藍(lán),沸水浴5min,即得電泳樣品； B、Tricine-SDS-PA重量份E凝膠電泳分析方法 (O電泳溶液準(zhǔn)備: (a)去離子水溶解100重量份Tris，用HCl調(diào)PH值至7.5，定容至500體積份，制得正極緩沖液(IOX); (b)去離子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS，定容至500體積份，制得負(fù)極緩沖液(IOX); (c)去離子水溶解160重量份Tris，1.5重量份SDS，用HCl調(diào)PH值至7.8，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液(3 X ); (d)56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液； (e)52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液； (f)0.8體積份lmol/L, PH為6.8的Tris-HCl，2體積份甘油，3體積份10%SDS, 0.7體積份β -巰基乙醇，1.5體積份1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10體積份，制得上樣緩沖液^X); (g)0.4體積份lmol/L, PH為6.8的Tris-HCl，2體積份甘油，2.5體積份10%SDS, I體積份巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60體積份，制得上樣緩沖液(IX); (2)凝膠制備: 分離膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，0.6重量份甘油，1.5體積份6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至4體積份，臨用時(shí)加入0.005體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.001體積份TEMED ； 夾層膠3體積份:取上述 制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，0.5體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2.5體積份，臨用時(shí)加入0.005體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.001體積份的TEMED ；濃縮膠2體積份:取上述制得的0.6體積份凝膠緩沖液(3 X)，0.2體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至2體積份，臨用時(shí)加入0.005體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.001體積份TCMED ； (3)電泳條件:120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部Icm處； (4)染色方法 采用靈敏度高的銀染，以下 溶液臨用前配制: 固定液:量取甲醇50體積份，冰醋酸5體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份； 染色液:稱(chēng)取0.5重量份AgNO3溶于3體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入0.36%Na0H18體積份，再加入氨水1.5體積份混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至100體積份； 顯色液:0.8體積份1 %檸檬酸，0.06體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份； 終止液:量取冰醋酸1體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份； C、具體染色步驟: (a)電泳結(jié)束后,將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定Ih,每IOmin換一次液； (b)棄去固定液，凝膠以雙蒸水中漂洗3次,每次1Omin； (c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色20min； (d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗3min； (e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液； (f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色； (g)在蒸餾水中漂洗凝膠Ih； (h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存； 從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶。
3.如權(quán)利要求1所述的天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟: A、天然麝香凝膠電泳分析樣品的制備 稱(chēng)取天然麝香樣品0.008重量份，加入I體積份乙醚，超聲提取18min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加0.05體積份電泳上樣緩沖液(IX)，超聲提取22min，在4500rpm，10°C條件下離心22min,取上清,加0.02%溴酹藍(lán),沸水浴4min,即得電泳樣品； B、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析方法 (O電泳溶液準(zhǔn)備: (a)去離子水溶解150重量份Tris，用HCl調(diào)PH值至9，定容至500體積份，制得正極緩沖液(IOX); (b)去離子水溶解70重量份Tris，95重量份Tricine，3重量份SDS，定容至500體積份，制得負(fù)極緩沖液(1OX); (c)去離子水溶解180重量份Tris，I重量份SDS’用HCl調(diào)PH值至8.5，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液(3X); (d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲(chǔ)液； (e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲(chǔ)液；(f)0.4 體積份 lmol/L, PH 為 6.8 的 Tris_HCl，3.5 體積份甘油，1.5 體積份 10%SDS,0.8體積份β -巰基乙醇，0.7體積份1%溴酚藍(lán)，加蒸餾水補(bǔ)足10體積份，制得上樣緩沖液(6Χ)；(g)0.8 體積份 lmol/L, PH 為 6.8 的 Tris-HCl，2.5 體積份甘油，1.8 體積份 10%SDS, 0.8體積份β -巰基乙醇，加蒸餾水補(bǔ)足60體積份，制得上樣緩沖液(IX); (2)凝膠制備: 分離膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，0.3重量份甘油，1.2體積份6C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至3.5體積份，臨用時(shí)加入0.009體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0015體積份TEMED ； 夾層膠3體積份:取上述制得的凝膠緩沖液(3 X)1.2體積份，0.55體積份3C丙烯酰胺儲(chǔ)液，去離子水稀釋至3.5體積份，臨用時(shí)加入0.008體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.001體積份TCMED ； 濃縮膠2體積份:0.45體積份凝膠緩沖液(3X)，0.18體積份3C儲(chǔ)液，去離子水稀釋至1.5體積份，臨用時(shí)加入0.008體積份的10%過(guò)硫酸銨溶液和0.0008體積份TEMED ； (3)電泳條件:120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)距凝膠底部Icm處； (4)染色方法 采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制: 固定液:量取甲醇30體積份，冰醋酸20體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份； 染色液:稱(chēng)取0.6重量份AgNO3溶于3.5體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入0.36%Na0H25體積份，再加入氨水1.8體積份混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至100體積份； 顯色液:0.7體積份I %檸檬酸，0.04體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份； 終止液:量取冰醋酸I體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份； C、具體染色步驟: (a)電泳結(jié)束后,將凝膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定1.2h,每15min換一次液； (b)棄去固定液，凝膠以雙蒸水中漂洗3次，每次15min； (c)將膠移入一個(gè)干凈的容器內(nèi)，染色液中輕搖染色15min； (d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗2min； (e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液； (f)將膠轉(zhuǎn)移至終止液終止染色； (g)在蒸餾水中漂洗凝膠0.5h ； (h)進(jìn)行凝膠掃描或?qū)⒛z進(jìn)行干膠保存； 從電泳圖譜可以看出，天然麝香電泳圖譜中具有分子量為74kDa、67kDa的蛋白染色條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種中藥檢測(cè)方法，具體涉及一種天然麝香的多肽電泳圖譜檢測(cè)方法。本發(fā)明采用電泳上樣緩沖液直接提取分析，每個(gè)樣品的用量?jī)H需幾毫克，該方法為天然麝香的鑒別建立了一種簡(jiǎn)便可行的輔助手段。
文檔編號(hào)G01N27/447GK103076382SQ20121047017
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者潘杰, 黃進(jìn)明, 于娟, 洪緋, 袁慧君 申請(qǐng)人:漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司