專利名稱：雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞毒支原體是家禽最常見的病原菌之一。該病在規(guī)?；u場(chǎng)中經(jīng)常緩慢流行，給養(yǎng)雞業(yè)造成的主要損失是發(fā)病雞群的死淘率明顯上升；肉雞和生長(zhǎng)雞的發(fā)育受阻、飼料報(bào)酬降低；產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋下降；隨著我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)集約化程度的提高，雞毒支原體的流行勢(shì)頭愈加猛烈，繼發(fā)感染其他疾病，近年來常有呼吸道疾病混合感染為主的疾病致使大量雞死亡，且抗生素的頻繁使用，使得耐藥性增強(qiáng)，給本病的防治帶來很大的困難，因此對(duì)該病的預(yù)防也越來越重要。目前在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用滅活疫苗免疫是控制雞毒支原體的有效辦法。檢驗(yàn)疫苗效力的方法是免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，判斷氣囊病變積分情況。上述實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果時(shí)常因主觀因素偏差造成檢驗(yàn)結(jié)果常有誤差，并且強(qiáng)毒攻擊也存在生物安全隱患，易散毒。本發(fā)明可用血清學(xué)測(cè)抗體效價(jià)的方法替代本動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，安全可靠，具有普遍推廣的意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，包括如下步驟:I)用雞毒支原體滅活疫苗免疫雞后25-35天后采血并分離血清；2)用血清學(xué)方法(ELISA方法或HI方法)測(cè)定血清的抗體效價(jià)替代免疫攻毒保護(hù)。優(yōu)選地，本發(fā)明所述雞毒支原體滅活疫苗免疫方法為皮下注射或肌肉注射。優(yōu)選地,本發(fā)明所述免疫劑量為I羽份，每羽份的量為0.2ml 0.6ml。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述MG抗體ELISA(ELISA，MG Ab)試劑盒為美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)(試劑包括:包被的微量反應(yīng)板、樣品稀釋液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)二抗、底物溶液和終止液)，購(gòu)自北京愛德士世紀(jì)元亨有限公司。ELISA檢測(cè)方法按IDEXX MG抗體ELISA(ELISA,MG Ab)試劑盒方法進(jìn)行。優(yōu)選地，本發(fā)明所述血凝抑制效價(jià)的測(cè)定方法，包括如下步驟:I)雞毒支原體血球凝集試驗(yàn):HA抗原二倍系列稀釋。將30 μ I雞紅細(xì)胞懸液加入含有30μ I稀釋抗原的反應(yīng)孔內(nèi)，充分振蕩，在室溫靜置30min，判定結(jié)果時(shí)將反應(yīng)板傾斜與水平呈45°C角，對(duì)照孔內(nèi)和HA陰性孔的紅細(xì)胞完全沉淀到孔底中心，呈淚珠樣流淌；HA陽(yáng)性孔的紅細(xì)胞均勻分布在孔底或呈鋸齒樣凝集，使紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該抗原的HA效價(jià)；2)雞毒支原體血凝抑制試驗(yàn):在96孔V型微量反應(yīng)板，每行第I孔開始，每孔加入30μ I稀釋液至12孔，分別在1、11孔加入待檢血清30 μ 1，從第一孔開始倍比稀釋血清至第10孔，棄去30 μ 1，向I 11孔加入4ΗΑ單位抗原30 μ 1，充分振蕩，37°C溫箱靜置15min，每孔加入1% V/V雞紅細(xì)胞懸液30 μ 1，輕輕混勻，室溫靜置30min，判定結(jié)果時(shí)將反應(yīng)板傾斜45°C角，紅細(xì)胞完全沉淀到孔底中心呈淚珠樣流淌為HI陽(yáng)性，紅細(xì)胞均勻分布在孔底不流動(dòng)者為HI陰性，完全抑制紅細(xì)胞凝集的最高稀釋倍數(shù)為待檢血清的HI抗體效價(jià)。優(yōu)選地，本發(fā)明所述免疫后的血清ELISA抗體水平，S/P值> 0.6時(shí)，疫苗判為合格。優(yōu)選地，本發(fā)明所述免疫后的血清HI抗體水平，HI值> 4Log2時(shí)，疫苗判為合格。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述免疫后的血清HI抗體水平、ELISA抗體水平和免疫攻毒保護(hù)率二者相互之間均呈正相關(guān)。優(yōu)選地，本發(fā)明所述方法不但在雞毒支原體滅活疫苗單苗中使用，而且在雞毒支原體滅活疫苗所有聯(lián)苗中也可使用。本發(fā)明的另一方面在于本發(fā)明所述雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法在雞毒支原體滅活疫苗的質(zhì)量控制中的應(yīng)用。優(yōu)選地,本發(fā)明所述疫苗的質(zhì)量控制包括免疫攻毒保護(hù)率、疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定、免疫期限的測(cè)定和臨床監(jiān)測(cè)。技術(shù)效果首先，本發(fā)明采用了血清學(xué)的方法替代免疫攻毒保護(hù)的方法來評(píng)價(jià)疫苗的免疫效力。該方法減少免后攻毒看氣囊病變積分的主觀性及避免散毒，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性強(qiáng)、批間差異小。其次，本發(fā)明檢測(cè)方法不但在雞毒支原體滅活疫苗單苗中使用，而且在雞毒支原體滅活疫苗所有聯(lián)苗中也可使用。該方法的建立為雞毒支原體滅活疫苗聯(lián)苗的研制開辟了綠色通道。最后，本發(fā)明首次公開了血清學(xué)方法測(cè)定雞毒支原體滅活疫苗抗體效價(jià)跟免疫攻毒保護(hù)之間存在相關(guān)性。該方法為本病的免疫攻毒保護(hù)、疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定、免疫期限的測(cè)定和臨床監(jiān)測(cè)等提供了強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)，對(duì)現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)有重要的指導(dǎo)意義。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法一、疫苗免疫用40日齡SPF雞20只，其中10只頸背部皮下或大腿部肌肉注射免疫I羽份，另10只不免疫作對(duì)照。30天后采血，分離血清，測(cè)定ELISA抗體水平或HI抗體效價(jià)。二、雞毒支原體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)1、雞毒支原體ELISA試驗(yàn)購(gòu)買MG抗體ELISA (ELISA，MG Ab)試劑盒:美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)(試劑包括:包被的微量反應(yīng)板、樣品稀釋液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)二抗、底物溶液和終止液)，北京愛德士世紀(jì)元亨有限公司。ELISA檢測(cè)方法按IDEXX MG抗體ELISA (ELISA，MG Ab)試劑盒方法進(jìn)行。2、雞毒支原體血凝抑制(HI)試驗(yàn):I)、雞毒支原體HI抗原血球凝集價(jià)測(cè)定(I)吸取30 μ I濃度為0.0ImoI/LpH為7.2的PBS,加到V型微量反應(yīng)板各孔；
(2)取30 μ I μ μ雞毒支原體抗原加入反應(yīng)板第一孔中，并做4孔重復(fù)；(3)將30 μ I抗原在反應(yīng)板上橫向作2倍倍比稀釋；(4)各孔加入30 μ I的1% (V/V)雞紅細(xì)胞；(5)用微量振蕩器混勻，室溫靜置30min。直到紅細(xì)胞對(duì)照孔完全沉淀為止。以使100%紅細(xì)胞凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)作為判定終點(diǎn)，表示一個(gè)血球凝集單位(1HA單位)。2)、4HA單位抗原的配制根據(jù)測(cè)定的抗原血球凝集(HA)效價(jià)，用PBS配制4HA單位抗原:(I)將配置好的4HA單位抗原用PBS稀釋，使4HA單位抗原的稀釋度為1: 2、1: 3、1: 4、1: 5、1: 6、1: 7 ;(2)在每一稀釋度的30 μ I抗原中加30 μ IPBS ；(3)再加入30 μ I的I % (V/V)雞紅細(xì)胞，混勻，室溫靜置30min后判定結(jié)果；(4)結(jié)果判定如果1: 4稀釋為100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)，表明配制的是4HA單位抗原；如果100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)是1: 5或1: 6則表明配制的4HA單位抗原實(shí)際上是高于4個(gè)單位；如果100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)是1: 2或1: 3則表明配制的4HA單位抗原實(shí)際上是低于4個(gè)單位。應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)整使抗原工作液為4HA單位。3)、血凝抑制試驗(yàn)(I)取96孔V型微量反應(yīng)板，每孔加入30 μ IPBS ；(2)分別吸取30 μ I待檢血清，加至每塊板的第一排各相應(yīng)孔內(nèi)，并在每塊板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照，然后2倍系列稀釋；(3)分別向各孔中加入含4ΗΑ單位的抗原30 μ 1，充分振蕩，37°C溫箱靜置15min ；(4)每孔加入I %雞紅細(xì)胞懸液30 μ 1，輕輕混勻，室溫靜置30min ；(5)結(jié)果判定將反應(yīng)板傾斜45°C角，凡血清反應(yīng)孔與紅細(xì)胞對(duì)照孔中紅細(xì)胞以同樣速度從孔底流淌者判為血球凝集抑制。當(dāng)陰性血清HI效價(jià)≤ 2Log2、陽(yáng)性血清HI效價(jià)與規(guī)定效價(jià)相比誤差< lLog2時(shí)，實(shí)驗(yàn)方可成立。三、疫苗評(píng)價(jià)1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)結(jié)果S/P值≥0.6時(shí)，疫苗判為合格；2、血凝抑制試驗(yàn)HI抗體水平，HI值≥4Log2時(shí)，疫苗判為合格。實(shí)施例2雞毒支原體滅活疫苗免疫試驗(yàn)動(dòng)物的血清抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)率之間的平行關(guān)系用3批疫苗，每批將60只40日齡的SPF雞分為6組，每組10只，其中50只按照20 μ 1、50μ 1、200μ 1、300μ 1、500μ I進(jìn)行頸背部皮下或大腿部肌肉注射免疫，另10只不免疫作對(duì)照。30天后采血，分離血清，測(cè)定ELISA抗體水平或HI抗體水平。同時(shí)連同對(duì)照雞10只，在2 3m3的密室(室內(nèi)溫度為15°C 30°C，相對(duì)濕度為50% 70% )內(nèi)噴霧攻擊雞毒支原體R株培養(yǎng)物500 600mL (每1.0ml含活菌數(shù)108 9CXU顏色變化單位)，噴霧持續(xù)時(shí)間應(yīng)不少于5分鐘，霧滴在2.0ym左右，觀察14日，剖檢，觀察氣囊病變，并進(jìn)行病變記分。對(duì)照組應(yīng)至少有4只雞的氣囊出現(xiàn)2分以上的病變，免疫雞的平均氣囊保護(hù)率應(yīng)在60%以上，計(jì)算攻毒保護(hù)率。結(jié)果如下表I。
表I雞毒支原體滅活疫苗不同免疫劑量免疫抗體與攻毒保護(hù)率相關(guān)性
權(quán)利要求
1.種雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法及其應(yīng)用，其特征在于:包括如下步驟: 1)用雞毒支原體滅活疫苗免疫雞后25 35天后采血并分離血清； 2)用血清學(xué)方法(ELISA方法或HI方法)測(cè)定血清的抗體效價(jià)替代免疫攻毒保護(hù)。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述雞毒支原體滅活疫苗免疫方法為皮下注射或肌肉注射。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述免疫劑量為I羽份，每羽份的量為0.2ml 0.6ml。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述MG抗體ELISA(ELISA，MGAb)試劑盒為美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)(試劑包括:包被的微量反應(yīng)板、樣品稀釋液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)二抗、底物溶液和終止液)，購(gòu)自北京愛德士世紀(jì)元亨有限公司。ELISA檢測(cè)方法按IDEXXMG抗體ELISA(ELISA，MGAb)試劑盒方法進(jìn)行。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述血凝抑制效價(jià)的測(cè)定方法，包括如下步驟: I)雞毒支原體血球凝集試驗(yàn):HA抗原二倍系列稀釋。將30ul雞紅細(xì)胞懸液加入含有30ul稀釋抗原的反應(yīng)孔內(nèi)，充分振蕩，在室溫靜置30min，判定結(jié)果時(shí)將反應(yīng)板傾斜與水平呈45°C角，對(duì)照孔內(nèi)和HA陰性孔的紅細(xì)胞完全沉淀到孔底中心，呈淚珠樣流淌；HA陽(yáng)性孔的紅細(xì)胞均勻分布在孔底或呈鋸齒樣凝集，使紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該抗原的HA效價(jià)；2)雞毒支原體血凝抑制試驗(yàn):在96孔V型微量反應(yīng)板，每行第I孔開始，每孔加入30ul稀釋液至12孔，分別在1、11孔加入待檢血清30ul，從第一孔開始倍比稀釋血清至第10孔，棄去30ul，向I 11孔加入4HA單位抗原30ul，充分振蕩，37°C溫箱靜置15min，每孔加入1% V/V雞紅細(xì)胞懸液30ul，輕輕混勻，室溫靜置30min，判定結(jié)果時(shí)將反應(yīng)板傾斜45°C角，紅細(xì)胞完全沉淀到孔底中心呈淚珠樣流淌為HI陽(yáng)性，紅細(xì)胞均勻分布在孔底不流動(dòng)者為HI陰性，完全抑制紅細(xì)胞凝集的最高稀釋倍數(shù)為待檢血清的HI抗體效價(jià)。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，其特征在于，免疫后的血清ELISA抗體水平，S/P值≥0.6時(shí)，疫苗判為合格。
7.據(jù)權(quán)利要求1所述的雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，其特征在于，免疫后的血清HI抗體水平，HI值> 4Log2時(shí)，疫苗判為合格。
8.據(jù)權(quán)利要求1所述的雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，其特征在于，免疫后的血清HI抗體水平、ELISA抗體水平和免疫攻毒保護(hù)率三者相互之間均呈正相關(guān)。
9.據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述方法不但在雞毒支原體滅活疫苗單苗中使用，而且在雞毒支原體滅活疫苗所有聯(lián)苗中也可使用。
10.據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述方法在雞毒支原體滅活疫苗的質(zhì)量控制中的應(yīng)用。
11.據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其特征在于，所述疫苗的質(zhì)量控制包括免疫攻毒保護(hù)率、疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定、免疫期限的測(cè)定和臨床監(jiān)測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。公開了一種雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，同時(shí)本發(fā)明還可應(yīng)用于疫苗的質(zhì)量控制，具體包括免疫攻毒保護(hù)率、疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定、免疫期限的測(cè)定和臨床監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)發(fā)明使用血清學(xué)檢測(cè)方法(包括ELISA和HI)替代本動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，方法簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性強(qiáng)、特異性強(qiáng)，該方法的建立減少免后攻毒看氣囊病變積分的主觀性及避免散毒，也為建立合理的免疫程序提供依據(jù)，具有普遍推廣的意義。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103091484SQ201210279128
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者丁美娟, 王偉, 尹秀鳳, 黃顯明, 許秀梅, 孫*, 汪愛芬, 吳娟, 張海濤, 徐延偉, 薛家賓, 張小飛 申請(qǐng)人:南京天邦生物科技有限公司