專利名稱：一種觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用徒手切片技術(shù)對植物的根進行切片，經(jīng)透明和染色處理，用光學(xué)顯微鏡來觀察植物根的顯微結(jié)構(gòu)ー種觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法。
背景技術(shù)：
對植物新鮮組織進行徒手切片可以用光學(xué)顯微鏡觀察到植物內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)。藥用植物許多都是以根莖為藥用部位的，根的形態(tài)解剖學(xué)研究對于藥用植物的分類、發(fā)育學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)等都是非常重要的。高清晰的顯微結(jié)構(gòu)圖像的獲取，必須是先得到高質(zhì)量的切片，然后經(jīng)過適當?shù)耐该骱腿旧幚聿拍塬@得。 由于新鮮的植物材料難以長期保存，植物根要經(jīng)過固定后才可以保存。然而現(xiàn)行的固定方法往往會造成植物組織的軟化和收縮變形，因而造成切片的質(zhì)量較差。常用的固定劑使用了甲醛，會造成植物根的細胞壁紫外光下強烈的自發(fā)熒光，同時也會影響熒光染料染色，因而難以清晰觀察根的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。現(xiàn)行的徒手切片，對植物切片進行透明處理通常采用的是水合氯醛，實踐證明，水合氯醛處理后植物根的切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察仍不夠清晰。對于植物細根進行切片時非常困難的，冰凍切片技術(shù)要用價格昂貴冰凍切片機來完成，石蠟切片技術(shù)過程復(fù)雜，需要長時間的包埋，而且其中使用的各種包埋劑往往使得許多染料難以滲入植物材料，因而無法清晰觀察到根的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如內(nèi)皮層、外皮層、凱氏帶
坐寸o

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法，可有效解決用光學(xué)顯微鏡清晰觀察植物根的內(nèi)部結(jié)構(gòu)問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是首先，對根進行處理，將挖出植物的根，清洗后剪成小段，再將根用甲醇固定，然后，用瓊脂糖溶液包埋，冷卻凝固后修成小塊，徒手切片后，選擇出高質(zhì)量的切片，置于容器內(nèi)的蒸餾水中，再進行乳酸透明，蓋好，用小檗堿或熒光黃染色后用水漂洗，再用甲苯胺藍0或番紅0進行后染色，再用水漂洗，水封片后，用倒置熒光顯微鏡觀察并攝像，可以得到清晰的圖像，實現(xiàn)觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，有效用于藥物植物的分類、發(fā)育學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)的研究。本發(fā)明方法簡單，操作容易，成本低，工作量小，成功率高，效果好的特點，是藥用植物研究內(nèi)部結(jié)構(gòu)上的創(chuàng)新，可以用于對根形態(tài)解剖的研究，和現(xiàn)行的方法比較，本方法對于植物較細的根切片更為簡單有效，可以節(jié)約時間，由于使用的是落射熒光，對于切片的厚度要求不高，針對不同的植物材料染料種類和染色時間做出選擇和調(diào)整后可以達到最佳的效果，也可適用于對莖和葉等材料的徒手切片觀察。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體方式作詳細說明。
本發(fā)明在具體實施中，由以下實施例給出的具體步驟實現(xiàn)
(1)、根的處理，從土壤中挖取植物的根，用清水洗浄，再用剪刀修成5-10mm的小段根；所述植物的根為藥用植物的根；
(2)、對小段根用甲醇固定，方法是，將小段根浸入甲醇中固定l-6h，殺死細胞，保持細胞的性狀，使組織不易變形，放在冰箱中4°C下保存，備用；
(3 )、瓊脂糖溶液包埋，對步驟(2 )處理后的小段根放入鋁箔模子中，每個鋁箔模子中平行放置2-4個小段根，鋁箔模子的規(guī)格為高10-15_，長和寬10-20_，每個鋁箔模子中加入40-550C的濃度為4-9%的瓊脂糖溶液，瓊脂糖溶液高度小于鋁箔模子的高度，為8-12 mm,冷卻至室溫后凝固成瓊脂糖凝膠塊；所述的濃度為4-9%的瓊脂糖溶液，是由4-9g的瓊脂糖加水至IOOmL制成；
(4)、將瓊脂糖凝膠塊修成小塊，方法是，從鋁箔模子中取出步驟(3)中凝固成的瓊脂糖凝膠塊，用刀片切割、修整成厚度6-10 mm，長和寬各6-10 mm的凝膠小塊，，每個凝膠小塊中有一小段根，凝膠小塊的上、下兩面和與根長軸垂直；
(5)、徒手切片，用刀片將凝膠小塊橫切成厚度0.2-0. 5mm的切片，將切片置入裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，備用；
(6)、乳酸透明，方法是，在容器(如稱量瓶)中加0.5-1. 5mL的透明劑，將步驟(5)中制成的切片從培養(yǎng)皿的蒸餾水中轉(zhuǎn)入裝有透明劑的容器中，用玻璃片蓋好，在65-75°C的水內(nèi)水浴 0. 5-1. 5 h ；
所述的透明劑是由乳酸和濃度為50%的水合氯醛制成的溶液，乳酸和濃度50%水合氯醛的體積比為I : 1，濃度50%的水合氯醛是由水合氯醛50g加水至IOOmL制成；
(7)、染色，方法是，將步驟(6)乳酸透明后的切片從乳酸溶液中取出放入另備的容器(如稱量瓶)中，加入0. 5-1. 5mL濃度為0. 05-0. 2% (w/v)的小檗堿，或者加0. 5-1. 5mL濃度為0. 01% (w/v)的熒光黃088，在65-75°C的水內(nèi)水浴染色0. 5-1. 5 h ；
所述的濃度為0. 05-0. 2% (w/v)的小檗堿，是由0. 05-0. 2g小檗堿加乳酸至IOOmL制成；所述的濃度為0.01% (w/v)的熒光黃088，是由0. Olg熒光黃088加乳酸至IOOmL制成；
(8)、后染色，方法是，取出步驟(7)染色后的切片，用水漂洗脫色后，再用濃度
0.05-0. 2% (w/v)的甲苯胺藍0溶液或濃度0. 1-0. 5%番紅0溶液染色l_3min，用水漂洗干凈后，用水封片；
所述的濃度0. 05-0. 2% (w/v)的甲苯胺藍0溶液，是由0. 05-0. 2g甲苯胺藍0加水至IOOmL制成；所述的濃度0. 1-0. 5%番紅0溶液，是由0. 1-0. 5g番紅0加水至IOOmL制成；
(9)、顯微鏡觀察，用倒置熒光顯微鏡(落射光)觀察照相，將同一切片同一視野下分別用亮光和紫外光分別照相，利用操作及分析軟件的圖像疊加功能，將圖像疊加后可以得到清晰完整的圖像。在上述各步驟的具體實施中，所述的步驟(I)中藥用植物的根用剪刀修成5-10mm的小段根，在具體的實施中，可以是修成5-6mm、7-8mm、9-10mm的小段根，或修成5. 5mm、7. 5mm、9. 5mm的小段根；
所述的步驟(2)中小段根用甲醇固定l_6h，在具體實施中，可固定l-2h、3-4h、5-6h，或
1.5h、3. 5h、5. 5h ；
所述的步驟(3)中鋁箔模子的高10-llmm、長10-12mm、寬10_12mm，每個鋁箔模子中平行放置兩個小段根，鋁箔模子中加入40°C、4%瓊脂糖溶液，瓊脂糖溶液的高度為8-9mm，所述的4%瓊脂糖溶液是由瓊脂糖4g加水至IOOmL制成；所述的鋁箔模子還可以是高12-13mm、長、寬均為13-16臟，每個鋁箔模子中平行放置3個小段根，鋁箔模子中加入45°C、6%瓊脂糖溶液，瓊脂糖溶液的高度為10-llmm，所述的6%瓊脂糖溶液是由瓊脂糖6g加水至IOOmL制成；在具體實施時，所述的鋁箔模子還可以是高14-15mm、長、寬均為17_20mm，每個鋁箔模子中平行放置4個小段根，鋁箔模子中加入55°C、9%瓊脂糖溶液，瓊脂糖溶液的高度為ll_12mm，所述的9%瓊脂糖溶液是由瓊脂糖9g加水至IOOmL制成；
所述的步驟(6)乳酸透明在具體實施中，是在ー個稱量瓶中加入0. 5mL的透明劑，將步驟(5)中制成的切片從培養(yǎng)皿的蒸餾水中轉(zhuǎn)入裝有透明劑的稱量瓶中，用玻璃片蓋好，在65-67°C的水內(nèi)水浴1-1. 5 h ；
乳酸透明在具體實施中，還可在一個稱量瓶中加入ImL的透明劑，將步驟(5)中制成的 切片從培養(yǎng)皿的蒸餾水中轉(zhuǎn)入裝有透明劑的稱量瓶中，用玻璃片蓋好，在68-70°C的水內(nèi)水浴 0. 8-1 2h ；
乳酸透明在具體實施中，還可是在一個稱量瓶中加入I. 5mL的透明劑，將步驟(5)中制成的切片從培養(yǎng)皿的蒸餾水中轉(zhuǎn)入裝有透明劑的稱量瓶中，用玻璃片蓋好，在71-75°C的水內(nèi)水浴0. 5-1 h ；
所述的步驟(7)染色在具體實施中，是將步驟(6)乳酸透明后的切片從乳酸溶液中取出放入另備的稱量瓶中，加入0. 5mL濃度為0. 2% (w/v)的小檗堿，或者加0. 5-1. 5mL濃度為0.01% (w/v)的熒光黃088，在65-67°C的水內(nèi)水浴染色I-L 5 h ；
染色在具體實施中，還可將步驟(6)乳酸透明后的切片從乳酸溶液中取出放入另備的稱量瓶中，加入ImL濃度為0. 1% (w/v)的小檗堿，在68-70°C的水內(nèi)水浴染色0. 8-1. 2h ；染色在具體實施中，還可將步驟(6)乳酸透明后的切片從乳酸溶液中取出放入另備的稱量瓶中，加入I. 5mL濃度為0.05% (w/v)的小檗堿，在71_75°C的水內(nèi)水浴染色0. 5_1 h。本發(fā)明方法經(jīng)多次反復(fù)試用和實驗均取得了相同或相近的結(jié)果，表明方法穩(wěn)定可靠，觀察結(jié)果清晰，根的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以看清，與現(xiàn)有方法相比，具有取材少，節(jié)約試劑，成本低，可節(jié)約資材和成本50%以上，實驗時間短，工作量小，觀察結(jié)果比已有的方法的效果都好，成功率高，大大提高工作效率，可有效用于各類植物根的觀察，特別是根類藥用植物的分類、植物生態(tài)學(xué)、植物生理學(xué)相關(guān)的形態(tài)解剖學(xué)研究有重要的價值。本發(fā)明有三大特點，ー是利用甲醇作為固定劑，可以保持根的弾性，也不會影響細胞壁的熒光染色和觀察。ニ是利用瓊脂糖凝膠包埋材料，瓊脂糖只是起到一個機械支持作用，不會滲進植物組織內(nèi)部，對于植物材料染色影響甚微。該方法也可以用于地上部分材料的切片，如莖、葉等。三是利用乳酸透明和作為染料的溶劑，乳酸分子量小，滲透快，透明效果好，又能減小透明和染色中的細胞內(nèi)外滲透壓力差，較小引起材料變形。特別是找到ー種針對植物細根徒手切片和染色的簡易方法是其他方法無可相比的，為藥物植物的分類、發(fā)育學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)的研究提供了有效的技術(shù)手段，經(jīng)濟和社會效益巨大。
權(quán)利要求
1.一種觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，由以下步驟實現(xiàn) (1)、根的處理，從土壤中挖取植物的根，用清水洗凈，再用剪刀修成5-10mm的小段根；所述植物的根為藥用植物的根； (2)、對小段根用甲醇固定，方法是，將小段根浸入甲醇中固定l-6h，殺死細胞，保持細胞的性狀，使組織不易變形，放在冰箱中4°C下保存，備用； (3 )、瓊脂糖溶液包埋，對步驟(2 )處理后的小段根放入鋁箔模子中，每個鋁箔模子中平行放置2-4個小段根，鋁箔模子的規(guī)格為高10-15_，長和寬10-20_，每個鋁箔模子中加入40-550C的濃度為4-9%的瓊脂糖溶液，瓊脂糖溶液高度小于鋁箔模子的高度，為8-12 mm,冷卻至室溫后凝固成瓊脂糖凝膠塊；所述的濃度為4-9%的瓊脂糖溶液，是由4-9g的瓊脂糖加水至IOOmL制成； (4)、將瓊脂糖凝膠塊修成小塊，方法是，從鋁箔模子中取出步驟(3)中凝固成的瓊脂糖凝膠塊，用刀片切割、修整成厚度6-10 mm，長和寬各6-10 mm的凝膠小塊，，每個凝膠小塊中有一小段根，凝膠小塊的上、下兩面和與根長軸垂直； (5)、徒手切片，用刀片將凝膠小塊橫切成厚度O.2-0. 5mm的切片，將切片置入裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，備用； (6)、乳酸透明，方法是，在容器中加O.5-1. 5mL的透明劑，將步驟(5)中制成的切片從培養(yǎng)皿的蒸餾水中轉(zhuǎn)入裝有透明劑的容器中，用玻璃片蓋好，在65-75 V的水內(nèi)水浴O.5-1. 5 h ； 所述的透明劑是由乳酸和濃度為50%的水合氯醛制成的溶液，乳酸和濃度50%水合氯醛的體積比為I : 1，濃度50%的水合氯醛是由水合氯醛50g加水至IOOmL制成； (7)、染色，方法是，將步驟(6)乳酸透明后的切片從乳酸溶液中取出放入另備的容器中，加入O. 5-1. 5mL濃度為O. 05-0. 2%的小檗堿，或者加O. 5-1. 5mL濃度為O. 01%的熒光黃088，在65-75°C的水內(nèi)水浴染色O. 5-1. 5 h ； 所述的濃度為O. 05-0. 2%的小檗堿，是由O. 05-0. 2g小檗堿加乳酸至IOOmL制成；所述的濃度為O. 01%的熒光黃088，是由O. Olg熒光黃088加乳酸至IOOmL制成； (8)、后染色，方法是，取出步驟(7)染色后的切片，用水漂洗脫色后，再用濃度O.05-0. 2%的甲苯胺藍O溶液或濃度O. 1-0. 5%番紅O溶液染色l_3min，用水漂洗干凈后，用水封片； 所述的濃度O. 05-0. 2%的甲苯胺藍O溶液，是由O. 05-0. 2g甲苯胺藍O加水至IOOmL制成；所述的濃度O. 1-0. 5%番紅O溶液，是由O. 1-0. 5g番紅O加水至IOOmL制成； (9)、顯微鏡觀察，用倒置熒光顯微鏡觀察照相，將同一切片同一視野下分別用亮光和紫外光分別照相，利用操作及分析軟件的圖像疊加功能，將圖像疊加后可以得到清晰完整的圖像。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的步驟Cl)中藥用植物的根用剪刀修成5-6mm，或7-8mm，或9-10mm的小段根。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中小段根用甲醇固定時間為l_2h，或3-4h，或5-6h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中鋁箔模子的高10-llmm、長10_12mm、寬10_12mm，每個鋁箔模子中平行放置兩個小段根，鋁箔模子中加入40°C、4%瓊脂糖溶液，瓊脂糖溶液的高度為8-9mm ;或鋁箔模子高為12-13mm、長、寬均為13_16mm，每個鋁箔模子中平行放置3個小段根，鋁箔模子中加入.45°C、6%瓊脂糖溶液，瓊脂糖溶液的高度為10-llmm;或鋁箔模子高為14_15mm、長、寬均為.17-20mm,每個鋁箔模子中平行放置4個小段根，鋁箔模子中加入55°C、9%瓊脂糖溶液，瓊脂糖溶液的高度為ll_12mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的步驟(6)乳酸透明是在一個稱量瓶中加入O. 5mL的透明劑，將步驟(5)中制成的切片從培養(yǎng)皿的蒸餾水中轉(zhuǎn)入裝有透明劑的稱量瓶中，用玻璃片蓋好，在65-67°C的水內(nèi)水浴1-1. 5h ； 或在一個稱量瓶中加入ImL的透明劑，將步驟(5)中制成的切片從培養(yǎng)皿的蒸餾水中轉(zhuǎn)入裝有透明劑的稱量瓶中，用玻璃片蓋好，在68-70°C的水內(nèi)水浴O. 8-1 . 2h ； 或在一個稱量瓶中加入I. 5mL的透明劑，將步驟(5)中制成的切片從培養(yǎng)皿的蒸餾水中轉(zhuǎn)入裝有透明劑的稱量瓶中，用玻璃片蓋好，在71-75 °C的水內(nèi)水浴O. 5-lh。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的步驟(7)染色是將步驟(6)乳酸透明后的切片從乳酸溶液中取出放入另備的稱量瓶中，加入.O.5mL濃度為O. 2%的小檗堿，或者加O. 5-1. 5mL濃度為O. 01%的熒光黃088，在65_67°C的水內(nèi)水浴染色1-1. 5h ； 或?qū)⒉襟E(6)乳酸透明后的切片從乳酸溶液中取出放入另備的稱量瓶中，加入ImL濃度為O. 1%的小檗堿，在68-70°C的水內(nèi)水浴染色O. 8-1. 2h ； 或?qū)⒉襟E(6)乳酸透明后的切片從乳酸溶液中取出放入另備的稱量瓶中，加入I. 5mL濃度為O. 05%的小檗堿，在71-75°C的水內(nèi)水浴染色O. 5-lh。
全文摘要
本發(fā)明涉及觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的方法，可有效解決用光學(xué)顯微鏡清晰觀察植物根的內(nèi)部結(jié)構(gòu)問題，方法是，首先，將挖出植物的根，清洗后剪成小段，再將根用甲醇固定，然后，用瓊脂糖溶液包埋，冷卻凝固后修成小塊，徒手切片后，置于容器內(nèi)的蒸餾水中，再進行乳酸透明，蓋好，用小檗堿或熒光黃染色后用水漂洗，再用甲苯胺藍O或番紅O進行后染色，再用水漂洗，水封片后，用倒置熒光顯微鏡觀察并攝像，可以得到清晰的圖像，實現(xiàn)觀察植物根內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，有效用于藥物植物的分類、發(fā)育學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)的研究，本發(fā)明方法簡單，操作容易，成本低，工作量小，成功率高，效果好，可以用于對根形態(tài)解剖的研究，對于植物較細的根切片更為簡單有效。
文檔編號G01N1/30GK102768209SQ201210275738
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者馮衛(wèi)生, 劉孟奇, 王小巧, 董誠明, 陳隨清 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院