專利名稱：一種利用紅球菌jzx-01對石油污染物的降解及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種利用紅球菌JZX-01對石油污染物的降解及檢測方法。具體的說是涉及利用在實(shí)驗(yàn)室模擬的條件下紅球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法研究與優(yōu)化，即利用紅球菌JZX-Ol在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下對石油降解情況的優(yōu)化和研究。
背景技術(shù)：
石油是遠(yuǎn)古時(shí)期由動植物的有機(jī)殘骸經(jīng)過漫長的地質(zhì)作用所形成的黒褐色粘稠液體，密度一般為O. 83-1. 00t/m3。石油的組成因地域的不同而異，地質(zhì)成分很復(fù)雜，主要包括飽和烴類、芳香類、浙青質(zhì)和樹脂類以及含硫、氧、氮等元素的有機(jī)物及釩、鎳等重金屬，按其組分的不同可以將石油分為富石蠟石油、富環(huán)烷烴石油以及混合石油。烴類化合物占石油的絕大部分，約有幾萬種，各種烴類的結(jié)構(gòu)和所占比例相差甚大，石油烴類的相對分子質(zhì)量的跨度范圍很大，包含從分子質(zhì)量為16的甲烷到分子質(zhì)量為2000的烴類。石油及成品油是國民生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要能源物質(zhì)，但是在開采、冶煉、儲存、運(yùn)輸和使用的過程中的泄露以及世界各地頻繁發(fā)生的漏油事故等引起了世界范圍嚴(yán)重的石油污染問題。目前，全球的石油污染物以每年I. OX IO3萬噸的石油排放到大氣、陸地和海洋中，其中我國的石油污染物増加量也以每年11. 5萬噸的數(shù)量激増。據(jù)報(bào)道，近50年來由于石油的泄露等造成的污染已經(jīng)使超過1000種的海生生物滅絕，海洋生物的總量減少40%。石油泄漏后引起的海域和陸地的污染也是對當(dāng)?shù)刈匀痪坝^的極大損害，受污染的鹽堿灘中，溢油的滲透可以達(dá)到很深的深度，難以清除，產(chǎn)生長期的有害影響。整治石油污染物已經(jīng)成為亟待解決的重大環(huán)境問題。對石油污染物的處理方法主要有三種物理法、化學(xué)法以及生物法。其中，物理方法處理石油污染物只能在石油尚未分散和稀釋的情況下通過某些材料和設(shè)備進(jìn)行收集；但是由于石油在水中會極快的分散和稀釋，所以很難回收到全部的石油污染物；化學(xué)方法是通過添加化學(xué)試劑對石油污染物進(jìn)行分散，達(dá)到肉眼不可見的程度，但是并未有將石油轉(zhuǎn)化為其他的環(huán)境友好物質(zhì)，相反，由于小顆粒的石油顆粒在水相中更容易擴(kuò)散以及被動植物吸收會造成更加嚴(yán)重的污染問題，另外，由于添加的化學(xué)物質(zhì)本身就是環(huán)境中的外來人エ合成物質(zhì)，其自身就具有對環(huán)境的污染效應(yīng)；生物處理石油污染物的方法由于可以從根本上克服物理法和化學(xué)法的弊端，而且具有成本低廉、環(huán)境友好、處理方法簡單、處理速率高效，降解程度徹底的優(yōu)勢而成為近年來研究的熱點(diǎn)。環(huán)境的改變能夠很大程度地影響到石油降解菌的降解效率和降解程度。微生物降解石油烴的能力取決于石油中各種組分的組成，碳鏈和多環(huán)芳烴的復(fù)雜程度，環(huán)境情況、菌株種類，表面活性劑以及產(chǎn)生表面活性劑的細(xì)菌是否存在等諸多因素的綜合影響。石油烴中許多物質(zhì)的吸收速率和礦化速率取決于環(huán)境中石油的濃度，如果石油的濃度過高，不僅會形成難以分散的厚油層和油顆粒，造成物理性的分散不均勻，而且降解效率和速率會由于相對N和P元素的缺失、相對氧氣濃度的下降以及高濃度的石油對微生物的毒害而形成的降解抑制作用。石油的可降解能力根據(jù)其組分的不同會有很大的差異。微生物對石油中四種主要成分即飽和烴、芳香烴、浙青質(zhì)和蠟質(zhì)以及非烴類物質(zhì)的可利用程度不同。非烴類物質(zhì)由于成分不確定，無法判定，其他三種主要成分的降解能力大小依次為飽和烷烴>芳香烴〉浙青紙和蠟質(zhì)。其中在飽和烷烴中，直鏈烷烴最容易降解，C1-C6范圍內(nèi)的烴類可以被極少的微生物利用，大部分通過揮發(fā)除去，C10-C22范圍內(nèi)的直鏈烷烴的生物降解性能最好而且毒性也是最小的，超過C22的直鏈烷烴由于其水溶性低，在ー環(huán)境溫度下一般是固態(tài)形式存在，因此降解緩慢。支鏈烷烴的可降解能力比直鏈烷烴差很多，原因是由于分支結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了“空間效應(yīng)”及在降解過程中由分支結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的三碳和四碳原子對氧化的阻滯作用。環(huán)烷烴的環(huán)數(shù)越多越難降解，但是在ClO以下的環(huán)烷烴由于其自身含有較高的膜毒性而使其生物降解カ較低。芳香烴中苯環(huán)的數(shù)目越多越難以降解，而且芳香烴在石油中雖然含量不多但是對微生物有毒害作用。近年來，以有毒多環(huán)芳烴為唯一底物篩選降解多環(huán)芳烴的細(xì)菌也是環(huán)境領(lǐng)域內(nèi)研究的熱點(diǎn)。浙青質(zhì)和蠟質(zhì)屬于極難被微生物降解利用的物質(zhì)，在降解的最終階段會殘留在降解體系內(nèi)。在深海中，壓カ對石油的降解作用很明顯，即隨著壓カ的増大，石油降解菌降解能力下降，這是因?yàn)樯詈－h(huán)境下的氧氣濃度降低，微生物對石油的可降解能力減弱。氮源、磷源和某些微量元素如鐵離子等對降解菌的降解作用比氧氣還要重要。在受石油污染的環(huán)境中，作為碳源的石油含量很高，而微生物生 長需要的其他營養(yǎng)物質(zhì)如Ν、Ρ等含量相對低很多。微生物的生長需要一定的C Ν Ρ的比例，Wonjae Chang等在2010年發(fā)現(xiàn)石油降解菌的最適合C:N:P比例是100:9:1,而受石油污染區(qū)域的氮磷的相對含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于這個(gè)比例。所以無論是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬還是在石油污染區(qū)域的現(xiàn)場修復(fù)過程中，添加適量的氮源和磷源都會増加微生物降解菌的降解速率和降解程度。微生物生長環(huán)境中PH變化對其自身的生長和降解作用的影響較大，尤其在極端的酸性或者堿性條件下這種影響變得更加明顯。降解石油的細(xì)菌的一般適宜的PH是7. 0-7. 4，不同的菌株的最適PH不相同。在石油的生物降解過程中，溫度對石油的降解作用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面。第一是影響石油降解菌的生長速度以及酶的活性和微生物的種群組成；第ニ是通過影響石油的物理組成和化學(xué)成分影響微生物對石油的降解速率。研究表明，微生物對石油的降解能力在30°C到40°C的降解能力最高。溫度過低時(shí)，石油的粘性變大，可溶解能力降低，微生物的活性以及酶的活性也變得很低。溫度過高時(shí)，微生物的活性受高溫的影響下降，而且高溫的下石油的膜毒性增大導(dǎo)致生物降解能力降低。石油的降解體系是ー個(gè)油-水共存體系，微生物主要在油-水界面處活動。完全在水相中的微生物難以和石油接觸，不產(chǎn)生降解作用，而完全處于石油中的微生物由于缺水及水相中微生物生長和降解所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，不會產(chǎn)生降解作用。所以，油-水體系中，要達(dá)到微生物的高效降解作用，必須増大石油在水相中的分散程度，増大微生物與石油的接觸面積。利用生物表面活性劑對是有進(jìn)行乳化為石油小液滴，這樣不僅能夠最大程度的増大石油與微生物的接觸面積，而且微生物更容易從水相中獲得生長所必需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的能力對石油污染物的降解會起到很大的增強(qiáng)作用，生物表面活性劑除了具有一般化學(xué)表面活性劑所有的降低表面張力，發(fā)泡及穩(wěn)定乳化液的共性外，還因?yàn)樽陨砭邆洫?dú)特的性質(zhì)而受到廣泛關(guān)注，這些優(yōu)勢包括(I)具有較高的水溶性，在石油和水相的表面能產(chǎn)生較高的表面活性；(2)具有很強(qiáng)的乳化石油的能力，能分散石油，并將油膜剝落下來，使含有的巖石和沙礫表面產(chǎn)生兩高的潤濕性；(3)反應(yīng)得到的產(chǎn)物具有生物活性，具有新型的，化學(xué)方法很難合成的反應(yīng)基團(tuán)；(4)對固體物質(zhì)的吸附量比化學(xué)表面活性劑小，能在反應(yīng)介質(zhì)中均勻分散；(5)對自然環(huán)境無毒無害、安全、可以被自然界中的生物降解。本發(fā)明涉及的利用紅球菌JZX-Ol降解石油污染的方法中，考察了實(shí)驗(yàn)室模擬條件下石油的裝載量對石油降解率的影響；探討了不同的環(huán)境條件(溫度、鹽度、培養(yǎng)基pH)下的石油降解表現(xiàn)；研究了紅球菌JZX-Ol對石油中不同成分的降解行為；分析了紅球菌JZX-Ol在降解石油污染物的過程中產(chǎn)生生物表面活性劑的能力以及生物表面活性及對石油降解的促進(jìn)作用。經(jīng)過考察，本方法對石油污染物的降解具有效果顯著、速率快速、范圍廣泛的優(yōu)勢，對石油污染物降解機(jī)理的考察和石油污染區(qū)域的修復(fù)將產(chǎn)生有效的理論優(yōu)勢和豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種新的石油污染物的降解方法，即利用紅球菌JZX-Ol在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下對石油降解情況的優(yōu)化和研究。
本發(fā)明所使用的紅球菌JZX-Ol已于2012年4月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏的編號為CGMCC No. 5958，分類命名為紅球菌JZX-Ol(Rhodococcus sp.JZX-01)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下ー種利用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法，首先配置降解石油污染物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為硝酸鈉l_3g/L，磷酸ニ氫鉀l_2g/L，磷酸氫ニ鉀l_3g/L，硫酸銨l_3g/L，氯化鈉5-30g/L，硫酸鎂O. Ι-lg/L，微量元素IOmL ;無機(jī)鹽培養(yǎng)液的pH值為
6.0-8. 0，取IOOmL無機(jī)鹽培養(yǎng)液分裝到250mL的三角瓶中，通過控制NaCl控制培養(yǎng)液的鹽度范圍為O. 5%-5%，在121°C的高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘；待無機(jī)鹽培養(yǎng)基冷卻后，接種紅球菌JZX-Ol，使得最終的0D_達(dá)到O. 5，在每IOOmL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加石油5_15mL ;將三角瓶放在溫度為25-35°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速是200rpm的搖床中降解石油污染物，降解時(shí)間為10天。所述的微量元素溶液為MnSO4·4Η20 O. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 5g/L,Na2MoO4 · 2H200. 2g/L, CuSO4 · 5H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 2. Og/L, CaCl2 I. Og/L, NaSO4 5. Og/L 或 H3BO3 0. 5g/L利用紅球菌JZX-01降解石油污染物后的測定方法，其特征是所述方法包括a利用こ醇破解培養(yǎng)液中絮狀漂浮物的紫外分光光度法；b通過利用離心后的正己烷萃取石油污染物的比重法測定總石油降解效率的方法;c氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定石油內(nèi)各種物質(zhì)的降解情況；d通過測量培養(yǎng)液的表面張カ考察生物表面活性劑對石油污染物降解的影響。所述的步驟a是利用こ醇破解培養(yǎng)液中絮狀漂浮物的紫外分光光度法，利用こ醇對菌液進(jìn)行定量洗滌，破除菌液中未降解的石油與菌體形成的絮狀漂浮物，使用漩渦振蕩器震破絮狀漂浮物，形成均勻的相后，使用紫外分光光度計(jì)測量菌體濃度。所述的步驟b是將降解完的培養(yǎng)液在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心，除去菌體后，上清液用正己烷進(jìn)行萃取，得到剰余的石油；萃取的石油用氮?dú)庠谕L(fēng)櫥中進(jìn)行通風(fēng)，除去正己烷和水分。
所述的步驟c是利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對降解前后的石油分別進(jìn)行分析，考察石油中不同物質(zhì)的降解情況；石油在進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析前需要用100:1體積比的正己烷進(jìn)行稀釋。所述的步驟d是在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入石油烴為唯一碳源，接種紅球菌JZX-Ol使最終的0D_為O. 5，放置于30°C，200rpm的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔8小時(shí)取樣測量培養(yǎng)液的表面張力。石油烴為石油與柴油1:4體積比的混合液。本發(fā)明中，考察了不同條件石油污染物的降解方法研究，具體的考察方法為分別在20、25、30和35°C下考察溫度對石油降解率的影響，在pH為6. 0,7. 0,7. 2和8. O下考察不同的酸堿度對降解率的影響，在鹽度為O. 5g/L、lg/L、2g/L和3g/L的情況下考察鹽度對石油降解率的影響。本發(fā)明的目的還包括提供了新的降解石油污染物的測定方法，即不同的條件下考 察紅球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法、改進(jìn)的紫外分光光度法、萃取比重法測定總的石油降解效率、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定石油內(nèi)每種物質(zhì)的降解情況以及通過測量培養(yǎng)液的表面張カ考察生物表面活性劑對石油污染物降解的影響。本發(fā)明的目的還有利用こ醇剝離培養(yǎng)液中附著在懸浮物內(nèi)外的菌體，得到均勻的菌液，然后測定菌液中菌體的濃度，具體的原因是由于紅球菌JZX-01在降解石油的過程中，上層培養(yǎng)液中未降解的石油會與旺盛生長的菌體相互附著，形成難以均勻分散的絮狀漂浮物。本發(fā)明中，JZX-Ol對石油的降解能力測定采用比重法進(jìn)行測量，具體的說是在降解進(jìn)行到預(yù)定的時(shí)間后，將培養(yǎng)液置于低溫下停止菌體的生長，降低酶的活性，離心除去菌體后萃取上清液中的剰余石油。萃取物置于通風(fēng)櫥中用惰性氣體進(jìn)行通風(fēng)除去萃取劑和水分，得到純凈的剰余石油。通過剩余石油與初始石油的質(zhì)量比可以得到石油降解率。本發(fā)明中，JZX-Ol對石油的降解能力還采用了氣相色譜-質(zhì)譜分析聯(lián)用的方法進(jìn)行定量化測量。具體的說是將在上述降解前和降解后的石油溶解在100倍體積的正己烷中，注射到氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀中進(jìn)行分析。本發(fā)明中，使用表面張カ儀測得紅球菌JZX-Ol在降解2%體積比的石油烴(石油與柴油按1:4均勻混合)時(shí)，表面張カ隨時(shí)間變化的情況。


圖I是不同石油裝載量對石油降解效果的影響；圖2a是石油降解前進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析得到的含量變化；圖2b是石油降解后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析得到的含量變化；圖3是紅球菌JZX-Ol在含2%的石油烴中培養(yǎng)5天，得到的表面張カ變化趨勢。
具體實(shí)施例方式通過下面結(jié)合具體實(shí)例將有助于進(jìn)一歩理解本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限制于此實(shí)施例I利用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物
在用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法中，培養(yǎng)基成分是硝酸鈉lg/L、磷酸ニ氫鉀lg/L、磷酸ー氫鉀lg/L、硫酸銨3g/L、NaC15g/L，硫酸鎂lg/L。微量元素10mL，調(diào)節(jié)pH到6.0，在IOOmL的三角瓶中添加石油5mL的石油。25°C下，鹽度O. 5%，200rpm的轉(zhuǎn)速下，降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行9天后，發(fā)現(xiàn)石油降解率達(dá)到39%。實(shí)施例2利用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物在用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法中，培養(yǎng)基成分是硝酸鈉2g/L、磷酸ニ氫鉀I. 5g/L、磷酸ー氫鉀2g/L、硫酸銨2g/L、NaCl 10g/L，硫酸鎂O. 5g/L。微量元素10mL，調(diào)節(jié)PH到7. 0，在IOOmL的三角瓶中添加石油IOmL的石油。30°C下，鹽度2. 0%, 200rpm的轉(zhuǎn)速下，降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行9天后，發(fā)現(xiàn)石油降解率達(dá)到54%。實(shí)施例3
利用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物在用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法中，培養(yǎng)基成分是硝酸鈉3g/L、磷酸ニ氫鉀2g/L、磷酸ー氫鉀3g/L、硫酸銨lg/L、NaCl 15g/L，硫酸鎂O. lg/L。微量元素10mL，調(diào)節(jié)pH到8.0，在IOOmL的三角瓶中添加石油15mL的石油。35°C下，鹽度3. 0%，200rpm的轉(zhuǎn)速下，降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行9天后，發(fā)現(xiàn)石油降解率達(dá)到42%。實(shí)施例4利用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物在用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法中，培養(yǎng)基成分是硝酸鈉lg/L、磷酸ニ氫鉀2g/L、磷酸ー氫鉀3g/L、硫酸銨lg/L、NaC15g/L，硫酸鎂O. lg/L。微量元素10mL，調(diào)節(jié)pH到8. 0，在IOOmL的三角瓶中添加石油5mL的石油。30°C下，鹽度O. 5%，200rpm的轉(zhuǎn)速下，降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行9天后，發(fā)現(xiàn)石油降解率達(dá)到78%。實(shí)施例5石油污染物降解過程中菌體生長量的測定方法石油污染物在搖瓶中經(jīng)過紅球菌JZX-Ol的降解，形成漂浮在培養(yǎng)液上層的很多絮狀漂浮物。在取樣時(shí)，難以得到均勻的菌液，為解決這個(gè)問題，將搖瓶在漩渦振蕩器上低速震蕩，形成較為均勻的混合相，用移液槍移除適量的菌液。菌液與こ醇以1:1體積比進(jìn)行混合，高速漩渦震蕩破除菌體與未降解石油的附著作用，得到均勻混合的菌液，然后在600nm的紫外分光光度計(jì)中測定其紫外吸收值，用以考察菌體的濃度。實(shí)施例6石油污染物經(jīng)過紅球菌JZX-Ol降解前后的比重分析方法JZX-Ol對石油的降解能力采用比重法進(jìn)行測定，在含有初始OD值為O. 5的紅球菌JZX-Ol的培養(yǎng)基中，30°C下，200rpm的搖床下進(jìn)行9天實(shí)驗(yàn)后，將培養(yǎng)液置于低溫下停止菌體的生長，降低酶的活性，12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心除去菌體，上清液中加入正己烷進(jìn)行萃取得到剰余的石油。萃取物置于通風(fēng)櫥中用惰性氣體進(jìn)行通風(fēng)除去正己烷和水分，得到純凈的剰余石油。通過剩余石油與初始石油的質(zhì)量比可以得到石油降解率。本方法中用正己烷進(jìn)行萃取，能夠達(dá)到良好的萃取效果，簡單快捷，無重復(fù)操作，而且結(jié)果精準(zhǔn)。實(shí)施例7氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析石油降解前后組分變化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明中所用到的石油是重質(zhì)石油，粘著性很高，難以在水溶液中分散，采用JZX-Ol菌株在30°C，200rpm的條件降解裝載量為5%體積比的石油，接種2天之后，石油與水相已經(jīng)形成了非常均勻的混合狀態(tài)。9天后，萃取并且除去萃取劑和水分，得到純凈的剩余石油。用100倍體積的正己烷溶解剰余石油和未接種JZX-Ol的石油，分別進(jìn)樣到氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀安捷倫6890 (Agilent6890)中，測得的降解前后的效果如說明書附2所示，分析得到的數(shù)據(jù)顯示利用本方法進(jìn)行石油的降解，石油中短鏈烷烴和中長鏈烷烴的降解效果好于長鏈烷烴的降解效果，對難于被降解的姥鮫烷和植烷等物質(zhì)也具有良好的降解效果。烷烴的降解范圍廣泛，長鏈烷烴如C38等也被降解了 30-50%。實(shí)施例8考察JZX-Ol在降解石油烴過程中表面張カ的降低作用本方法中所涉及的石油烴是石油與柴油按體積比I : 4的比例進(jìn)行混勻的混合液。將2%體積比的石油烴加入到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C下，200rpm的條件下，每隔8小時(shí)使用表面張カ儀測量上清液的表面張力。具體的說是將培養(yǎng)液在12000rpm的條件下離心除去沉淀的菌體，保留上清液。將上清液放置到全自動表面張カ測試儀下進(jìn)行測量。測量結(jié)果如

中圖3所示，培養(yǎng)液的表面張カ自接種后的第8個(gè)小時(shí)開始下降，在第24小時(shí)后下降速度顯著增強(qiáng)，達(dá)到第80個(gè)小時(shí)后，下降速度變得很緩慢，最終在第100小時(shí)后，保持在31. 3X 10_3N/m。本方法用于考察石油污染物降解過程中，紅球菌JZX-Ol產(chǎn)生表滿活性物質(zhì)的能力，表明了在以石油烴為底物的降解過程中可以產(chǎn)生豐富的生物表面活性齊U，降低液體的表面張力，增大水相與油相的接觸面積，提高石油的降解效率和降解程度。
本紅球菌JZX-Ol是由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏的登記號為CGMCC No. 5958的紅球菌；保藏日期是2012年4月9日；保藏單位是中國科學(xué)院微生物研究所，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
權(quán)利要求
1.ー種利用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法，其特征是首先配置降解石油污染物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為硝酸鈉l-3g/L，磷酸ニ氫鉀l_2g/L，磷酸氫ニ鉀l_3g/L，硫酸銨l_3g/L，氯化鈉5-30g/L，硫酸鎂O. Ι-lg/L，微量元素IOmL ;無機(jī)鹽培養(yǎng)液的pH值為6.0-8. 0，取IOOmL無機(jī)鹽培養(yǎng)液分裝到250mL的三角瓶中，通過控制NaCl控制培養(yǎng)液的鹽度范圍為O. 5%-5%，在121°C的高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘；待無機(jī)鹽培養(yǎng)基冷卻后，接種紅球菌JZX-Ol，使得最終的OD_達(dá)到O. 5，在每IOOmL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加石油5_15mL ;將三角瓶放在溫度為25-35°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速是200rpm的搖床中降解石油污染物，降解時(shí)間為10天。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征是所述的微量元素溶液為=MnSO4· 4H200. 4g/L，ZnSO4 · 7H20 O. 5g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g/L, CuSO4 · 5H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 2. Og/L, CaCl2I.Og/L, NaSO4 5. Og/L 或 H3BO3 0. 5g/L。
3.利用紅球菌JZX-Ol降解石油污染物后的測定方法，其特征是所述方法包括 a利用こ醇破解培養(yǎng)液中絮狀漂浮物的紫外分光光度法； b通過利用離心后的正己烷萃取石油污染物的比重法測定總石油降解效率的方法； c氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定石油內(nèi)各種物質(zhì)的降解情況； d通過測量培養(yǎng)液的表面張カ考察生物表面活性劑對石油污染物降解的影響。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的步驟a是利用こ醇破解培養(yǎng)液中絮狀漂浮物的紫外分光光度法，利用こ醇對菌液進(jìn)行定量洗滌，破除菌液中未降解的石油與菌體形成的絮狀漂浮物，使用漩渦振蕩器震破絮狀漂浮物，形成均勻的相后，使用紫外分光光度計(jì)測量菌體濃度。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的步驟b是將降解完的培養(yǎng)液在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心，除去菌體后，上清液用正己烷進(jìn)行萃取，得到剰余的石油；萃取的石油用氮?dú)庠谕L(fēng)櫥中進(jìn)行通風(fēng)，除去正己烷和水分。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的步驟c是利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對降解前后的石油分別進(jìn)行分析，考察石油中不同物質(zhì)的降解情況；石油在進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析前需要用100:1體積比的正己烷進(jìn)行稀釋。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的步驟d是在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入石油烴為唯一碳源，接種紅球菌JZX-Ol使最終的OD6tltl為O. 5，放置于30°C，200rpm的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔8小時(shí)取樣測量培養(yǎng)液的表面張力。石油烴為石油與柴油1:4體積比的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用紅球菌JZX-01對石油污染物的降解及檢測方法；首先配置降解石油污染物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，通過控制NaCl控制培養(yǎng)液的鹽度范圍為0.5%-5%，在121℃的高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘；待無機(jī)鹽培養(yǎng)基冷卻后，接種紅球菌JZX-01，使得最終的OD600達(dá)到0.5，在每100mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加石油5-15mL；將三角瓶放在溫度為25-35℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速是200rpm的搖床中降解石油污染物，降解時(shí)間為10天。利用乙醇破解培養(yǎng)液中絮狀漂浮物的紫外分光光度法；通過利用離心后的正己烷萃取石油污染物的比重法測定總石油降解效率的方法；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定石油內(nèi)各種物質(zhì)的降解情況；通過測量培養(yǎng)液的表面張力考察生物表面活性劑對石油污染物降解的影響。
文檔編號G01N9/36GK102814020SQ20121019997
公開日2012年12月12日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者賈曉強(qiáng), 周征西, 聞建平 申請人:天津大學(xué)