專利名稱：電刺激—毫秒級超低溫快速冷凍方法及其裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及電鏡技術和超低溫快速冷凍技術領域，該技術主要用于生物組織ー細胞超微結構形態(tài)學、功能學、神經(jīng)生物學、生理學等基礎醫(yī)學研究領域，具體涉及ー種配合電鏡樣品制備的電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍方法及其裝置。
背景技術：
在生物醫(yī)學形態(tài)分析領域，需要在電鏡下觀察生物組織在外界刺激作用下的生理超微結構結構變化。這就需要使該生物組織在外界刺激的同時被毫秒級固 定，目前能夠以毫秒級固定生物組織的技術為超低溫快速冷凍技木。生理功能變化所需的刺激及反應均為毫秒級單位，如神經(jīng)沖動傳導、肌組織興奮收縮偶聯(lián)等。因此，毫秒級水平的電刺激與冷凍固定同步技術是研究瞬時生理功能變化時，結構變化的所需條件。目前電鏡的生物樣品固定多為化學固定，化學固定常使生物組織、細胞結構皺縮、腫脹或自溶，造成形態(tài)結構分析的誤差。冷凍固定完全是個物理過程，能夠顯著地提高某些軟生物組織的機械強度。是目前最接近活體狀態(tài)下保存生物組織結構及內(nèi)部元素的唯一方法。雖然冷凍固定能夠瞬時(以毫秒計)凍結生態(tài)狀態(tài)，包括組織形態(tài)結構及細胞內(nèi)元素(特別是可溶性離子)，避免生物組織、細胞結構及內(nèi)部化學成分及位點的改變，但目前的冷凍固定技術還不能與電刺激生物組織同步進行。目前尚無任何有關采用電刺激一超低溫快速冷凍技術可以保持生物組織生理反應時的各種狀態(tài)和生理特征的文獻報道。雖然光學顯微鏡己能做到實時獲取生物組織功能變化時的形態(tài)結構像，但由于光鏡的分辨率及放大倍率的限制，使光鏡的研究水平難以滿足探索超微結構領域的需要。而電鏡雖能以超微結構的水平研究生物組織的形態(tài)，但不能獲得生物組織瞬時生理功能變化時的超微結構形態(tài)像，限制了電鏡技術在生物醫(yī)學領域的發(fā)展。因此，如何與生物組織瞬時生理功能變化同步，獲取生理功能變化時的(即實吋)生物組織超微結構形態(tài)像，使生理功能與形態(tài)學研究能在毫秒級的水平上同步進行，將對電子顯微鏡學、細胞超微結構形態(tài)學、生理學及病理學等學科的發(fā)展有重要意義。而解決了生物組織在毫秒級功能變化時，實時獲得其超微結構形態(tài)像及離子濃度、位點變化的問題，將能獲得生物組織生理功能變化吋，更真實、更多的超微結構信息，從而為基礎醫(yī)學研究、臨床科研及診斷提供一個嶄新的技術方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種為了使生物組織在受到刺激的瞬間即被超低溫快速冷凍固定，便于研究該生物組織各種特定狀態(tài)下生理功能變化時的超微結構形態(tài)變化的方法和專用設備。本發(fā)明提供了ー種電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，可以使生物組織在受到刺激后的毫秒級時間內(nèi)被快速冷凍。
本發(fā)明提供ー種電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，包括樣品臺、垂直滑板、超低溫冷凍室、紅外傳感器A、紅外傳感器B、計時器、程控刺激器和計算機，其中垂直滑板安裝于超低溫冷凍室上，垂直滑板上安裝有樣品臺、樣品臺上安裝有刺激電極；垂直滑板上下兩端各裝有ー個紅外傳感器，其中紅外傳感器A安裝于樣品臺上端，紅外傳感器B安裝于垂直滑板下端與超低溫冷凍儀冷凍室入口處等高，紅外傳感器A、B分別與計時器連接，計時器與計算機連接，計算機控制程控刺激器，程控刺激器與刺激電極相連。所述的垂直滑板上安裝 有樣品臺，樣品臺在彈射按鈕的控制下可以沿垂直方向往下迅速滑動，樣品臺用于放置樣品，特別是生物組織樣品如心肌肌絲、骨骼肌肌絲、神經(jīng)、心肌細胞、骨骼肌細胞等，樣品臺選用銅質(zhì)材料制成。 所述的樣品臺沿垂直滑板向下迅速滑動，是受安裝在垂直滑板上的彈射按鈕控制。樣品臺可在彈射按鈕的彈力作用下迅速向下彈射，使樣品臺上的樣品快速進入超低溫冷凍室。超低溫冷凍室最上端有一冷凍室入口，供樣品臺上的樣品進入。所述的程控刺激器通過刺激輸出導線至刺激電極，可以在樣品臺下滑的過程中對樣品進行電刺激。所述的紅外傳感器A和B輸出的信號控制計時器確定整個樣品臺運行的時程。原理如下樣品臺后部有起遮光作用的遮光片，樣品臺未向下彈射時遮光片擋住傳感器A，使其輸出高電平。開始彈射時，遮光片離開傳感器A,因光電管受到光照,輸出ー低電平信號，打開門控電路，標準時鐘信號(O. ImS脈沖)進入計時器，開始計算時間。當遮光片運行至傳感器B時，遮光片使傳感器B的光電管得不到光照而輸出高電平，關閉門控電路，切斷時鐘信號，而終止計時。同時，所述的紅外傳感器A，輸出的信號同步程控刺激器，使其在樣品臺下降的適當時間對生物組織進行刺激。所述的超低溫冷凍室購自澳大利亞Rechart公司KF80型。所述的計時器用于計算樣品臺從紅外傳感器A到紅外傳感器B所需要的時間。所述的程控刺激器，通過鍵盤可以提前設定程控刺激器的延時、方波個數(shù)、波寬、間隔和幅度等參數(shù)。當收到紅外傳感器A的觸發(fā)信號后，立即啟動刺激其對生物體進行刺激。所述的計算機，還可連接顯示器，用于屏幕作圖，顯示實驗結果；所述的計算機還可存儲實驗結果以備日后查用；所述的計算機還可接輸出設備打印實驗結果。本發(fā)明還提供了ー種使用上述裝置的電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍方法，包括以下步驟A.將需要超低溫快速冷凍的樣品固定于樣品臺上，樣品臺上安裝有刺激電極經(jīng)刺激輸出線與程控刺激器相連接；B.按動彈射按鈕，使樣品臺快速射向冷凍室入ロ，并進入冷凍室；在按動彈射按鈕同時，樣品臺離開紅外傳感器A，紅外傳感器A輸出的信號作為整個下降時間的起始點，觸發(fā)計時器進行計時；當樣品進入超低溫冷凍室吋，紅外傳感器B輸出的信號使計時器終止計時。樣品臺在紅外傳感器A、紅外傳感器B之間運行的時間(即計時器所計時)為總彈射時間T ；
C.在按動彈射按鈕的同時，紅外傳感器A也產(chǎn)生開始信號同步觸發(fā)計算機使程控刺激器開始工作，經(jīng)適當?shù)难訒r時間t后，輸出給定波寬、頻率和幅度的電刺激信號，刺激樣品(刺激參數(shù)可在計算機上進行預設置)。該過程完全在樣品臺彈射的動態(tài)過程中進行。D.電刺激信號產(chǎn)生后的時程為S，它與彈射時間T、延時時間t的關系為S = T_t。S也是生物組織被電刺激后至被固定的時間(生物組織被固定，生理功能即停止)，代表了生物組織被電刺激后，其生理功能變化的時間，設置不同的延時時間t，就可以得到電刺激后不同時間內(nèi)的生理功能變化。程控電刺激器輸出的各刺激參數(shù)如延時、單/復、頻率、波寬以及幅度均可通過計算機進行預置。本發(fā)明的有益效果在于解決與生物組織瞬時生理功能變化同歩，實時獲得其超 微結構形態(tài)像及離子濃度、位點變化的問題，將能獲得生物組織生理功能變化時，更真實、更多的超微結構信息，使生理功能與形態(tài)學研究能在毫秒級的水平上同步進行，將對電子顯微鏡學、細胞超微結構形態(tài)學、生理學及病理學等學科的發(fā)展有重要意義。并為基礎醫(yī)學研究、臨床科研及診斷提供一個嶄新的研究方法，將在生物醫(yī)學的基礎研究、臨床病變的機理研究等許多領域帶來突破性進展。本發(fā)明解決了對生物樣品毫秒級電刺激與冷凍固定同步的技術，是目前世界上唯一的同類技術與儀器。本發(fā)明取得的有益效果可參見本發(fā)明人等前期發(fā)表的文獻1.楊勇驥，邢萱，湯瑩，邵曉良，江鍵，葉煦亭，沈亞峰“肌興奮收縮偶聯(lián)時肌漿網(wǎng)的超微結構研究.”《電子顯微學報》2006，Vol. 25，p217-218。2.楊勇驥，宋田斌，湯瑩，吳越，葉煦亭，沙繼宏等“骨骼肌收縮潛伏期內(nèi)肌漿網(wǎng)結構的毫秒級變化變化研究.”《電子顯微學報》2002，Vol. 21, No. 5，p485_486。3.楊勇驥，孔令山，湯瑩，宋田斌，蘇金蓮，吳越等“骨骼肌興奮收縮偶聯(lián)時肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2 +釋放的形態(tài)一功能變化研究.”《電子顯微學報》2001，Vol. 20，No. 3，pl92_198)。


圖I為本發(fā)明裝置的結構示意圖；圖2為本發(fā)明工作原理圖；圖3為樣品臺彈射時程與刺激時間關系；其中I.樣品臺固定桿；2.樣品臺固定螺絲；3.樣品臺；4.樣品；5垂直滑板；6.冷凍室入口 ；7.超低溫冷凍室；8.彈射按鈕；9.紅外傳感器A ；10.紅外傳感器B ；11.計時器；12.顯示器；13.刺激輸出導線；14.程控刺激器；15.計算機。
具體實施例方式現(xiàn)結合實施例和附圖，對本發(fā)明作進ー步描述，但本發(fā)明的實施并不僅限于此。實施例I :ー種電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，參看圖1，包括樣品臺3、垂直滑板5、超低溫冷凍室7、紅外傳感器A9、紅外傳感器B10、計時器11、程控刺激器14和計算機15，其中垂直滑板安裝于超低溫冷凍室上，垂直滑板上安裝有樣品臺，樣品臺用樣品臺固定桿I和樣品臺固定螺絲2固定，樣品臺上安裝有刺激電極；垂直滑板上下兩端各裝有一個紅外傳感器，其中紅外傳感器A安裝于垂直滑板上端，紅外傳感器B安裝于垂直滑板下端(即與冷凍室入ロ 6等高),紅外傳感器A、B分別與計時器連接,計時器與計算機連接，計算機控制程控刺激器，程控刺激器14通過刺激輸出導線13至刺激電極。如圖2所示，紅外門控電路的輸入端接標準時鐘信號，輸出端與計數(shù)器相連接，該門控電路受傳感器A和B的控制，當標本臺離開傳感器A時此門打開，允許計數(shù)器計數(shù)，當標本臺下滑至傳感器B時關閉此門，計數(shù)結束。計數(shù)結果(時間)被送給計算機15作圖，圖可在顯示器12上顯示。實施例2 小鼠心肌的電刺激-超低溫快速冷凍。小鼠心臟取出后，采用玻璃分針將其分離成肌絲，然后A.將小鼠心肌肌絲固定于樣品臺3上，并用刺激電極插入小鼠心肌肌絲兩端，刺激電極經(jīng)刺激輸出導線13與程控刺激器14相連接； B.按動彈射按鈕8，使樣品臺快速射向冷凍室入口 6，并進入超低溫冷凍室；在按動彈射按鈕同時，樣品臺離開紅外傳感器A9，紅外傳感器A輸出的信號作為整個下降時間的起始點，觸發(fā)計時器進行計時；當樣品進入超低溫冷凍室時，紅外傳感器BlO輸出的信號使計時器終止計時，樣品臺在紅外傳感器A、紅外傳感器B之間運行的時間(即計時器所計時)為總彈射時間T ；C.在按動彈射按鈕的同時，紅外傳感器A也產(chǎn)生開始信號同步觸發(fā)計算機使程控刺激器開始工作，經(jīng)適當?shù)难訒r時間(可用計算機程序設置)后，輸出給定波寬、頻率和幅度的電刺激信號，刺激樣品。該過程完全在樣品臺彈射的動態(tài)過程中進行。電刺激信號后的時程為S，它與彈射時間T、延時時間t的關系為S = T-t (如圖3所示)。本實施例中彈射時間T=12mS。程控電刺激器輸出的各刺激參數(shù)刺激延時t=5mS、單/復=復、頻率=30Hz、波寬=0. 3mS、幅度=1. 8V，均通過計算機在實驗前預置。D.電刺激信號后的時程為S=T-t=12mS-5mS=7mS，也就是說生物組織被電刺激7mS以后即被冷凍固定，生物組織的生理功能變化停止。實施例3:蛙骨骼肌的電刺激-超低溫快速冷凍。從蛙大腿處分離得到骨骼肌肌束，然后A.將蛙骨骼肌肌束固定于樣品臺上，并用刺激電極插入蛙骨骼肌肌束兩端，刺激電極經(jīng)刺激輸出線與程控刺激器相連接；B.同實施例2的步驟B ；C.同實施例2的步驟C本實施例中彈射時間T=12mS。程控電刺激器輸出的各刺激參數(shù)延時=10mS、單/復=復、頻率=50Hz、波寬=0. 2mS、幅度=3. 5V，均通過計算機在實驗前預置。D.電刺激信號后的時程為S=T-t=12mS-10mS=2mS，也就是說生物組織被電刺激2mS以后即被冷凍固定，生物組織的生理功能變化停止。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
權利要求
1.ー種電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，其特征在于，該裝置包括樣品臺(3)、垂直滑板(5)、超低溫冷凍室(7)、紅外傳感器A (9)、紅外傳感器B (10)、計時器(11)、程控刺激器(14)和計算機(15)，其中的垂直滑板安裝于超低溫冷凍室上，垂直滑板上安裝有樣品臺、樣品臺上安裝有刺激電極；垂直滑板上下兩端各裝有ー個紅外傳感器，其中紅外傳感器A安裝于樣品臺上端，紅外傳感器B安裝于垂直滑板下端與超低溫冷凍室的冷凍室入口(6)等高,紅外傳感器A、紅外傳感器B分別與計時器連接；計時器與計算機連接；計算機控制程控刺激器，程控刺激器與刺激電極相連。
2.根據(jù)權利要求I所述的電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，其特征在于，其中的樣品臺(3)，在安裝在垂直滑板(5)上的彈射按鈕(8)的控制下，沿垂直滑板往下迅速滑動。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，其特征在于，程控刺激器(14)通過刺激輸出導線(13)至刺激電極，可以在樣品臺下滑的過程中對樣品進行電刺激。
4.根據(jù)權利要求I或2所述的電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，其特征在于，所述的紅外傳感器A (9)和紅外傳感器B (10)輸出的信號控制計時器(11)。
5.根據(jù)權利要求4所述的電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，其特征在于，所述的紅外傳感器A (9)輸出的信號同步程控刺激器(14)。
6.根據(jù)權利要求I或2所述的電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍裝置，其特征在于，所述的計算機(15)，還連接顯示器(12)。
7.ー種使用如權利要求I所述裝置的電刺激一毫秒級超低溫快速冷凍方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 A.將需要超低溫快速冷凍的樣品固定于樣品臺上，樣品臺上安裝有刺激電極經(jīng)刺激輸出線與程控刺激器相連接； B.按動彈射按鈕，使樣品臺快速射向冷凍室入口，并進入超低溫冷凍室；在按動彈射按鈕同時，樣品臺離開紅外傳感器A，紅外傳感器A輸出的信號作為整個下降時間的起始點，觸發(fā)計時器進行計時；當樣品進入超低溫冷凍室吋，紅外傳感器B輸出的信號使計時器終止計時；樣品臺在紅外傳感器A、紅外傳感器B之間運行的時間為總彈射時間T ； C.在按動彈射按鈕的同時，紅外傳感器A也產(chǎn)生開始信號同步觸發(fā)計算機使程控刺激器開始工作，經(jīng)適當?shù)难訒r時間t后，輸出給定波寬、頻率和幅度的電刺激信號，刺激樣品，刺激參數(shù)可在計算機上進行預設置； D.電刺激信號產(chǎn)生后的時程為S，它與彈射時間T、延時時間t的關系為S= T-t。
全文摘要
本發(fā)明涉及電鏡技術和超低溫快速冷凍技術領域，本發(fā)明的目的在于提供一種為了使生物組織在受到刺激的瞬間即被超低溫快速冷凍固定，便于研究該生物組織各種特定狀態(tài)下生理功能變化時的超微結構形態(tài)變化的方法和專用設備。本發(fā)明的設備包括樣品臺(3)、垂直滑板(5)、超低溫冷凍室(7)、紅外傳感器A(9)、紅外傳感器B(10)、計時器(11)、程控刺激器(14)和計算機(15)等。本發(fā)明解決與生物組織瞬時生理功能變化同步，實時獲得其超微結構形態(tài)像及離子濃度、位點變化的問題，將能獲得生物組織生理功能變化時，更真實、更多的超微結構信息，使生理功能與形態(tài)學研究能在毫秒級的水平上同步進行，將對電子顯微鏡學、細胞超微結構形態(tài)學、生理學及病理學等學科的發(fā)展有重要意義。
文檔編號G01N1/42GK102692344SQ201210162569
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權日2012年5月21日
發(fā)明者夏金輝, 楊勇驥, 湯瑩, 雷長海 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學