專(zhuān)利名稱(chēng)：圖像數(shù)據(jù)處理的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及圖像數(shù)據(jù)處理的方法和系統(tǒng)。某些實(shí)施方式涉及執(zhí)行用于多重應(yīng)用中顆粒圖像處理的一個(gè)或多個(gè)步驟的方法和系統(tǒng)。相關(guān)技術(shù)描述以下描述和示例并不因其包含在本節(jié)中而被歸入現(xiàn)有技術(shù)。使用諸如電荷耦合裝置(CXD)檢測(cè)器之類(lèi)的檢測(cè)器成像被應(yīng)用在生物技術(shù)應(yīng)用的若干當(dāng)前可用儀器中。許多商用系統(tǒng)被配置成對(duì)目標(biāo)人類(lèi)(或其它動(dòng)物)細(xì)胞成像。然而，這些系統(tǒng)不能用來(lái)使用不同波長(zhǎng)的光生成圖像以確定細(xì)胞的身份或者細(xì)胞所屬亞類(lèi)。對(duì)于將CCD檢測(cè)器用于測(cè)量細(xì)胞的熒光發(fā)射的多重應(yīng)用而言，細(xì)胞或其它顆粒的亞類(lèi)或類(lèi)基于熒光發(fā)射在圖像中的絕對(duì)位置而非諸如波長(zhǎng)成分的熒光發(fā)射特征。因此，期望開(kāi)發(fā)一種用于多重應(yīng)用中顆粒圖像數(shù)據(jù)處理的方法和系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
以上所列問(wèn)題大部分可由一種執(zhí)行與顆粒的數(shù)據(jù)圖像處理相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)步驟的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)來(lái)解決。以下僅為該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的示例性實(shí)施方式，不應(yīng)以任何方式解讀為對(duì)權(quán)利要求書(shū)的主題的限制。該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的實(shí)施方式可被配置成將帶有與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像劃分成分區(qū)陣列，確定對(duì)分區(qū)內(nèi)多個(gè)像素測(cè)得的光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值，并將所確定的統(tǒng)計(jì)值指派為對(duì)應(yīng)分區(qū)的背景信號(hào)。除此以外或作為替代，該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的其它實(shí)施方式可被配置成分析帶有與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像，以標(biāo)識(shí)圖像內(nèi)呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)值高于第一預(yù)定閾值的一個(gè)或多個(gè)像素。此外，該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)還可以被配置成在一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素的集合內(nèi)確定在該集合內(nèi)分別呈現(xiàn)最大光學(xué)參數(shù)值的位置，并計(jì)算在這些位置中的至少一個(gè)周?chē)亩鄠€(gè)像素的光學(xué)參數(shù)強(qiáng)度變化率。除此之外或作為替代，該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的其它實(shí)施方式可被配置成獲取顆粒的多個(gè)圖像的數(shù)據(jù)，其中多個(gè)圖像的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于一不同波長(zhǎng)帶。此外，該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)可被配置成創(chuàng)建多個(gè)圖像的合成圖像，并操控多個(gè)圖像中至少一個(gè)的坐標(biāo)使得對(duì)應(yīng)于多個(gè)圖像中每一個(gè)內(nèi)顆粒的斑點(diǎn)在隨后的合成圖像內(nèi)會(huì)聚。除此之外或作為替代，該 計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的其它實(shí)施方式可被配置成分析帶有均勻濃度的與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的第一圖像以及帶有未知濃度的與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的第二圖像，以分別標(biāo)識(shí)第一和第二圖像內(nèi)呈現(xiàn)高于第一預(yù)定閾值的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。此外，該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)可被配置成在第一和第二圖像的各自分區(qū)內(nèi)對(duì)分別在分析第一和第二圖像的步驟中標(biāo)識(shí)的像素集合進(jìn)行歸類(lèi)，其中第一和第二圖像中 分區(qū)的尺寸基本上相等。該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)還可被配置成對(duì)第一圖像內(nèi)的每個(gè)相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生像素集合所歸類(lèi)到的熒光發(fā)射水平的統(tǒng)計(jì)代表量。此外，該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)可被配置成分區(qū)將在分析第二圖像的步驟期間標(biāo)識(shí)的每個(gè)像素集合的熒光發(fā)射水平除以對(duì)相應(yīng)的第一圖像分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量，以獲得歸一化的熒光值。附圖
簡(jiǎn)述通過(guò)閱讀以下詳細(xì)描述并參照附圖，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)，在附圖中圖I是示出被配置成為多重應(yīng)用的獲取和處理圖像的系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方式的橫截面圖的示意圖；圖2是描繪確定圖像內(nèi)背景信號(hào)的方法的流程圖；圖3是描繪發(fā)現(xiàn)顆粒并判定是接受還是拒絕對(duì)顆粒進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理的方法的流程圖；圖4是描繪圖像間對(duì)準(zhǔn)的方法的流程圖；以及圖5是描繪用于為成像系統(tǒng)創(chuàng)建歸一化矩陣并將該歸一化矩陣應(yīng)用于后續(xù)成像的方法的流程圖。雖然本發(fā)明允許各種變體和替換形式，但是在附圖中通過(guò)示例的方式示出其具體實(shí)施方式
，并在本文中進(jìn)行詳細(xì)描述。然而應(yīng)該理解，附圖和詳細(xì)描述并不旨在將本發(fā)明限制于所公開(kāi)的特定形式，相反，本發(fā)明涵蓋落在由所附權(quán)利要求書(shū)限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的所有變體、等效方案和替換方案。較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述雖然本文針對(duì)顆粒描述各實(shí)施方式，但是應(yīng)該理解，本文所述的系統(tǒng)和方法也可用于微球、聚苯乙烯小珠、微粒、金納米顆粒、量子點(diǎn)、納米點(diǎn)、納米顆粒、納米殼、小珠、微珠、膠乳顆粒、膠乳小珠、熒光小珠、熒光顆粒、著色顆粒、著色小珠、組織、細(xì)胞、微生物、有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、或本領(lǐng)域中已知的任何其它離散物質(zhì)。顆?？捎米鞣肿臃磻?yīng)的媒介。在 Fulton 的美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，736，330、Chandler 等人的 No. 5，981，180、Fulton 的No. 6，057，107、Chandler 等人的 No. 6，268，222、Chandler 等人的 No. 6，449，562、Chandler等人的 No. 6，514，295、Chandler 等人的 No. 6，524，793 以及 Chandler 的 No. 6，528，165 中示出并描述了適當(dāng)顆粒的示例，這些專(zhuān)利被結(jié)合于此，如同在本文中詳盡闡述一樣。本文所描述的系統(tǒng)和方法可用于在這些專(zhuān)利中描述的任何顆粒。此外，在本文所描述的方法和系統(tǒng)實(shí)施方式中使用的顆?？蓮闹T如得克薩斯州奧斯汀市的盧米尼克斯公司(LuminexCorporation)的制造商處購(gòu)得。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“顆?！焙汀拔⑶颉笨上嗷ソ粨Q。此外，與本文所描述的系統(tǒng)和方法兼容的顆粒類(lèi)型包括帶有附加到顆粒表面或者與顆粒表面相關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒。在Chandler等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 6，268，222以及Chandler等人的No. 6，649，414中示出并描述了這些顆粒類(lèi)型，其中熒光染料或熒光顆粒被直接耦聯(lián)到顆粒表面以提供歸類(lèi)熒光(即經(jīng)測(cè)量并用于確定顆粒身份或顆粒所屬亞類(lèi)的熒光發(fā)射)，這些專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合于此，如同在本文中詳盡闡述一樣。可用于本文所述方法和系統(tǒng)的顆粒類(lèi)型還包括將一種或多種熒光物或熒光染料納入顆粒核中的顆粒?？捎糜诒疚乃枋龅姆椒ê拖到y(tǒng)的顆粒還包括到曝露在一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)光源下時(shí)其內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)熒光信號(hào)的顆粒。此外，還可以將顆粒制成在這些顆粒被激發(fā)時(shí)呈現(xiàn)多個(gè)熒光信號(hào)，每一個(gè)信號(hào)可單獨(dú)或結(jié)合起來(lái)用于確定顆粒的身份。如下所述，圖像數(shù)據(jù)處理可包括顆粒歸類(lèi)，尤其是對(duì)于多分析物流體，以及確定綁定到顆粒上的分析物的量。由于在操作過(guò)程中表示綁定到顆粒的分析物的量的指示信號(hào)通常是未知的，因此對(duì)本文所描述的過(guò)程可使用特殊染色的顆粒，這些顆粒不僅發(fā)射歸類(lèi)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶內(nèi)的熒光，而且發(fā)射指示波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶內(nèi)的熒光。本文所描述的方法通常包括分析一個(gè)或多個(gè)顆粒圖像并處理從圖像測(cè)得的數(shù)據(jù)以確定顆粒的一個(gè)或多個(gè)特征，諸如，但不限于表示顆粒在多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射大小的數(shù)值?？筛鶕?jù)Fulton的美國(guó)專(zhuān)利No. 5，736，330、Chandler等人的No. 5,981, 180、Chandler 等人的 No. 6, 449, 562、Chandler 等人的 No. 6, 524, 793、Chandler 的No. 6，592，822以及Chandler等人的No. 6，939，720中描述的方法對(duì)顆粒的一個(gè)或多個(gè)特征進(jìn)行后續(xù)處理，諸如使用一個(gè)或多個(gè)數(shù)值來(lái)確定表示顆粒所屬的多重復(fù)用亞類(lèi)的標(biāo)志ID和/或表示綁定到顆粒表面的分析物的存在和/或量的指示值，這些專(zhuān)利通過(guò)應(yīng)用結(jié)合于此，如同在本文中詳盡闡述一樣。在一個(gè)示例中，Chandler等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 5,981，180 中描述的技術(shù)可在多重復(fù)用方案中與本文描述的熒光測(cè)量一起使用，其中將顆粒歸類(lèi)歸類(lèi)成亞類(lèi)用以分析單個(gè)樣品中的多個(gè)分析物。參照附圖，注意，圖I并未按比例繪制。特別地，明顯放大圖中某些元件的比例，以強(qiáng)調(diào)這些元件的特征。為清楚起見(jiàn)，圖中并未包含系統(tǒng)的某些元件。圖I示出被配置成根據(jù)本文所述方法的各個(gè)實(shí)施方式生成、獲取或提供顆粒圖像并對(duì)圖像進(jìn)行處理的一個(gè)系統(tǒng)實(shí)施方式。圖I所示的系統(tǒng)可在諸如顆粒的多分析物測(cè)量的應(yīng)用中使用。該系統(tǒng)包括含有光源10的成像子系統(tǒng)。光源10可包括一個(gè)或多個(gè)光源，諸如發(fā)光二極管(LED)、激光器、弧光燈、白熾燈、或本領(lǐng)域中任何其它合適光源。除此之外或作為替代，光源可包括一個(gè)以上的光源(未示出)，每個(gè)光源被配置成生成不同波長(zhǎng)或不同波長(zhǎng)帶的光。用于圖I所示系統(tǒng)的適當(dāng)光源組合的一個(gè)示例包括，但不限于兩個(gè)或多個(gè)LED?？赏ㄟ^(guò)分束器(未示出)或本領(lǐng)域中已知的任何其它合適光學(xué)元件將來(lái)自一個(gè)以上光源的光組合到共用照明光路中，使得來(lái)自這些光源的光可被同時(shí)導(dǎo)向顆粒?；蛘?，成像子系統(tǒng)可以包括諸如反射鏡的光學(xué)元件(未示出)以及被配置成取決于使用哪個(gè)光源來(lái)照射顆粒而將該光學(xué)元件移進(jìn)和移出照射光路的器件(未示出)。以這種方式，可以使用光源來(lái)以不同光波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶依次照射顆粒。(多個(gè))光源還可以從基板(未示出)上方而非下方照射基板。光源可被選擇成提供使顆?；蝰盥?lián)其上的材料發(fā)射熒光的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光。作為實(shí)例，可將波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶選擇成激發(fā)納入顆粒中和/或耦聯(lián)到顆粒表面的熒光染料或其它熒光材料。以這種方式，可將波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶選擇成使顆粒發(fā)射用于顆粒歸類(lèi)的熒光。此夕卜，波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶可以被選擇成使顆粒發(fā)射用于檢測(cè)和/或量化在顆粒表面上發(fā)生的反應(yīng)的突光。如圖I所示，成像子系統(tǒng)可以包括被配置成將光從光源10引導(dǎo)到顆粒16所固定的基板14的光學(xué)元件12。在一個(gè)示例中，光學(xué)元件12可以是準(zhǔn)直透鏡。然而，光學(xué)元件12可以包括能夠用于對(duì)從光源10到基板14的光進(jìn)行成像的任何其它適當(dāng)光學(xué)元件。此外，雖然在圖I中將光學(xué)元件示為單個(gè)光學(xué)元件，但是應(yīng)該理解，光學(xué)元件12可以包括一個(gè)以上的折射元件。此外，雖然在圖I中將光學(xué)元件12示為折射光學(xué)元件，但是應(yīng)該理解，可使用一個(gè)或多個(gè)反射光學(xué)元件(可能與一個(gè)或多個(gè)折射光學(xué)元件組合)來(lái)對(duì)從光源10到基本14的光進(jìn)行成像。 顆粒16可以包括以上所述的任何顆粒。基板14可以包括本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)基板。固定在基板14上的顆粒可被置于用于保持基板14和在其上固定的顆粒16相對(duì)于成像子系統(tǒng)的位置的成像室(未示出)或任何其它器件中。用于保持基板14的位置的器件也可被配置成在成像之前改變?cè)摶宓奈恢?例如將成像系統(tǒng)聚焦在基板上)?？梢允褂么判晕?、真空過(guò)濾板、或本領(lǐng)域中已知的任何其它適當(dāng)方法在基板上對(duì)顆粒進(jìn)行固定。用于定位微球以供成像的方法和系統(tǒng)的示例在Pempsell的2005年11月9日提交的序列號(hào)為11/270，786的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中有描述，該申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合于此，如同在本文中詳盡闡述一樣。顆粒固定方法本身對(duì)本文所述的方法和系統(tǒng)并不十分重要。然而，較佳地將顆粒固定成使顆粒在檢測(cè)器積分時(shí)段沒(méi)有可感知的運(yùn)動(dòng)，該時(shí)段可能幾秒鐘長(zhǎng)。如圖I所示，成像子系統(tǒng)可包括光學(xué)元件18和分束器20。光學(xué)元件18被配置成將來(lái)自基板14和在其上固定的顆粒16的光聚焦到分束器20。還可以如上相對(duì)于光學(xué)元件12所述地配置光學(xué)元件18。分束器20可以包括本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)分束器。分束器20可被配置基于光的波長(zhǎng)將來(lái)自光學(xué)元件18的光導(dǎo)向不同的檢測(cè)器。例如，具有第一波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光可透過(guò)分束器20，而具有與第一波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶不同的第二波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光可被分束器20反射。成像子系統(tǒng)還可以包括光學(xué)元件22和檢測(cè)器24。透過(guò)分束器20的光可被導(dǎo)向光學(xué)元件22。光學(xué)元件22被配置成將透過(guò)分束器的光聚焦到檢測(cè)器24上。成像子系統(tǒng)還可以包括光學(xué)兀件26和檢測(cè)器28。被分束器20反射的光可被導(dǎo)向光學(xué)兀件26。光學(xué)元件26被配置成將由分束器反射的光聚焦到檢測(cè)器28上?？梢匀缟舷嚓P(guān)于光學(xué)元件12所述地配置光學(xué)元件22和26。檢測(cè)器24和28可以包括例如，電荷耦合裝置(CCD)檢測(cè)器或本領(lǐng)域中已知的任何其它合適成像檢測(cè)器，諸如CMOS檢測(cè)器、光敏元件的二維陣列、時(shí)間延遲積分(TDI)檢測(cè)器等。在某些實(shí)施方式中，可使用諸如二維CCD成像陣列的檢測(cè)器來(lái)同時(shí)獲取基本上整個(gè)基板的圖像或固定在基板上的全部顆粒的圖像。以這種方式，來(lái)自基板上所照射區(qū)域的所有光子可被同時(shí)采集，由此消除因在包括光電倍增管(PMT)和掃描器件的其它當(dāng)前可用系統(tǒng)中使用采樣開(kāi)口而導(dǎo)致的誤差。此外，該系統(tǒng)中包含的檢測(cè)器的數(shù)目可以等于感興趣的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶數(shù)，使得每個(gè)檢測(cè)器用于生成波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶之一下的圖像?？墒褂迷O(shè)置在從分束器到檢測(cè)器的光路中的光學(xué)帶通元件(未示出)或者本領(lǐng)域中已知的任何其它合適光學(xué)元件，來(lái)對(duì)由檢測(cè)器生成的每個(gè)圖像進(jìn)行光譜濾波。所捕捉的每個(gè)圖像使用不同的濾波“帶”?？梢詫@取圖像的每個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的檢測(cè)波長(zhǎng)中心和寬度可與感興趣的熒光發(fā)射相匹配，無(wú)論是用于顆粒歸類(lèi)還是指示信號(hào)。以這種方式，可將圖I所示的系統(tǒng)的成像子系統(tǒng)配置成同時(shí)在不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上生成多個(gè)圖像。雖然圖I所示的系統(tǒng)包括兩個(gè)檢測(cè)器，但是應(yīng)該理解，該系統(tǒng)可以包括兩個(gè)以上的檢測(cè)器(例如三個(gè)檢測(cè)器、四個(gè)檢測(cè)器等等)。如上所述，可將每個(gè)檢測(cè)器配置成通過(guò)包括用于同時(shí)將不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光導(dǎo)向不同檢測(cè)器的一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件，來(lái)同時(shí)在不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上生成圖像。此外，雖然在圖I中將該系統(tǒng)示為包括多個(gè)檢測(cè)器，但是應(yīng)該理解，該系統(tǒng)可以包括單個(gè)檢測(cè)器。單個(gè)檢測(cè)器可用于在多個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上依次生成多個(gè)圖像。例如，可將不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光依次導(dǎo)向基板，并在使用不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的每一個(gè)照射基板的過(guò)程中生成不同的圖像。在另一示例中，可以更改用于選擇導(dǎo)向單個(gè)檢測(cè)器的光的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶(例如通過(guò)將不同的濾波器移進(jìn)和移出成像光路)，以在不同的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上依次生成圖像因此，將圖I所示的成像子系統(tǒng)配置成生成表示顆粒在若干感興趣的波長(zhǎng)上的熒光發(fā)射的多個(gè)圖像或一個(gè)圖像系列。此外，該系統(tǒng)可被配置成向處理器(即處理引擎)提供表示顆粒的熒光發(fā)射的多個(gè)數(shù)字圖像或數(shù)字圖像系列。在一個(gè)這種示例中，該系統(tǒng)可以包括處理器30。處理器30可被配置成從檢測(cè)器24和28獲取(例如接收)圖像數(shù)據(jù)。例如，可采用本領(lǐng)域中已知的任何合適方式(例如經(jīng)由傳輸介質(zhì)(未示出)，每個(gè)介質(zhì)通過(guò)各自耦合在檢測(cè)器之一與處理器之間的諸如模數(shù)轉(zhuǎn)換器的一個(gè)或多個(gè)電子組件將檢測(cè)器之一耦合到處理器)將處理器30耦合到檢測(cè)器24和28。較佳地，處理器30被配置成處理和分析這些圖像以確定顆粒16的一個(gè)或多個(gè)特性，諸如顆粒歸類(lèi)以及與在顆粒表面上發(fā)生的反應(yīng)有關(guān)的信息。可由處理器以任何合適格式輸出該一個(gè)或多個(gè)特性，諸如具有在每個(gè)波長(zhǎng)下每個(gè)顆粒的熒光大小的條目的數(shù)據(jù)陣列。具體而言，處理器可被配置成執(zhí)行本文所述的方法實(shí)施方式的一個(gè)或多個(gè)步驟來(lái)處理和分析圖像。處理器30可以是諸如通常包括在典型的個(gè)人計(jì)算機(jī)、大型計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、工作站等中的處理器。一般而言，術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)系統(tǒng)”可以被寬泛地定義成涵蓋具有執(zhí)行來(lái)自存儲(chǔ)器介質(zhì)的指令的一個(gè)或多個(gè)處理器的任何設(shè)備?？梢允褂萌魏纹渌m當(dāng)功能硬件來(lái)實(shí)現(xiàn)處理器。例如，處理器可以包括在固件中含有固定程序的數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)、現(xiàn)場(chǎng)可編程門(mén)陣列(FPGA)、或者采用以諸如極高速集成電路(VHSIC)硬件描述語(yǔ)言(VHDL) “編寫(xiě)”的順序邏輯的其它可編程邏輯器件(PLD)。在另一示例中，可在處理器30上執(zhí)行以執(zhí)行本文所述的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法的一個(gè)或多個(gè)步驟的程序指令(未示出)可以按需采用諸如C#(部分適當(dāng)采用C++)、ActiveX控件、JavaBeans、微軟基礎(chǔ)類(lèi)(MFC)的高級(jí)語(yǔ)言或其它技術(shù)或方法來(lái)編碼?？刹捎酶鞣N方式中的任一種來(lái)實(shí)現(xiàn)程序指令，包括基于過(guò)程的技術(shù)、基于組件的技術(shù)、和/或面向?qū)ο蟮募夹g(shù)等。實(shí)現(xiàn)諸如本文所述的方法的程序指令可在存儲(chǔ)介質(zhì)上傳送或者在其上存儲(chǔ)。存儲(chǔ)介質(zhì)可以包括，但不限于只讀存儲(chǔ)器、隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、磁盤(pán)或光盤(pán)、或者磁帶。對(duì)于每個(gè)圖像，可將所有定位的顆粒以及針對(duì)每個(gè)所標(biāo)識(shí)顆粒確定的值和/或統(tǒng)計(jì)量存儲(chǔ)在存儲(chǔ)介質(zhì)內(nèi)的存儲(chǔ)器介質(zhì)中。本文所述的圖像處理方法可以通過(guò)采用一個(gè)或多個(gè)算法來(lái)執(zhí)行。如以下更詳細(xì)描述地，這些算法可能是復(fù)雜的，因此最好通過(guò)計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)。這樣，本文中特別參照?qǐng)D2-5所述的方法可被稱(chēng)為“計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法”，因此在本文中，術(shù)語(yǔ)“方法”和“計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法”可以交換使用。注意，在某些情況下，計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法和本文所述系統(tǒng)的程序指令可被配置成執(zhí)行除了與本文所述方法相關(guān)聯(lián)的那些之外的進(jìn)程，因此，計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法和本文所述系統(tǒng)的程序指令沒(méi)有必要局限于圖2-5的描述。本文所述的基于成像的系統(tǒng)是替代傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)類(lèi)型的測(cè)量系統(tǒng)的可行候選。本文所述的方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)在數(shù)據(jù)處理方面可以比基于流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用所必需的更加復(fù)雜。然而，本文所述系統(tǒng)的硬件(例如光源、光學(xué)元件、檢測(cè)器等)具有比典型流式細(xì)胞術(shù)便宜和耐用得多的可能。期望對(duì)本文所述的方法的進(jìn)一步評(píng)估和改進(jìn)(例如可用于實(shí)現(xiàn)這些方法的算法的進(jìn)一步評(píng)估和改進(jìn))會(huì)導(dǎo)致對(duì)處理能力的需要降低、對(duì)熒光發(fā)射值的確定更加準(zhǔn)確、以及因此對(duì)顆粒的一個(gè)或多個(gè)特性的確定更加準(zhǔn)確。根據(jù)一實(shí)施方式，用于圖像數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法包括以下步驟(即高級(jí)操作)的一個(gè)或多個(gè)背景信號(hào)測(cè)量、使用歸類(lèi)染料發(fā)射和群集排異來(lái)標(biāo)識(shí)(即發(fā)現(xiàn))顆粒、圖像間對(duì)準(zhǔn)、圖像間顆粒校正、指示發(fā)射的熒光積分、以及圖像平面歸一化。這些步驟可通過(guò)以上所列次序來(lái)依次執(zhí)行。
一般而言，可以執(zhí)行背景信號(hào)測(cè)量，使得從顆粒發(fā)射的熒光被準(zhǔn)確確定(即來(lái)自顆粒的熒光測(cè)量可獨(dú)立于圖像背景中的反射光水平以及來(lái)自用于對(duì)顆粒成像的成像系統(tǒng)的噪聲和暗電流偏移來(lái)確定)。圖2示出表示用于測(cè)量圖像的背景信號(hào)的示例性步驟序列的流程圖。如圖2的框40所示，該方法可以包括將具有與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像分成分區(qū)陣列。這一陣列可以包括任意數(shù)目的行和列，這取決于所需背景信號(hào)的清晰度、系統(tǒng)的處理能力、和/或正在分析的顆粒數(shù)。如圖2進(jìn)一步示出的，該方法在框40之后所沿的路徑可以取決于圖像內(nèi)顆粒的占有率。具體而言，在框40之后，該流程進(jìn)行到框42，其中對(duì)圖像內(nèi)的顆粒占有率是否被量化進(jìn)行判定。在其中顆粒占有率已被量化的實(shí)施方式中，該方法可以進(jìn)行到框44，其中對(duì)占有率是否小于預(yù)定閾值進(jìn)行判定。圖2的流程圖在框44中具體指出了 50%占有率的閾值，但是注意，該方法并不受限于此。特別地，可以將該方法更改成考慮任何預(yù)定的占有率值，由此確定測(cè)量圖像背景信號(hào)的動(dòng)作路線(xiàn)。在感興趣的顆粒占據(jù)小于預(yù)定閾值(例如小于約50% )的圖像區(qū)域的實(shí)施方式中，背景信號(hào)測(cè)量可以包括在分區(qū)內(nèi)的所有像素中確定光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值，如框46所示。因此，可將與該分區(qū)內(nèi)的顆粒對(duì)應(yīng)的相對(duì)較亮像素的熒光值與來(lái)自該分區(qū)內(nèi)背景像素(不與像素出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的像素)的信號(hào)合并。然而，由于顆粒占據(jù)較小量的分區(qū)，所以統(tǒng)計(jì)值更能代表背景像素。一般而言，統(tǒng)計(jì)值可以包括任意數(shù)目的統(tǒng)計(jì)參數(shù)，包括但不限于，中值、平均值、模和截尾平均值。在某些實(shí)施方式中，確定中值是特別有益的。在其它實(shí)施方式中，該方法可以進(jìn)行到框50、52和54，以確定小于分區(qū)內(nèi)全部像素的光學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)值。特別地，在感興趣的顆粒的占有率大于或等于成像區(qū)域的預(yù)定閾值(例如大于或等于約50%，如連接框44和框50的箭頭所示)的實(shí)施方式中，或者當(dāng)顆粒對(duì)成像區(qū)域的占有率尚為未知(例如如連接框42和框50的箭頭所示)的實(shí)施方式中，背景信號(hào)測(cè)量的方法可以通過(guò)確定小于分區(qū)內(nèi)全部像素的光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值來(lái)補(bǔ)償顆粒區(qū)域與背景區(qū)域的較大或未知比值。特別地，可以標(biāo)識(shí)圖像內(nèi)呈現(xiàn)預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的像素，如框50所示。在某些情況下，在框50中標(biāo)識(shí)的像素可以與緊鄰排列的像素形成組，如框52所示。然而，這一過(guò)程步驟是可任選地，如該框的虛線(xiàn)邊界所示，因此在某些情況下可從該方法刪除。在任一情況下，該方法可以進(jìn)行到框54，其中只在該分區(qū)內(nèi)未被標(biāo)識(shí)為呈現(xiàn)預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)(如框50所述)的一組像素中確定光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值。在某些實(shí)施方式中，也可以根據(jù)光學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)值的確定排除與這些所標(biāo)識(shí)像素形成組的像素。以這種方式，在框50中標(biāo)識(shí)的像素以及(在某些情況下)與在框52所標(biāo)識(shí)的像素形成組的像素可被與背景信號(hào)的測(cè)量隔離。在任一情況下，無(wú)論所使用的過(guò)程步驟序列如何，其統(tǒng)計(jì)值被確定的光學(xué)參數(shù)可以是在一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下所測(cè)量的顆粒的任何熒光發(fā)射、圖像背景中的散射光發(fā)射、以及來(lái)自用于對(duì)顆粒成像的成像系統(tǒng)的任何噪聲和暗電流偏移。此外，無(wú)論所使用的過(guò)程步驟序列如何，該方法可以進(jìn)行到框56，以將所確定的統(tǒng)計(jì)值指派為對(duì)應(yīng)分區(qū)的背景信號(hào)。更具體地，分區(qū)內(nèi)全部像素的背景信號(hào)水平可被賦予對(duì)該分區(qū)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)值。在某些情況下，可對(duì)圖像中的其它分區(qū)重復(fù)框46、50、52、54和56的過(guò)程步驟，并且在某些情況下，對(duì)圖像中的全部分區(qū)重復(fù)。以這種方式，對(duì)多個(gè)分區(qū)的每一個(gè)以及在某些情況下對(duì)全部分區(qū)，確定光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值。在某些情況下，在兩個(gè)分區(qū)的邊界處可能會(huì)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)值的相對(duì)尖銳的反差。為了平滑相鄰分區(qū)之間統(tǒng)計(jì)值的不連續(xù)差異，可對(duì)分區(qū)陣列執(zhí)行二維統(tǒng)計(jì)濾波(例如中值濾波或均值濾波)。結(jié)果，分區(qū)可在其邊界處得到平滑。無(wú)論是否使用統(tǒng)計(jì)濾波，可將包含所計(jì)算統(tǒng)計(jì)值的所得nxm像素分區(qū) 矩陣存儲(chǔ)為“背景圖像”，可如下進(jìn)一步所述地使用該矩陣。注意，參照?qǐng)D2所述的方法可以包括上述用于背景信號(hào)測(cè)量的方法的附加步驟，因此，該方法沒(méi)有必要受限于圖2的描述。例如，省略圖2的框46、50、52、54和56的重復(fù)并非必然限制本文所述的方法對(duì)這一可能性的包含。如上所述，本文所述的用于圖像數(shù)據(jù)處理的方法可以包括使用來(lái)自歸類(lèi)染料和群集排斥(即位置相對(duì)靠近的顆粒的排斥)的熒光發(fā)射來(lái)發(fā)現(xiàn)顆粒的過(guò)程。在某些實(shí)施方式中，本文所述的顆粒發(fā)現(xiàn)過(guò)程可在確定圖像內(nèi)背景信號(hào)的水平之后進(jìn)行，并且在某些情況下，具體地可在參照?qǐng)D2所述的背景信號(hào)測(cè)量方法之后進(jìn)行。然而，在其它實(shí)施方式中，本文所述的顆粒發(fā)現(xiàn)過(guò)程可以獨(dú)立于背景信號(hào)測(cè)量來(lái)執(zhí)行。圖3示出表示顆粒發(fā)現(xiàn)過(guò)程的示例性步驟序列的流程圖。如圖3的框60所示，該方法可以包括分析具有與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像，以標(biāo)識(shí)圖像內(nèi)呈現(xiàn)預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。例如，在歸類(lèi)圖像(即從在歸類(lèi)染料的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上發(fā)射的光生成的圖像)中搜索呈現(xiàn)強(qiáng)度比該圖像的背景信號(hào)更高的熒光的像素。在某些實(shí)施方式中，可在該圖像中搜索強(qiáng)度大大高于該圖像的背景信號(hào)的像素，諸如強(qiáng)度高2-1000倍的量級(jí)。也可以使用相對(duì)于圖像的背景信號(hào)相對(duì)較小或較大的強(qiáng)度水平。在其它情況下，可在該圖像中搜索呈現(xiàn)固定熒光值的像素，該值可以取決于圖像的背景信號(hào)或者與其無(wú)關(guān)。在任一情況下，像素或像素集合的更高水平的熒光發(fā)射可以表明熒光發(fā)射顆粒的存在。在某些實(shí)施方式中，顆?？杀话趩蝹€(gè)像素內(nèi)。然而，在其它實(shí)施方式中，顆?？缮⒉荚诙鄠€(gè)像素中。在任一情況下，可對(duì)在框60標(biāo)識(shí)的像素進(jìn)行評(píng)估，以確定顆粒在圖像內(nèi)的位置。特別地，圖3所示的方法可以進(jìn)行到框62，以確定多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素內(nèi)各自呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的位置，由此檢測(cè)圖像內(nèi)顆粒的存在。雖然這些像素可被單個(gè)地評(píng)估，且因此單個(gè)像素內(nèi)的位置可通過(guò)框62確定，框62還可以包括在所標(biāo)識(shí)的像素集合中確定一位置。如本文所使用的，“像素集合”一般可以指彼此緊鄰排列的像素分組(即連續(xù)排列像素的群集或聚集)。在某些實(shí)施方式中，評(píng)估像素集合以確定圖像內(nèi)顆粒的位置是有益的。特別地，如上所述，顆粒可以散布在多個(gè)像素中，并且如果是這樣，確定單個(gè)像素內(nèi)的位置可能會(huì)錯(cuò)誤地傳達(dá)比實(shí)際成像更多的顆粒的存在。此外，如果在圖像中顆粒的位置與一個(gè)或多個(gè)其它顆粒相對(duì)靠近，則這些顆粒的熒光可能會(huì)影響對(duì)彼此特性的評(píng)估。因此，不能準(zhǔn)確地確定顆粒的數(shù)據(jù)。在某些情況下，如果判定不能準(zhǔn)確評(píng)估所包含顆粒的特性，則像素集合可能被拒絕(例如從任何進(jìn)一步成像處理中排除)。以下參照?qǐng)D3的框70-78更詳細(xì)地描述確定是接受還是拒絕對(duì)像素集合進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理的示例性方式。一般而言，可以通過(guò)許多不同方式進(jìn)行在框62所示的用于確定多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素內(nèi)的位置。在圖3的框64、66和68 (框64、66和68通過(guò)虛線(xiàn)從框62延伸，并由虛線(xiàn)作為邊界，這表明這些過(guò)程是示例性的)示出某些示例性方法。如圖3所示，框64簡(jiǎn)述用于確定多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素中各自呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的峰值像素的過(guò)程。在這一過(guò)程中，可對(duì)每組像素進(jìn)行迭代，以確定在該組像素內(nèi)對(duì)每個(gè)像素測(cè)量的熒光值是否具有最大值。具有最大值的像素可被確定為“峰值像素”。在某些情況下，可以將峰值像素的中心部分指定為該位置。在這種情況下，可以通過(guò)框64所示過(guò)程簡(jiǎn)單地執(zhí)行框62所示的位置確定過(guò)程。然而，在某些實(shí)施方式中，判定峰值像素的可選部分是否更適于呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的位置是有益的。作為實(shí)例，在圖像的像素中，顆?？赡芪幢焕硐雽?duì)齊，由此來(lái)自顆粒 的能量可能未在一組所標(biāo)識(shí)的像素中平均分布。在這一情形中，峰值像素的中心部分可能不代表顆粒的最大熒光測(cè)量值，因此，判定峰值像素的偏心部分是否更好地代表顆粒的最大熒光測(cè)量是有益的。在這一情形中，該方法可以進(jìn)行到框66，以計(jì)算至少一組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素中呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的質(zhì)心位置。具體地，該方法可以包括對(duì)靠近峰值像素的及其預(yù)定半徑之內(nèi)的像素的熒光測(cè)量值進(jìn)行積分。距峰值像素的示例性半徑可從ι- ο個(gè)像素的范圍內(nèi)選擇，但是可以考慮其它半徑。注意，在預(yù)定半徑涵蓋未被標(biāo)識(shí)為具有預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)的像素的實(shí)施方式中，可從該積分中減去全部這些“背景像素”的背景信號(hào)。在某些情況下，對(duì)是否將計(jì)算出的質(zhì)心位置指派為呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的位置進(jìn)行分析是有益的。這樣，在某些實(shí)施方式中，該方法可取決于計(jì)算出的質(zhì)心位置的特性而進(jìn)行到框68。例如，如果質(zhì)心位置在任何方向上大于像素寬度的一半，則可將向下一整數(shù)值上舍入的所計(jì)算位置(例如在X和y坐標(biāo)上)指派為呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的位置。雖然框68將所計(jì)算質(zhì)心位置的尺寸閾值指定為大于像素尺寸的50%以指派質(zhì)心位置，但是偶然過(guò)程卻沒(méi)有必要如此受限。具體而言，可以使用質(zhì)心位置的任何尺寸閾值(包括與像素尺寸無(wú)關(guān)的那些)來(lái)判定是否指派質(zhì)心位置。確定呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的過(guò)程之后，該方法可以進(jìn)行到接受和拒絕對(duì)像素進(jìn)行進(jìn)一步處理的過(guò)程。例如，在某些實(shí)施方式中，該方法可以進(jìn)行到框70，其中計(jì)算兩個(gè)峰值像素之間的距離。峰值像素的標(biāo)識(shí)一般可以通過(guò)以上參照框64所述的過(guò)程來(lái)執(zhí)行，因此，圖3的流程圖包括虛線(xiàn)連接的框64和70以表明該相關(guān)?；诳?0中計(jì)算出的距離，可以接受或拒絕對(duì)與兩個(gè)峰值像素之一對(duì)應(yīng)的一組像素進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理，如框72所示。例如，如果峰值像素之間的距離小于(和/或等于)預(yù)定閾值，諸如但不限于與一個(gè)或兩個(gè)成像顆粒的投影直徑或其間的任何距離等效的閾值，則可以拒絕對(duì)與兩個(gè)峰值像素之一對(duì)應(yīng)的一組像素進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理。以這種方式，可以避開(kāi)與感興趣顆?？康眠^(guò)近的顆粒的熒光發(fā)射，該熒光發(fā)射可能會(huì)妨礙對(duì)感興趣顆粒進(jìn)行評(píng)估。一般而言，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“成像顆粒的投影直徑”可以是指基于用于對(duì)顆粒成像的系統(tǒng)的組件配置對(duì)成像顆粒估計(jì)的直徑。一般而言，成像顆粒的大小可以與實(shí)際顆粒的尺寸不同，這取決于用于對(duì)顆粒成像的成像系統(tǒng)的放大倍率。此外，成像系統(tǒng)的其它組件配置也可能影響該直徑。例如，缺陷透鏡、光學(xué)孔徑的衍射、光學(xué)濾波器失真、以及成像系統(tǒng)的若干其它組件可能影響成像像素的尺寸并在某些情形中使其失真(本文中稱(chēng)為成像顆粒的拖影)。在某些情況下，成像透鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)(或者量化為調(diào)制傳遞函數(shù)(MTF))可能是失真的主要因素。雖然可以拒絕與兩個(gè)峰值像素對(duì)應(yīng)的任一組像素，但是拒絕與具有較低熒光測(cè)量值的峰值像素對(duì)應(yīng)的那組像素是有益的，因?yàn)樵谶M(jìn)一步的圖像處理過(guò)程中，這一組像素的特性可能比另一組像素更不易辨識(shí)。在某些情況下，該方法可以進(jìn)行到評(píng)估剩余一組像素以判定它是否足以進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理。例如，該方法可以進(jìn)行到框70，以判定該組像素中光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率是表示單個(gè)顆粒還是顆粒團(tuán)。通常，由于難以對(duì)每個(gè)顆粒獲得準(zhǔn)確和不同的信息，因此需要拒絕顆粒團(tuán)。在其它實(shí)施方式中，可以通過(guò)計(jì)算兩組像素中光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率來(lái)在框72中確定對(duì)要拒絕的兩組像素的選擇。特別地，在判定峰值像素之間的距離小于預(yù)定閾值時(shí)，可對(duì)每組像素計(jì)算光學(xué)參數(shù)強(qiáng)度變化率，作為應(yīng)該拒絕哪一組的指標(biāo)?？?6-78和80-82中分別示出計(jì)算一組像素中強(qiáng)度變化率的不同方式，并在以下更詳細(xì)地描述。由于顆粒拒絕的方法可以包括框72和74的組合或依次處理，圖3的流程圖包括框72和74之間的虛線(xiàn)以表明在相應(yīng)過(guò)程之間這一連接的可能性。然而，這一連接是可任選的。特別地，在某些實(shí)施方式中，框72和74可以不結(jié)合執(zhí)行，因此框72和74之間的箭頭可以省略。在其它實(shí)施方式中，框74和72的處理可以反向，并且如果如此，則本文所述的方法可以包括框78和/或82與框70之間的連接。在其它實(shí)施方式中，可從該方法中略去框70和72?；蛘呖蓮脑摲椒ㄖ新匀タ?4(以及其用于執(zhí)行在框76-82所示過(guò)程的示例性程序)。在其它情況下，該方法可被配置成在框62之后對(duì)圖象處理的路徑進(jìn)行選擇，并因此可通向框70和74中的任一個(gè)，如圖3所示。參照框74，可以計(jì)算圍繞在框62確定的位置中至少一個(gè)的多個(gè)像素中的光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率。如上所述，該變化率可用于接受或拒絕對(duì)顆粒進(jìn)行進(jìn)一步圖像數(shù)據(jù)處理。更加具體地，該變化率可以是顆粒發(fā)射特性的空間梯度(即熒光發(fā)射水平的分布)的量度，并且該空間梯度可用于確定感興趣的顆粒與相鄰顆粒的隔離程度。在某些實(shí)施方式中，框74的過(guò)程之后可以是框76和78所示的步驟序列。特別地，該方法可以包括對(duì)圍繞框62中確定的位置的預(yù)定半徑內(nèi)排列的一組像素計(jì)算光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率。在某些實(shí)施方式中，預(yù)定半徑可大致等于由所確定位置表示的顆粒的投影直徑。在其它情況下，預(yù)定半徑可以大于或小于由所確定位置表示的成像顆粒的投影直徑。在計(jì)算光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率之后，該方法可進(jìn)行到框78，其中可以通過(guò)將強(qiáng)度變化率與預(yù)定閾值進(jìn)行比較來(lái)接受或拒絕對(duì)該組顆粒進(jìn)行進(jìn)一步圖像數(shù)據(jù)處理。在某些實(shí)施方式中，框78可以包括在計(jì)算強(qiáng)度變化率大于或等于預(yù)定閾值時(shí)接受該組像素進(jìn)行進(jìn)一步處理。特別地，光學(xué)參數(shù)相對(duì)較高的強(qiáng)度變化率可以表示該組像素內(nèi)的單個(gè)顆粒，這是進(jìn)一步圖像處理所需要的。除了這一過(guò)程之外，框78可以包括在計(jì)算強(qiáng)度變化率小于預(yù)定閾值時(shí)拒絕對(duì)該組像素進(jìn)行 進(jìn)一步處理。特別地，光學(xué)參數(shù)相對(duì)較低的強(qiáng)度變化率表示該組像素內(nèi)的顆粒團(tuán)，如上所述，這是進(jìn)一步圖像處理不需要的。在圖3的框80和82示出計(jì)算一組像素內(nèi)光學(xué)參數(shù)強(qiáng)度變化率的替換方式。特別地，除此之外或作為替代，該方法可以被路由到框80，以對(duì)分別排列在圍繞框62中確定的位置之一的不同預(yù)定半徑內(nèi)的兩組不同像素的光學(xué)參數(shù)值求和。注意，可將這些半徑調(diào)節(jié)成與顆粒在檢測(cè)器像素陣列上的擴(kuò)散有最佳匹配，這種擴(kuò)散通?；诔上裢哥R的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)(或者量化為調(diào)制傳遞函數(shù)(MTF))、顆粒相對(duì)于成像系統(tǒng)焦平面的位置以及顆粒自身大小而發(fā)生變化。例如，在某些實(shí)施方式中，一個(gè)預(yù)定半徑大致等于圖像內(nèi)單個(gè)顆粒的投影直徑而另一個(gè)預(yù)定直徑是圖像內(nèi)單個(gè)顆粒的投影直徑的約I. 5倍是有益的。然而，也可以使用其它半徑，并且可以使用不同的半徑比值。還應(yīng)該注意，如果從一個(gè)半徑內(nèi)的像素減去背景信號(hào)的值，則也可以將背景信號(hào)從其它半徑內(nèi)的像素值中減去。對(duì)光學(xué)參數(shù)值求和之后，可以計(jì)算 對(duì)應(yīng)于半徑的每一個(gè)的求和值的比值。特別地，使用較小半徑獲得的求和值可以除以用較大半徑獲得的求和值，或者反之。在任一情形中，該比值都可用于接受或拒絕對(duì)該組像素進(jìn)行進(jìn)一步圖像數(shù)據(jù)處理，如框82所示。特別地，框82可以包括在確定比值與設(shè)定值相差小于或等于預(yù)定閾值的量時(shí)接受該組像素以進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。此外，框83可以包括在確定比值與設(shè)定值相差大于預(yù)定閾值的量時(shí)拒絕對(duì)該組像素進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。對(duì)閾值的確定可以基于各種因素，包括但不限于選擇用來(lái)執(zhí)行框80所示過(guò)程的半徑、要成像顆粒的大小、圖像內(nèi)顆粒的拖影、以及所用成像系統(tǒng)的設(shè)置。因此，在不同應(yīng)用中，在框83中用于接受和拒絕一組像素的預(yù)定閾值可以有很大變化。然而，一般準(zhǔn)則是更接近單位值的比值可能表示進(jìn)一步處理所需的一組像素，因?yàn)閬?lái)自更小半徑之外的像素的貢獻(xiàn)很少。換言之，來(lái)自相鄰顆粒的光學(xué)參數(shù)值的影響很可能是最小，因而，感興趣的光學(xué)參數(shù)值的誤差相對(duì)較小?；蛘撸绻摫戎荡蟠笮∮趩挝恢?，則相鄰明亮顆粒有可能影響感興趣顆粒的光學(xué)參數(shù)值。在這種實(shí)例中，感興趣的顆?？赡鼙粊G棄，或者積分半徑可能被不恰當(dāng)?shù)剡x擇。以這種方式，在丟棄感興趣顆粒的圖像數(shù)據(jù)之前，可用不同半徑執(zhí)行上述積分。用于執(zhí)行這一附加積分的算法可以包括對(duì)每個(gè)小珠以某一固定比例(諸如I. 5x)建立內(nèi)徑和外徑并存儲(chǔ)該結(jié)果。在這些情形中，內(nèi)徑可以稍大于期望的小珠投影，諸如是比期望的小珠投影大I. 5倍。然后，對(duì)于每個(gè)小珠，可以稍稍減小內(nèi)徑和外徑(保持如上相同的比值)。隨后，可對(duì)比值集合進(jìn)行比較以查看大多數(shù)比值是否已經(jīng)改變。如果大多數(shù)比值并未改變，則內(nèi)徑仍然過(guò)大，并且在內(nèi)圈外到外圈中(仍)沒(méi)有獲得能量，所以對(duì)每個(gè)小珠，仍然需要再次減小內(nèi)徑和外徑。相反，如果某些比值已經(jīng)改變，則表示某些能量可能正向外圈移動(dòng)。基于來(lái)自上一直徑的比值集合的變化分布，可將該過(guò)程迭代數(shù)次。例如，如果重合顆粒的百分比(隨后應(yīng)該被丟棄)已知，則將該百分比等于比值的期望百分比，以結(jié)束該迭代?？梢栽谙律a(chǎn)線(xiàn)之后從根據(jù)先前數(shù)據(jù)系統(tǒng)通常如何表現(xiàn)的認(rèn)知中，或者從測(cè)試圖像的視覺(jué)檢查中來(lái)導(dǎo)出對(duì)重合顆粒的百分比的估算。如果重合顆粒的百分比未知，則新出現(xiàn)百分比隨著內(nèi)徑減小而變化然后保持恒定的逐步變化“歷史”可以是結(jié)束迭代的指示。作為示例，一次減小給定5%的比值變化，然后是10%，再是10%，第四次是12%。在該示例中10%可能是應(yīng)該丟棄的顆粒數(shù)量。當(dāng)達(dá)到百分比12%時(shí)，內(nèi)圈過(guò)小，截除了更小的單個(gè)好小珠。這樣，先前直徑應(yīng)該用作截止點(diǎn)?？梢杂貌煌膬?nèi)徑/外徑比值重復(fù)全部這些過(guò)程步驟，以查看是否出現(xiàn)百分比變化的更清晰趨勢(shì)。在這些情形中，該過(guò)程可包括在算法中的“外循環(huán)”，其中首先以過(guò)較大比值開(kāi)始，然后步進(jìn)掃描比值直到實(shí)際上比原始比值更小(可任選地跳過(guò)原始比值，因?yàn)樗驯挥?jì)算過(guò))。如上所述，本文所述的圖像數(shù)據(jù)處理方法可以包括圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程。在某些實(shí)施方式中，本文所述的圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程可在確定圖像內(nèi)背景信號(hào)水平之后進(jìn)行和/或在圖像內(nèi)發(fā)現(xiàn)顆粒之后進(jìn)行。在某些情況下，圖像內(nèi)對(duì)準(zhǔn)過(guò)程特別地可在參照?qǐng)D2所述的背景信號(hào)測(cè)量方法之后進(jìn)行，和/或在參照?qǐng)D3所述的顆粒發(fā)現(xiàn)方法之后進(jìn)行。然而，在其它實(shí)施方式中，本文所述的圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程可以獨(dú)立于背景信號(hào)測(cè)量和/或顆粒發(fā)現(xiàn)過(guò)程而進(jìn)行。在任一種情況中，可以在組裝設(shè)備之后在工廠中進(jìn)行圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程。除此之外或作為替代，圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程可以在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，尤其是在從工廠運(yùn)出之后系統(tǒng)部件有變化的情況下。一般而言，如果使用各自如上所述地耦合到濾光器的兩個(gè)或更多檢測(cè)器獲取顆粒的多個(gè)圖像，或者如果在使用單個(gè)相機(jī)拍攝的圖像之間替換可互換濾光器，則可以進(jìn)行圖像間對(duì)準(zhǔn)，因?yàn)闉V光器自身可能影響圖像。多個(gè)圖像通常是在不同波長(zhǎng)下取得的，使得不同 水平的熒光被測(cè)量并用于對(duì)顆粒歸類(lèi)。然而，由于成像子系統(tǒng)硬件的機(jī)械公差，與多個(gè)圖像的每一個(gè)中的顆粒相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)在多個(gè)圖像合成期間可能沒(méi)有絕對(duì)對(duì)準(zhǔn)。這種斑點(diǎn)的失配準(zhǔn)可能不利地制約對(duì)顆粒在所有成像通道中的位置進(jìn)行關(guān)聯(lián)的能力。然而，可以使用本文所述的圖像間對(duì)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)更改圖像與圖像的配準(zhǔn)，以更好地將斑點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)。如下所述，圖像間對(duì)準(zhǔn)校正過(guò)程可以是圖像坐標(biāo)在X和/或y方向上的簡(jiǎn)單平移。除此之外或作為替代，圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程可以包括旋轉(zhuǎn)多個(gè)圖像中的一個(gè)或多個(gè)。圖4示出描繪圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程的示例性步驟序列的流程圖。如圖4的框90所示，該過(guò)程可以包括獲取具有與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的多個(gè)圖像的數(shù)據(jù)，其中多個(gè)圖像的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于不同波長(zhǎng)帶。在某些情況下，該數(shù)據(jù)可直接從成像系統(tǒng)獲取，但是在其它情況下，該數(shù)據(jù)可從存儲(chǔ)介質(zhì)獲取。在任一情況下，該數(shù)據(jù)可以表示在不同波長(zhǎng)下取得的多個(gè)圖像，如上所述。可以使用的示例性波長(zhǎng)可以對(duì)應(yīng)于不同色彩通道，諸如但不限于，歸類(lèi)通道I的紅色、歸類(lèi)通道2的綠色、指示通道的藍(lán)色。如上進(jìn)一步描述，為了適應(yīng)每個(gè)色彩通道，用于本文所述方法的顆粒可被特定地染色，以在感興趣的所有波長(zhǎng)或所有波長(zhǎng)帶下發(fā)光。特別地，為了測(cè)量多個(gè)圖像內(nèi)的歸類(lèi)和指示信號(hào)兩者，可以使用不僅發(fā)射歸類(lèi)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的熒光而且發(fā)射指示波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的熒光的特定染色顆粒，來(lái)執(zhí)行本文所述的圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程。在已獲取了多個(gè)圖像的數(shù)據(jù)之后，該方法可進(jìn)行到框92，其中創(chuàng)建多個(gè)圖像的合成圖像。一般而言，合成圖像是多個(gè)圖像相對(duì)彼此重疊的單個(gè)圖像。如上所述，由于成像子系統(tǒng)硬件的機(jī)械公差，與多個(gè)圖像的每一個(gè)內(nèi)的顆粒對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)在多個(gè)圖像的合成中可能并沒(méi)有絕對(duì)對(duì)準(zhǔn)。這樣，可能需要圖像間對(duì)準(zhǔn)。特別地，該方法可以包括操縱多個(gè)圖像中至少一個(gè)的坐標(biāo)，使得與多個(gè)圖像的每一個(gè)內(nèi)顆粒對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)在隨后的合成圖像內(nèi)會(huì)聚，如框94所示。在某些實(shí)施方式中，除了一個(gè)(本文中稱(chēng)為“參考圖像”)之外的所有多個(gè)圖像的坐標(biāo)值都可被操縱。或者，更少的多個(gè)圖像的坐標(biāo)值可被操縱。以這種方式，參考圖像之外的圖像的坐標(biāo)值可保持用于圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程。在某些情況下，可將在由指示染料發(fā)射的光波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶下獲取的圖像被指定為參考圖像。在其它實(shí)施方式中，可將在由歸類(lèi)染料發(fā)射的光波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶下獲取的圖像指定為參考圖像。
如上所述和如圖4所示，在某些情況下，對(duì)坐標(biāo)的操縱包括圖像坐標(biāo)在X和/或y方向上的垂直偏移，如框96所示。除此之外或作為替代，坐標(biāo)的操縱可以包括旋轉(zhuǎn)多個(gè)圖像的一個(gè)或多個(gè)，如框98所示?？?6和98的輪廓為虛線(xiàn)，表示可以使用這些過(guò)程的任一個(gè)或兩者來(lái)操縱圖像坐標(biāo)在垂直平移的過(guò)程中，可確定在X或y方向上的正或負(fù)整數(shù)平移偏移量以操縱坐標(biāo)值。可將相應(yīng)的偏移量添加到一個(gè)或多個(gè)非參考圖像的坐標(biāo)，并且可使用多個(gè)圖像來(lái)創(chuàng)建新的合成圖像，其中某些圖像具有新坐標(biāo)。一般而言，可以一直執(zhí)行垂直平移校正步驟，直到在合成圖像內(nèi)的對(duì)準(zhǔn)不再可能有進(jìn)一步改進(jìn)。在確定不可獲得通過(guò)垂直平移的進(jìn)一步改進(jìn)時(shí)，可以保存具有通過(guò)該過(guò)程操縱的坐標(biāo)的每個(gè)非參考圖像的X平移和y平移值，用于隨后的顆粒成像。諸如表格的任何適當(dāng)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)可適用于這些值。如上所述，除此之外或作為替代，坐標(biāo)值的操縱包括旋轉(zhuǎn)一個(gè)或多個(gè)非參考圖像的坐標(biāo)。在某些實(shí)施方式中，如果經(jīng)由平移校正并未使圖像充分對(duì)齊，則可以采用旋轉(zhuǎn)過(guò)程。在其它實(shí)施方式中，可在垂直平移過(guò)程之前、取代平移過(guò)程、或與之交替地執(zhí)行旋轉(zhuǎn)過(guò)程。在其它情況下，旋轉(zhuǎn)過(guò)程可與垂直平移過(guò)程并發(fā)地進(jìn)行。特別地，對(duì)于圖像坐標(biāo)操縱，可以旋轉(zhuǎn)一個(gè)或多個(gè)非參考圖像，并且可以將一個(gè)或多個(gè)其它非參考圖像平移垂直偏移量。在其它實(shí)施方式中，可以對(duì)單個(gè)非參考圖像的坐標(biāo)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)和垂直偏移。在任一情形中，在某些實(shí)施方式中，可用于圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程的垂直偏移范圍可以是+/-10像素，并且旋轉(zhuǎn)偏移范圍可以是+/-2度。然而，更大或更小的偏移量可用于操縱坐標(biāo)的任一或兩種方式。不管圖像旋轉(zhuǎn)相對(duì)于圖像坐標(biāo)的垂直偏移的結(jié)合方式如何，旋轉(zhuǎn)過(guò)程通?？砂▽⒃c(diǎn)(即旋轉(zhuǎn)中心)選擇在圖像的X和y尺寸的中點(diǎn)附近(標(biāo)為XgM ygA)。可使用與源圖像(即要旋轉(zhuǎn)的非參考圖像)相同的尺寸來(lái)創(chuàng)建新的空白圖像緩沖區(qū)。對(duì)于源圖像中的每個(gè)像素，可以確定來(lái)自旋轉(zhuǎn)中心的當(dāng)前矢量。特別地，從感興趣像素到圖像旋轉(zhuǎn)中心的距離可由
的平方根確定，X和y是該像素的坐標(biāo)。此外，根據(jù)y距s除以&_的反正切并且向反正切值加上或從其減去象限相關(guān)的修改量以調(diào)節(jié)每個(gè)象限的角度，可以確定當(dāng)前矢量的角度。在這些情形中，是在ygg與感興趣像素之間沿y軸的距離，而Xsw是在X gA與感興趣像素之間沿X軸的距離。在上述計(jì)算之后，可將用戶(hù)定義的恒定“調(diào)節(jié)”角加到當(dāng)前像素的矢量以確定像素的旋轉(zhuǎn)角。可通過(guò)以下等式確定像素的新位置(例如X和y坐標(biāo))新X坐標(biāo)=[(x-x原點(diǎn))2+(y-y原點(diǎn))2]的平方根*cos (旋轉(zhuǎn)角)+X原點(diǎn)+X平移(如果可應(yīng)用)+0.5(I)新y坐標(biāo)=[(x-x原點(diǎn))2+(y-y原點(diǎn))2]的平方根*sin (旋轉(zhuǎn)角)+y原點(diǎn)+y平移(如果可應(yīng)用)+0.5(2)在新的X和y坐標(biāo)下可將所考慮像素值拷貝到空白圖像緩沖區(qū)的像素中。在處理了要旋轉(zhuǎn)的非參考圖像之后，可以重新創(chuàng)建新的合成偽彩色圖像。一般而言，以上對(duì)旋轉(zhuǎn)過(guò)程列出的步驟可以重復(fù)，以使每個(gè)非參考圖像上的色彩變化最小化?？刹捎弥T如調(diào)節(jié)表的合適數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)對(duì)每個(gè)非參考圖像存儲(chǔ)最終的旋轉(zhuǎn)值，用于后續(xù)成像。一般而言，可參考多個(gè)不同參數(shù)來(lái)進(jìn)行以上參照框94描述的坐標(biāo)操縱的迭代。作為實(shí)例，坐標(biāo)操縱的迭代可以取決于合成圖像斑點(diǎn)之間色彩變化量、與合成圖像斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的像素之間強(qiáng)度的集合誤差或均方差、和/或合成圖像內(nèi)斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差。每種技術(shù)的概要在圖4的框100-128中列出并在以下詳細(xì)描述。
特別地，框100包括如下過(guò)程算術(shù)上確定(即通過(guò)一算法)偏移以修改多個(gè)圖像中至少一個(gè)的坐標(biāo)，使得下一合成圖像中斑點(diǎn)之間的色彩變化量相對(duì)于前一合成圖像減小。合成圖像的色彩變化通常是由多個(gè)圖像中至少一個(gè)的失準(zhǔn)而引起的。例如，在對(duì)相應(yīng)多個(gè)圖像使用紅色、綠色和藍(lán)色通道的實(shí)施方式中，期望對(duì)應(yīng)于合成圖像中顆粒的斑點(diǎn)的會(huì)聚色彩是白色。然而，多個(gè)圖像的對(duì)準(zhǔn)變動(dòng)可能導(dǎo)致各個(gè)圖像上與紅色、綠色和藍(lán)色通道對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)相對(duì)彼此偏移。因此，合成圖像中的各個(gè)色彩可能會(huì)延伸超出白斑的邊界，從而在此斑點(diǎn)處引起色彩變動(dòng)。注意，合成圖像中白斑的形成是對(duì)由紅色、綠色和藍(lán)色通道產(chǎn)生的圖像進(jìn)行組合的結(jié)果，但是本文所述的方法并非必然被限制在使用這些通道來(lái)制作圖像。特別地，可通過(guò)若干不同色彩的通道來(lái)形成任意數(shù)量的多個(gè)圖像，因此，本文所述的方法并不限于形成三個(gè)圖像或者紅色、綠色和藍(lán)色的色彩通道。如上所述以及如圖4的框102所示，圖像的失準(zhǔn)可通過(guò)將多個(gè)圖像中一個(gè)或多個(gè)的坐標(biāo)調(diào)節(jié)預(yù)定偏移來(lái)減小。這些預(yù)定偏移可包括以上參照框96和98所述垂直偏移和/或旋轉(zhuǎn)偏移。在框102之后，可以創(chuàng)建包括預(yù)定偏移的多個(gè)圖像的不同合成圖像，如框104所示。該方法可以進(jìn)行到框106，其中確定新近創(chuàng)建的合成圖像中斑點(diǎn)之中的色彩變化。如判定框108所示，在色彩變化大于(和/或等于)特定偏移量的預(yù)定容許誤差的實(shí)施方式中，可以重復(fù)框100-106。相反，在色彩變化小于(和/或等于)預(yù)定容許誤差的實(shí)施方式中，圖像間對(duì)準(zhǔn)的方法可在框110結(jié)束。一般而言，對(duì)框108設(shè)定的預(yù)定容許誤差可取決于合成圖像所需的準(zhǔn)確度以及偏移量，因此可隨應(yīng)用而變化。參照?qǐng)D4中的框112-128描述基于合成圖像內(nèi)像素強(qiáng)度和/或斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差的坐標(biāo)操縱的迭代技術(shù)。特別地，兩種技術(shù)都可在框112開(kāi)始，在此將i設(shè)定為I。這一指定用于引用若干預(yù)定偏移的第一個(gè)來(lái)調(diào)節(jié)多個(gè)圖像中至少一個(gè)的坐標(biāo)，如框114所示。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)迭代該過(guò)程的預(yù)定偏移的選擇可特定于測(cè)量合成圖像中對(duì)準(zhǔn)的參數(shù)(即合成圖像內(nèi)像素強(qiáng)度或斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差)。在其它實(shí)施方式中，預(yù)定偏移的選擇可與所使用的技術(shù)無(wú)關(guān)。在任一情形中，該過(guò)程可進(jìn)行到框116，以創(chuàng)建包括預(yù)定偏移的多個(gè)圖像的不同合成圖像。之后，可以采用對(duì)這些技術(shù)專(zhuān)用的過(guò)程。例如，該方法可以進(jìn)行到框118來(lái)確定在框116創(chuàng)建的合成圖像的像素之間強(qiáng)度的集合誤差或均方差?；蛘?，該方法可以進(jìn)行到框120，以確定在框116中創(chuàng)建的合成圖像內(nèi)斑點(diǎn)位置的集合誤差或平均方差。在任一情形中，隨后可在框122對(duì)i是否等于η進(jìn)行判定，η是調(diào)節(jié)多個(gè)圖像的坐標(biāo)的預(yù)定偏移的數(shù)量。在i不等于η的情形中，該方法可以進(jìn)行到框124，以將i的值增一，并重復(fù)在框114-120列出的過(guò)程。在判定i等于η時(shí)，該方法可以進(jìn)行到框126，其中對(duì)不同合成圖像的每一個(gè)的集合誤差或均方差的計(jì)算值進(jìn)行評(píng)估。特別地，可以對(duì)不同合成圖像的每一個(gè)的集合誤差或均方差的計(jì)算值進(jìn)行評(píng)估，以標(biāo)識(shí)使合成圖像獲得最小誤差的偏移(即平移和/或旋轉(zhuǎn))值?？梢詫?duì)坐標(biāo)被調(diào)節(jié)的每個(gè)非參考圖像保存所標(biāo)識(shí)的偏移值，如框128所示。諸如表格的任何適當(dāng)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)可以適用于這些值。在上述兩個(gè)實(shí)施方式中，可將所標(biāo)識(shí)的偏移值應(yīng)用到在后續(xù)成像期間創(chuàng)建的歸類(lèi)圖像的坐標(biāo)系。特別地，可以使用上述等式將歸類(lèi)圖像直接平移和/或旋轉(zhuǎn)到新的圖像緩沖區(qū)，然后可以將原始?xì)w類(lèi)圖像緩沖區(qū)丟棄。
可以在對(duì)齊圖像坐標(biāo)系之后執(zhí)行圖像間顆粒關(guān)聯(lián)。特別地，假設(shè)在一個(gè)以上的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶下獲取了一個(gè)以上的歸類(lèi)圖像，則在對(duì)準(zhǔn)圖像坐標(biāo)系之后，可根據(jù)位置來(lái)丟棄實(shí)際顆粒。簡(jiǎn)而言之，如果顆粒并不存在于所有歸類(lèi)圖像上，則可將其從進(jìn)一步處理中去除。在一示例中，使用先前使用上述顆粒發(fā)現(xiàn)方法標(biāo)識(shí)的每個(gè)歸類(lèi)圖像的顆粒集合以及每個(gè)歸類(lèi)圖像的平移/旋轉(zhuǎn)值，可以標(biāo)識(shí)位于給定半徑內(nèi)的最佳匹配顆粒。標(biāo)識(shí)最佳匹配顆?？梢园▌?chuàng)建一個(gè)η個(gè)循環(huán)的嵌套系列，用于遍歷每個(gè)顆粒集合迭代，其中該循環(huán)嵌套系列的每個(gè)層次表示一歸類(lèi)圖像。在最深的嵌套層次，該方法可以包括判定來(lái)自所有外循環(huán)的顆粒的已調(diào)節(jié)坐標(biāo)是否位于給定半徑內(nèi)?？梢栽诖_定距離之前根據(jù)以上針對(duì)圖像間對(duì)準(zhǔn)描述的對(duì)準(zhǔn)表和等式來(lái)平移每個(gè)嵌套層次的坐標(biāo)。如果該距離小于給定半徑，則最內(nèi)層循環(huán)的顆粒位置可被暫時(shí)存儲(chǔ)，以供隨后與最內(nèi)層的其它匹配進(jìn)行比較。如果最內(nèi)層中第二顆粒的距離小于先前所找到顆粒的距離，則暫時(shí)存儲(chǔ)的顆粒位置被當(dāng)前距離代替。如果為否，則該方法可以對(duì)下一顆粒繼續(xù)。在來(lái)自最外層循環(huán)的第二顆粒迭代結(jié)束處，可以將與最外位置的最佳匹配的暫時(shí)位置存儲(chǔ)到一集合中。如果在外循環(huán)顆粒的給定半徑內(nèi)沒(méi)有匹配，則自動(dòng)將該顆粒的實(shí)例從進(jìn)一步考慮中刪除，從而關(guān)聯(lián)算法的輸出是如上創(chuàng)建的
口 O為了加速整個(gè)過(guò)程，如果存在如上標(biāo)識(shí)的匹配，則可在每個(gè)后續(xù)循環(huán)中將該顆粒表示為“已使用”，這樣不必將處理時(shí)間花在再次對(duì)其進(jìn)行考慮。也可以將圖像分成多個(gè)分區(qū)，對(duì)每個(gè)分區(qū)進(jìn)行分開(kāi)關(guān)聯(lián)以減少處理時(shí)間。在這一實(shí)例中，分區(qū)的數(shù)量較佳地被選擇成在將圖像分解成區(qū)域時(shí)不會(huì)損失循環(huán)迭代的總體省時(shí)。此外，為了避免失去分區(qū)邊界處的比較能力，這些區(qū)域可以稍稍重疊。此外，如果這些區(qū)域重疊，則區(qū)域重疊程度可被選擇成減小重復(fù)重疊處顆粒的可能性。該方法還可以包括指示熒光發(fā)射的熒光積分。由于指示發(fā)射水平不恒定并且未知，不可能或者沒(méi)有必要使用歸類(lèi)圖像所采用的顆粒發(fā)現(xiàn)技術(shù)來(lái)在指示圖像中標(biāo)識(shí)用于積分的像素。相反，可以使用在歸類(lèi)圖像中所找到顆粒的相同X和y坐標(biāo)下的熒光。在一個(gè)這種示例中，使用來(lái)自由圖像間關(guān)聯(lián)確定的調(diào)節(jié)表的平移和旋轉(zhuǎn)值，可將每個(gè)所發(fā)現(xiàn)的顆粒映射到指示圖像的適當(dāng)坐標(biāo)。對(duì)于每個(gè)顆粒的起始位置，可以使用來(lái)自未調(diào)節(jié)參考?xì)w類(lèi)圖像的坐標(biāo)系。對(duì)指示確定的平移X、y值和旋轉(zhuǎn)角表示指示圖像中成像顆?？梢苿?dòng)由此與歸類(lèi)參考圖像中的顆粒位置重合的方向。然而，在此進(jìn)行的變換涉及將參考坐標(biāo)系平移到指示坐標(biāo)系?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單地將每個(gè)調(diào)節(jié)參數(shù)的符號(hào)反轉(zhuǎn)(負(fù)值變成正值，反之亦然)，將X和y的平移值“轉(zhuǎn)換”。類(lèi)似地，在找到指示坐標(biāo)之前，也可將旋轉(zhuǎn)角的符號(hào)反轉(zhuǎn)。在將所有參數(shù)的符號(hào)反轉(zhuǎn)之后，以上對(duì)圖像間對(duì)準(zhǔn)步驟描述的方程可用于標(biāo)識(shí)積分的中心。位于給定積分半徑內(nèi)的所有指示像素的積分可被確定。如上所述，本文所述的圖像數(shù)據(jù)處理方法可以包括圖像平面歸一化過(guò)程。理想地，對(duì)成像系統(tǒng)進(jìn)行均勻照射，以防止顆粒之間依賴(lài)于位置的發(fā)射變化。然而，實(shí)際上，成像場(chǎng)中的每個(gè)斑點(diǎn)具有給定的照射水平。此外，在系統(tǒng)內(nèi)使用的熒光帶通濾波器和一個(gè)或多個(gè) 成像透鏡可能不會(huì)對(duì)圖像中所有點(diǎn)透射等量的光。為了補(bǔ)償圖像上的這些差異，可將歸一化方法或算法應(yīng)用到光學(xué)參數(shù)的測(cè)量值。在某些實(shí)施方式中，本文所述的圖像平面歸一化過(guò)程可在以上描述的過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)之后進(jìn)行，尤其是相關(guān)于參照?qǐng)D2-4描述的那些過(guò)程。然而，在其它實(shí)施方式中，本文所述的圖像平面歸一化可獨(dú)立于這些過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)來(lái)進(jìn)行。圖5示出描繪圖像平面歸一化過(guò)程的示例性步驟序列的流程圖。如圖5的框130所示，該過(guò)程可包括分析對(duì)具有均勻濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的第一組顆粒取得的第一組圖像，以在第一組圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)呈現(xiàn)第一預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。該第一組圖像可包括任何數(shù)量的圖像，包括單個(gè)圖像或多個(gè)圖像。在取得多個(gè)圖像的實(shí)施方式中，使用不同波長(zhǎng)的照射源來(lái)形成第一組圖像，這些不同波長(zhǎng)諸如但不限于對(duì)應(yīng)于紅色、綠色和藍(lán)色通道的波長(zhǎng)。在某些情況下，該方法可任選地(由虛線(xiàn)框表示)包括框132，其中分析對(duì)具有均勻濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的不同第二組顆粒取得的第二組圖像，以在第二組圖像中標(biāo)識(shí)呈現(xiàn)第一預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。與第一組圖像一樣，第二組圖像可包括任何數(shù)量的圖像，并且在取得多個(gè)圖像的情形中，可使用不同波長(zhǎng)的照射源形成多個(gè)圖像。在某些實(shí)施方式中，分析對(duì)濃度已知的不同組顆粒獲得的第二組圖像對(duì)減小隨后為第一和第二組圖像的相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量中的噪聲和顆粒不均勻的影響是有益的。 特別地，通過(guò)如以下參照框140描述的對(duì)第一和第二組圖像的相應(yīng)分區(qū)的每一個(gè)測(cè)量的光學(xué)參數(shù)值取平均值，可以降低噪聲和顆粒不均勻的影響。不管該方法是否包括分析第二組圖像，該方法可進(jìn)行到框134以在第一組圖像以及在某些情形中的第二組圖像的相應(yīng)分區(qū)內(nèi)，對(duì)參照框130和132描述的過(guò)程中標(biāo)識(shí)的像素集合進(jìn)行歸類(lèi)。特別地，可以將多組圖像分成分區(qū)陣列，并且可基于其在圖像內(nèi)的位置將連續(xù)排列像素的集合或團(tuán)排列在分區(qū)內(nèi)。更具體地，對(duì)于所標(biāo)識(shí)的每個(gè)顆粒，可以確定在第一和第二組圖像中其所屬的分區(qū)。分區(qū)陣列可包括任何數(shù)量的行和列，這取決于期望背景信號(hào)的清晰度、系統(tǒng)的處理能力、和/或被分析的顆粒數(shù)量。如在圖5中進(jìn)一步示出的，該方法可以進(jìn)行到框136，以對(duì)第一組圖像以及在某些情形中的第二組圖像的每個(gè)相應(yīng)分區(qū)，產(chǎn)生表示歸類(lèi)到其中的像素集合的光學(xué)參數(shù)水平的單個(gè)統(tǒng)計(jì)量。一般而言，該統(tǒng)計(jì)量可從任何數(shù)量的統(tǒng)計(jì)參數(shù)中選擇，包括但不限于，中值、平均值、模和截尾平均值。在某些實(shí)施方式中，確定中值可以是特別有益的。如圖5的判定框138所示，在各實(shí)施方式中該方法可進(jìn)行到框140，其中分析對(duì)不同兩組顆粒取得的兩組圖像?？?40指示，計(jì)算對(duì)第一和第二組圖像的每個(gè)相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量的平均值。在框140之后或者在框138中判定對(duì)于像素集合歸類(lèi)只分析一組圖像時(shí)，該方法可以進(jìn)行到框142，以將對(duì)相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量保存到用于形成第一和第二組圖像的波長(zhǎng)所專(zhuān)用的矩陣中。這些矩陣用于為對(duì)具有未知濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的圖像顆粒測(cè)量的光學(xué)參數(shù)計(jì)算歸一化值，如以下參照框148所述。特別地，該方法可包括框144，用于分析對(duì)具有未知濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒取得的第三組圖像，以在第三組圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)呈現(xiàn)第一預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。與第一組圖像一樣，第三組圖像可包括任何數(shù)量的圖像，并且在取得多個(gè)圖像的情形中，可使用不同波長(zhǎng)的照射源來(lái)形成多個(gè)圖像。該方法可以進(jìn)行到框146，其中，將在框144中標(biāo)識(shí)的像素集合歸類(lèi)到第三組圖像的相應(yīng)分區(qū)。為了補(bǔ)償具有未知濃度熒光材料的顆粒之間位置依賴(lài)的發(fā)射變化，可以對(duì)所測(cè)光學(xué)參數(shù)計(jì)算歸一化值。特別地，框148示出，可以將在圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)的每個(gè)像素的光學(xué)參數(shù)值除以對(duì)第一和第二組圖像的對(duì)應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量，以獲得該光學(xué)參數(shù)的歸一化值。
在某些實(shí)施方式中，可將每個(gè)所標(biāo)識(shí)像素的所得歸一化值乘以單個(gè)“校準(zhǔn)因子”值，以相對(duì)于外部標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)其最終校準(zhǔn)值。對(duì)于基本上均勻的一組已知濃度顆粒，可根據(jù)上述歸一化矩陣確定校準(zhǔn)因子值。特別地，該方法可任選地包括(由虛線(xiàn)框表示)框150，用于計(jì)算表示對(duì)第一和第二組圖像之一或兩者的相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的全部統(tǒng)計(jì)量的統(tǒng)計(jì)值。該統(tǒng)計(jì)值可從任何數(shù)量的統(tǒng)計(jì)參數(shù)中選擇，包括但不限于中值、平均值、模、和截尾平均值。在某些實(shí)施方式中，確定中值是十分有益的。校準(zhǔn)值的確定還可包括將與關(guān)聯(lián)于具有均勻濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的不同組顆粒的光學(xué)參數(shù)水平相關(guān)聯(lián)的預(yù)定數(shù)值除以計(jì)算出的統(tǒng)計(jì)值，如框152所示。如以上所述以及圖5中的框154所示，可將校準(zhǔn)因子值乘以對(duì)具有未知濃度的顆粒的光學(xué)參數(shù)獲得的歸一化值，以根據(jù)外部標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)其值。注意，以上所述的歸一化和校準(zhǔn)技術(shù)并不限于歸一化所有圖像中的每個(gè)像素。相反，歸一化和校準(zhǔn)技術(shù)可應(yīng)用于在一圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)的顆粒。相對(duì)于應(yīng)用專(zhuān)用的像素歸一化和校準(zhǔn)，這一過(guò)程對(duì)最小化計(jì)算特別有益。得益于本公開(kāi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，本發(fā)明被認(rèn)為是提供一種用于圖像數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)。就本說(shuō)明書(shū)而言，本發(fā)明諸方面的其它變體和替換實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。因此，本說(shuō)明書(shū)應(yīng)該只被解讀為是說(shuō)明性的，以及是出于示教本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明的一般方式的目的。應(yīng)該理解，本文示出和描述的本發(fā)明的形式采用當(dāng)前較佳實(shí)施方式。如在得益于本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)之后對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，可對(duì)本文所示和所述的元件和材料進(jìn)行替換，對(duì)部分和過(guò)程進(jìn)行反向，并且可以獨(dú)立使用本發(fā)明的某些方面?？蓪?duì)本文所述的元件進(jìn)行改變而不背離所附權(quán)利要求書(shū)所述的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種包括程序指令的非瞬逝性存儲(chǔ)介質(zhì)，所述程序指令可由處理器執(zhí)行用來(lái) 分析具有與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像，以在所述圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)呈現(xiàn)第一預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素； 在多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素內(nèi)確定分別在所述組內(nèi)呈現(xiàn)所述光學(xué)參數(shù)的最大值的位置； 隨后對(duì)圍繞所述位置中至少一個(gè)的多個(gè)像素計(jì)算所述光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率，以確定所述多個(gè)像素表示所述顆粒圖像中的單個(gè)顆粒還是所述顆粒圖像中的顆粒團(tuán)；以及 基于所計(jì)算的強(qiáng)度變化率，接受或拒絕所述多個(gè)像素用于進(jìn)一步評(píng)估。
2.如權(quán)利要求I所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，用于接受或拒絕所述多個(gè)像素的程序指令包括 在所計(jì)算的強(qiáng)度變化率大于或等于與所述第一預(yù)定閾值不同的第二預(yù)定閾值時(shí)接受所述多個(gè)像素用于進(jìn)一步評(píng)估；以及 在所計(jì)算的強(qiáng)度變化率小于所述第二預(yù)定閾值時(shí)拒絕所述多個(gè)像素用于進(jìn)一步評(píng)估。
3.如權(quán)利要求I所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，用于計(jì)算所述強(qiáng)度變化率的所述程序指令包括用于以下步驟的程序指令 對(duì)排列在圍繞所述至少一個(gè)位置的第一預(yù)定半徑內(nèi)的第一組多個(gè)像素的所述光學(xué)參數(shù)值進(jìn)行求和； 對(duì)排列在圍繞所述至少一個(gè)位置的第二預(yù)定半徑內(nèi)的第二組多個(gè)像素的所述光學(xué)參數(shù)值進(jìn)行求和，其中所述第二預(yù)定半徑大于所述第一預(yù)定半徑；以及 確定分別對(duì)所述第一和第二組像素計(jì)算的求和值的比值。
4.如權(quán)利要求3所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，所述第一預(yù)定半徑約等于所述圖像內(nèi)單個(gè)顆粒的投影直徑，其中所述投影直徑基于用于對(duì)所述顆粒成像的系統(tǒng)的部件配置。
5.如權(quán)利要求3所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，所述第二預(yù)定半徑約比所述圖像內(nèi)單個(gè)顆粒的投影直徑大I. 5倍，其中所述投影直徑基于用于對(duì)所述顆粒成像的系統(tǒng)的部件配置。
6.如權(quán)利要求I所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，用于確定所述位置的所述程序指令包括用于在所述多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素中確定分別呈現(xiàn)所述光學(xué)參數(shù)的最大值的峰值像素的程序指令。
7.如權(quán)利要求6所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，用于確定所述位置的所述程序指令還包括用于基于對(duì)應(yīng)于所述至少一個(gè)組的所述峰值像素內(nèi)以及包含在圍繞所述峰值像素的第二預(yù)定半徑內(nèi)鄰近所述峰值像素的像素內(nèi)的所述光學(xué)參數(shù)值，在所述多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素的至少一個(gè)內(nèi)計(jì)算質(zhì)心位置的程序指令。
8.如權(quán)利要求7所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，用于確定所述位置的所述程序指令還包括用于在確定所述質(zhì)心位置的尺寸大于所述圖像內(nèi)像素寬度的約50%時(shí)，將所述質(zhì)心位置指派為所述至少一組內(nèi)呈現(xiàn)所述光學(xué)參數(shù)最大值的所述位置的程序指令。
9.如權(quán)利要求6所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，還包括用于以下步驟的程序指令 計(jì)算所述峰值像素中的兩個(gè)像素之間的距離；以及 在所計(jì)算的距離小于第二預(yù)定閾值時(shí)，拒絕與所述兩個(gè)峰值像素之一對(duì)應(yīng)的一組像素用于進(jìn)一步評(píng)估。
10.如權(quán)利要求9所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，所述用于拒絕一組像素的程序指令包括用于以下步驟的程序指令 對(duì)與所述兩個(gè)峰值像素對(duì)應(yīng)的每組像素計(jì)算光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率；以及 基于對(duì)每組像素計(jì)算的強(qiáng)度變化率拒絕所述一組像素。
11.如權(quán)利要求3所述的存儲(chǔ)介質(zhì)，其特征在于，還包括用于重復(fù)以下步驟對(duì)所述第一和第二組多個(gè)像素的光學(xué)參數(shù)值進(jìn)行求和，以及對(duì)不同預(yù)定半徑確定求和值的比值。
全文摘要
提供一種用于圖像數(shù)據(jù)處理的方法和系統(tǒng)。該方法和系統(tǒng)的實(shí)施方式包括執(zhí)行以下步驟中一個(gè)或多個(gè)的配置背景信號(hào)測(cè)量、使用歸類(lèi)染料發(fā)射和群集拒絕的顆粒標(biāo)識(shí)、圖像間對(duì)準(zhǔn)、圖像間顆粒關(guān)聯(lián)、指示發(fā)射的熒光積分和圖像平面歸一化。
文檔編號(hào)G01N15/14GK102622746SQ201210021100
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月21日
發(fā)明者W·D·羅斯 申請(qǐng)人:盧米尼克斯股份有限公司