專利名稱：膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于醫(yī)學免疫應用領域，具體涉及到利用膠體金免疫層析技術檢測抗 Ro52抗體的試紙。
背景技術：
SS-A抗原是一種小核糖核蛋白，由一個RNA分子和兩種不同的蛋白質(zhì)(分子量分別為52和60kDa)組成，抗-SS-A 60kDa蛋白的抗體對于干燥綜合癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性更高，而單獨抗SS-A 52kDa的抗體不具有疾病的特異性，并且容易與其它抗體發(fā)生交叉反應。在鑒別診斷中，抗SSA/Ro抗體對干燥綜合癥和SLE具有極高的特異性。尤其是抗 Ro抗體與60KD Ro蛋白(Ro60)和52KD Ro蛋白(Ro52)的免疫反應，分別用于辨別SLE和原發(fā)性干燥綜合癥。334/1 0抗體見于85(%-95(%的干燥綜合癥病人。因此，此抗體是鑒別此病的主要指標。抗Ro52抗體與抗Ro60抗體相比，對原發(fā)性干燥綜合癥具有更高的特異性。在超過60%的原發(fā)性干燥綜合癥病人中可單獨檢測到Ro52自身抗體，而只有5%的 SLE病人可單獨檢測到此抗體。本實用新型采用大腸桿菌原核表達人源基因工程方法Ro52，即為本產(chǎn)品的檢測抗原。目前實驗室常用的檢測抗R052抗體的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、間接免疫焚光法(indirect immunoflurescence, IFF)、免疫印跡法(immunoblotting test, IBT)、線性免疫分析法(Line immuno assay, LIA)等。免疫印跡法雖綜合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，但操作相對復雜，且試劑具有較強的毒性和污染性。間接免疫熒光法可作半定量測定，但需有熒光顯微鏡觀察結果，結果判定的客觀性不足，標準化困難，技術程序比較復雜，也不適合高通量標本的檢測。線性免疫分析法主要用于疾病大類的篩查，針對性相對較差，同時也不適合高通量樣本的檢測。ELISA法檢測可用于高通量標本測定，靈敏度也較高，目前被廣泛認可，但操作比較繁瑣，需多次加樣和洗滌，且易受溫度和孵育條件的影響，在專業(yè)實驗室里進行操作，給實驗帶來諸多不便。目前市場上商品化抗Ro52抗體檢測試劑盒主要為酶聯(lián)免疫吸附法，需多次加樣和洗滌步驟，完成整個實驗過程需三小時左右，需酶標儀，亦需要專業(yè)免疫學技術人員在實驗室中進行實驗操作，易受人員和場地的限制，同時易受各種溫度和孵育時間等環(huán)境條件因素的影響，對試驗帶來諸多不便。膠體金層析法應用到抗Ro52抗體的檢測中。膠體金免疫層析法 (gold-immunochromatography assay, GICA)是應用膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細效應使樣品溶液在層析條上泳動，使樣品中的待
3測物與結合墊上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生免疫反應，并與條狀纖維層析材料上的抗原(或抗體)發(fā)生免疫反應而被截留，進而形成肉眼可見的紫紅色條帶，得到直觀的實驗結果，達到快速檢測的目的(Sikowicz G et al. One-step chromatographic immunoassay for qualitative determination of choricogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990(36) 1579-1586.)。使用時只將樣品加樣到樣品墊上，數(shù)分鐘就根據(jù)檢測線上紫紅色條帶出現(xiàn)情況來判斷陰陽性結果。與其他檢測方法相比，檢測時間短，只需要5 10 分鐘，操作人員無需培訓，操作簡便、快速，無需低溫保存，儲運方便等優(yōu)勢。在自身免疫性疾病方面，目前國外市場上出現(xiàn)了一些檢測自身免疫疾病的試紙條產(chǎn)品，但抗Ro52抗體的膠體金免疫試紙在國內(nèi)外市場上仍沒有問世。

實用新型內(nèi)容本實用新型所要解決的技術問題是為了克服以上方法學的不足，將膠體金層析法應用到抗Ro52抗體的檢測中，同時首次將Ro52抗原蛋白應用到膠體金層析法中，采用間接法來實現(xiàn)血液中的抗R052抗體檢測，實現(xiàn)高特異、高靈敏度、高準確性的檢測性能，快速篩選出抗R052抗體的陽性樣本，能快速、便捷地輔助診斷干燥綜合癥。本實用新型所要解決的技術問題在于提供一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙。本實用新型所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現(xiàn)一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，包括有樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側(cè)依次向所述底板的另一側(cè)相互搭接粘貼在所述底板上，其特癥在于所述的結合墊包被有金標抗體a層和金標抗體b層；所述的硝酸纖維素包被膜上設置有檢測線和質(zhì)控線，所述的檢測線包被有Ro52 抗原蛋白層，所述的質(zhì)控線包被有金標抗體c層。進一步，所述的金標抗體a層中的抗體A為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)中的一種或多種。所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種。所述的抗人IgG單克隆抗體為羊源或兔源中的一種。 所述金標抗體a層中的抗體A優(yōu)選為葡萄球菌A蛋白。所述的金標抗體b層中的抗體B和金標抗體c中的抗體C同時或不同時為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中金標抗體b中的抗體B和金標抗體c中的抗體C可發(fā)生特異性結合形成免疫復合物。所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。所述的金標抗體b中的抗體B優(yōu)選為兔IgG，相應地金標抗體c中的抗體C優(yōu)選為羊抗兔IgG0所述的檢測線上包被的Ro52抗原蛋白層為通過原核表達克隆化基因獲得的Ro52 抗原蛋白層。所述Ro52抗原蛋白是通過大腸桿菌原核表達的克隆化基因所獲得的重組蛋白。[0027]所述樣品墊的樣本來自人血清、血漿、全血樣本。根據(jù)本實用新型應用的單克隆抗體可通過由Kohler等(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. Nature,1975(256) 495-497)首先描述的雜交瘤法進行制備，或者可通過重組DNA法進行制備(見美國專禾Ij 4816567)。"單克隆抗體，，由 Clackson 等(Making antibody fragments using phage display libraries[J]. Nature,1991 :624-628)禾口 Marks 等(By-passing immunization Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage[J]. Journal of Molecular Biology, 1991 :581-597)所述技術從噬菌體抗體文庫中分離。根據(jù)本實用新型應用的多克隆抗體可通過陳學清等(免疫學常用實驗方法.[M]， 2000 :15-26)通過免疫動物來制備。本實用新型的SPAlrotein G通過原核表達克隆化重組基因，由J.薩姆布魯克等 (分子克隆實驗指南.[M]，2002:12^-1232)描述的大腸桿菌原核表達克隆化基因。本實用新型的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙的應用，其是定性檢測人血清中抗Ro52抗體，輔助診斷干燥綜合癥。本實用新型的檢測原理具體為選用親和層析純化的重組表達的R052抗原蛋白， 金標抗體a和金標兔IgG作為膠體金標記復合物，噴涂于結合墊，利用間接法來檢測血清樣品中是否含有抗R052抗體。檢測時，樣本隨著層析泳動到結合墊并浸潤膠體金標記復合物，其中的人IgG和金標抗體a結合形成人IgG-金標抗體a復合物，由于毛細效應，此人 IgG-金標抗體a復合物沿包被膜泳動向前，若血清樣品中有抗R052抗體，此人IgG-金標抗體a復合物與包被于硝酸纖維素膜上的抗原蛋白發(fā)生特異性免疫結合反應，形成金標抗體a-人IgG-Ro52抗原蛋白三聯(lián)體復合物而被截留在檢測線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶；由于毛細效應繼續(xù)泳動向前，金標兔IgG與包被在質(zhì)控線上的羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶，多余的未結合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線和質(zhì)控線都出現(xiàn)條帶的判為陽性結果；若血清樣品中不含有抗R052抗體，金標抗體a到達檢測線時，不與包被在檢測線上的抗原蛋白發(fā)生免疫反應，因此在檢測線處沒有出現(xiàn)紫紅色條帶，金標抗體a繼續(xù)泳動向前到達吸水墊，而金標兔 IgG繼續(xù)泳動向前與包被于質(zhì)控線處羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應而被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成紫紅色條帶，因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)條帶判為陰性結果。本實用新型將基因工程菌表達的抗原蛋白首次引入到試紙條中，實現(xiàn)了高特異性、高靈敏度、高準確度的檢測性能。目前市面上也出現(xiàn)了商品化ELISA試劑盒，但金標層析試紙與之相比，仍有諸多不同之處，不受場地人員之限，檢測時間短即5-10分鐘，判讀結果簡便。此外該試紙具有高特異性、高靈敏度、高準確度，能滿足市場的快速篩選SS，為病人及早診斷治療提供條件，同時，也能滿足基層實驗室、即時檢測、床邊檢測的需求。與現(xiàn)有的檢測方法相比，本實用新型優(yōu)點1.本實用新型的獨特性在于基因重組表達的Ro52抗原蛋白首次應用于膠體金層析試紙，大大提高了其檢測靈敏度，通過膠體金試紙可快速篩選出抗R052抗體所有陽性樣本(能檢出大于25RU/ml的樣本)。2.本實用新型的優(yōu)點是生產(chǎn)成本低。本實用新型所提供的抗R052抗體的檢測試紙所需的核心試劑是抗體A即抗人IgG或SPA或PROTEIN G、抗體C、抗體B、抗原蛋白，其單條試紙所用試劑量少，且可通過購買商品化試劑或自制，抗原蛋白來源于自制的純化基因工程抗原蛋白。3.與已公開的用于抗R052抗體檢測的其他方法相比，本實用新型的試紙具有許多其他方法所不能比擬的優(yōu)點，如檢測時間短(5 IOmin)；不需要任何特殊儀器，可實現(xiàn)床邊檢測和門診即時檢測；操作簡便，只需一步反應，操作人員無需培訓，檢測成本低；對溫度無特殊要求，無需冷凍，儲存運輸方便，室溫可保存M個月。

圖1為本實用新型的側(cè)面結構示意圖。圖2為本實用新型的檢測結果示意圖。其中圖加所示為加樣后，反應3 5min即可看到檢測區(qū)D和控制區(qū)E相應位置上出現(xiàn)紫紅色條帶；圖2b所示為當控制區(qū)E和檢測區(qū)D均出現(xiàn)紫紅色條帶，結果為陽性，說明血清中含有抗R052抗體；圖2c所示為如只在控制區(qū)E出現(xiàn)一條紫紅色條帶，檢測區(qū)D不出現(xiàn)紫紅色條帶， 結果為陰性，說明血清中不含抗R052抗體；圖2dJe所示為如控制區(qū)E不出現(xiàn)紫紅色條帶，無論檢測區(qū)D是否有條帶出現(xiàn)， 都說明試紙失效。
具體實施方式
本實用新型所述的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙，如圖1所示，該試紙是在底板7上由一側(cè)向另一側(cè)順次相互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜3、結合墊2、樣品墊 1、吸水墊6。結合墊2上包被有金標抗體a層和金標抗體b層，金標抗體a層的抗體A為羊抗兔IgG金標抗體或鼠抗人IgG金標抗體或葡萄球菌A蛋白(SPA)金標抗體或鏈球菌G蛋白金標抗體；金標抗體b層中的抗體B為兔IgG。硝酸纖維素包被膜3上設置有檢測線4和質(zhì)控線5，檢測線4包被有R052抗原蛋白，質(zhì)控線5包被有金標抗體c層，金標抗體c層中的抗體為羊抗兔IgG。下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本實用新型。實施例1R052抗原蛋白制備應用于本試紙的R052抗原蛋白是通過基因克隆技術構建重組基因，然后采用原核表達技術成功表達出全部為人源的R052抗原蛋白。其中，R052抗原蛋白來源于純化基因工程抗原蛋白。實施例2抗體制備抗體A及抗體C、抗體B用下述方法來制備。其中抗體A中的抗人IgG、抗體C及抗體B—般可通過在動物上經(jīng)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射純化的免疫原和佐劑而產(chǎn)生。通過將0. 05mg Img免疫制劑(分別針對山羊或小鼠)與3倍體積的Freund’ s完全佐劑混合得到注射溶液，將該注射溶液在動物皮內(nèi)多部位注射，一個月后將動物用1/5 至1/10原初量的人IgG的Freimd’ s完全佐劑混合液經(jīng)多部位動物皮下注射而加強免疫。 7 14天后將動物放血，測定血清抗人IgG滴度。對動物加強免疫直至滴度達到平臺期。 在許多免疫學教科書中描述了生產(chǎn)多克隆抗體的方法，例如，陳學清等《免疫學常用實驗方法》。通過從被免疫的動物回收脾細胞并使細胞永生化，例如通過與骨髓瘤細胞融合或通過Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化，并且篩選能表達目的抗體的單克隆抗體(Kohler，Milstein. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion [J]. European Journal of Immunology，1976 :501_511)。可通過大腸桿菌原核表達克隆化基因來制備抗體A中的重組葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白，具體操作方法參見J.薩姆布魯克等(分子克隆實驗指南.[M]，2002: 1228-1232)，或購買商品化的重組葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白。實施例3膠體金溶液制備將0. 01 %的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入每IOOmL HAuCl4溶液加入適量的還原劑溶液，顏色從藍色，然后淺藍、藍色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7 IOmin出現(xiàn)透明的橙紅色。再用超濾或微孔濾膜(0. 45 μ m)過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。 制備好的膠體金外觀應純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色顆粒狀沉淀物時棄用。其中所使用的還原劑可以為檸檬酸三鈉(Frens 1973)、鞣酸-檸檬酸三鈉(Slot 與Gueeze 1985年)、白磷，優(yōu)選使用檸檬酸三鈉，更優(yōu)選地使用檸檬酸三鈉。其中所用玻璃容器應絕對清潔，用前需經(jīng)酸洗、硅化。其水應為去離子超純水，電阻率達18. 2ΜΩ。膠體金溶液制備過程中，各溶液的配制方法如下LHAuCl4的配制用超純水溶解氯金酸，配成1 %溶液，置4°C備用，有效期四個月。IOOOmL HAuCl4溶液配方IOg HAuCl4、超純水定容至1000mL。2. 檸檬酸三鈉的配制檸檬酸三鈉(Sodium Citrate)的配制用超純水溶解Sodium Citrate,配成1 %溶液，0. 22 μ m膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。實施例4本實用新型的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，具體包括如下步驟步驟1，硝酸纖維素包被膜的制備(1)采用實施例1的方法制備R052抗原蛋白；(2)羊抗兔IgG金標抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實施例3制備的膠體金pH7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 μ g羊抗兔IgG，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌 10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；(3)硝酸纖維素包被膜3的制備，用包被膜緩沖液稀釋R052抗原蛋白至濃度為 1. 0 1. 5mg/mL,調(diào)整ΒΙΟ-Dot儀器，噴涂于硝酸纖維素膜(NC)上檢測線4處，靠近結合墊2端，距結合墊2約9. 5mm，使Ro52抗原蛋白包被于硝酸纖維素包被膜的檢測線4上；用包被緩沖液將羊抗兔IgG稀釋到0. 8 1. 5mg/mL,以1 10 μ 1/cm用BIO-Dot 儀器噴涂于硝酸纖維素膜(NC)上靠近吸水墊6的質(zhì)控線5處，距吸水墊6約9mm。檢測線 4與質(zhì)控線5兩線距離約5 8mm，噴線應粗細均勻。37°C烘干，封裝備用。其使用的包被緩沖液可以是硼酸鹽，碳酸鹽，磷酸鹽，Tris-HCl或Tris-磷酸鹽， 醋酸鹽，巴比妥，等等，其緩沖液的目的為提供一定PH和離子強度使蛋白包被并牢固包被于NC膜，其緩沖液pH值一般約為6 9. 5范圍內(nèi)，優(yōu)選為6. 5 7. 5的中性緩沖范圍內(nèi)， 且最優(yōu)選緩沖液的PH值為7. 0 7. 4范圍內(nèi)。緩沖液優(yōu)選為磷酸鹽。其中的硝酸纖維素膜(NC)可以為任何商品化硝酸纖維素膜，S&S AE99、whatman 8ym、millipore M135、sartorius CN140等。使用的具體的NC膜不是本實用新型的關鍵， 但是在每次測定中，上述幾種NC膜可以作為優(yōu)選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩沖液處理的膜，與所用檢測線抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會很大程度造成線條不均勻，拖帶或是彌散的現(xiàn)象，因此運用組裝試紙來選擇優(yōu)選的NC膜。步驟2，結合墊的制備(1)羊抗人IgG金標抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實施例3制備的膠體金 pH8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g羊抗人IgG，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3 次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；(2)兔IgG金標抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實施例3制備的膠體金pH值至 7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g兔IgG，攪拌10 30min，然后加入 BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。(3)結合墊的制備經(jīng)緩沖液將聚脂膜浸泡30分鐘，37°C烘干，將羊抗人IgG金標抗體和兔IgG金標抗體按一定的比例混合后，用ΒΙΟ-Dot儀器，以0. 5 4 μ 1/cm的用量噴涂在預處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥，待干燥完畢之后得結合墊2，結合墊2真空包裝， 置2°C 8°C備用。置于2°C 8°C的環(huán)境下備用；結合墊的制備過程中，可以使用的緩沖液包括以下幾種(a)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% TritonX-IOO ；(b) 1% PVAU% BSA,0. 05% PR0CLIN 300、0. 1% TritonX-100, ρΗ7· OPBS ；(c) 1% PVAU% BSA、0. 05% PR0CLIN 300, ρΗ7· 0 PBS ；(d)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3、0. 1% Tween-20 ；(e)含有 PVA,0. 71% Na3PO4U % BSA,0. 05% NaN3>0. 1% Tween-20, pH7. 0 PBS ；其優(yōu)選的緩沖液是緩沖液(d)，因為它具有區(qū)別陰陽性樣品的最大分辨率。 PR0CLIN 300和NaN3起防腐作用，而Tween-20具有去污和親水作用。羊抗人IgG金標抗體和兔IgG金標抗體之間的混合比例可以依照下述方法進行通過預實驗基本確定兔IgG金標抗體的0D20，用ΒΙΟ-Dot噴量1 μ 1/cm噴于預處理的聚脂膜上，用0. OlMPBS為上樣緩沖液，即能得到預期的顏色強度的條帶，確定兔IgG金標抗體的應用OD噴量為Ιμ 。[0087]隨后將羊抗人IgG金標抗體進行梯度稀釋到終濃度OD 100、80、60、40、20，然后將兔IgG金標抗體稀釋到終濃度OD 20，用ΒΙΟ-Dot將以上羊抗人IgG金標抗體和兔IgG金標抗體混合物噴量為3 μ 1/cm噴于處理好的聚酯膜，將制備的硝酸纖維素包被膜3、結合墊 2、樣本墊1、吸水墊6依次粘貼于底板7上，用陽性血清、臨界參考值血清、陰性血清為調(diào)試對象。判定依據(jù)陽性血清的檢測線4和質(zhì)控線5兩者的條帶顏色強度一致為依據(jù)，臨界參考值血清能出現(xiàn)，陰性血清無條帶出現(xiàn)的那個OD值，即為這批的應用量。通過本試驗得出 0D20 40較為符合要求。步驟3，樣品墊的制備將玻璃纖維膜按45mL/片，用緩沖液均勻灑涂于玻璃纖維膜上，于37°C烘干后得樣品墊，樣品墊用鋁箔袋封裝，備用；該步驟可以用的緩沖液包括以下幾種(a) 0. 05M Borax、0. OlMPBS (ρΗ7· 0)、0· 1% Sodium CaseinU % PEG20000,2% BSA, 0. 05% NaN3 ；(b)0. 05M Borax、0. OlMPBS (ρΗ7· 0)、0· 1 % Sodium CaseinU % PEG20000.2 % Casein,0. 05% NaN3 ；(c)0. 05M Tris-cl (pH7. 0) ,0. 01MPBS.0. 1 % Sodium CaseinU % PEG20000.2 % Case in、0.05%Na 。優(yōu)選的緩沖液是緩沖液(a)，因為它具有區(qū)別陰陽性樣品的最大分辨率，NaN3起防腐作用。步驟4首先進行原材料預裁剪樣品墊的裁切用裁切機將樣品墊切成與PVC制成的底板等長度即長^cm,寬 2. km，置干燥房間備用。吸水墊的裁切用裁紙機將吸水紙切成與PVC制成的底板等長度即長28cm，寬 3cm制成吸水墊，置干燥房間備用。結合墊的裁切用裁切機將結合墊切成與PVC制成的底板等長度即長^cm,寬 2. km，置干燥房間備用。硝酸纖維素包被膜的裁切用裁紙機將硝酸纖維素包被膜切成與PVC制成的底板等長度即長^cm,寬1cm，置干燥房備用。將硝酸纖維素包被膜3、結合墊2、樣本墊1、吸水墊6按圖1所示依次層疊在PVC 塑料制成的底板7上，組成大板。組裝車間溫度應控制在25°C 37°C，濕度20% 30%。步驟5切條用切條機將大板切成單人份，每人份寬度按照一定要求切成2. 5mm 4mm的寬度，隨機抽檢，靈敏度能檢出室內(nèi)質(zhì)控樣品(即弱陽性樣本)，條帶顯色程度達到如圖2d， 且無非特異性條帶，則產(chǎn)品通過質(zhì)控規(guī)定成為合格產(chǎn)品。組裝、包裝將1人份已切好的試紙組裝在備好的試紙卡里，使加樣窗對應試紙的樣品墊，結果顯示窗對應檢測區(qū)和控制區(qū)，組裝車間溫度應控制在25°C 37°C，濕度 20% 30%。再與干燥劑、說明書、樣品加樣器封裝在外包袋里，于4 25°C避光保存。在上述膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備過程中，各溶液的配置方法如
9下1.0. IM碳酸鉀的配制用超純水配制，0.22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期一個月。IOOOmL 0. IM K2CO3 溶液配方13. 8g K2CO3 ；超純水定容至 IOOOmL02. 10% BSA的配制用超純水配制，0.05%疊氮鈉(NaN3), 0.22μπι膜濾過，置 4°C備用，有效期兩周。IOOOmL 10% BSA溶液配方100g BSA,0. 5g NaN3 ；超純水定容至 1000mL。3、包被緩沖液的配制9gNacl、l. 15gNa2HP04,0. 23g NaH2P04、IOgSucrose、 0. 5gEDTA溶于IL超純水中，過濾置于4°C備用。4.洗滌液也即保存液的配制2% BSA,0. 05% (NaN3) >0. OlM ρΗ7· 2 PBS，0. 22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期兩周。IOOOmL 標記洗滌保存液配方:20g BSA,0. 5g NaN3、0. OlM ρΗ7· 2 PBS 定容至 IOOOmL05.金標稀釋液的配制IOOOmL稀釋液的配制2. 423g tris，lOgBSA，0. 2gNa 溶于超純水中，調(diào)pH8. 0，定容到 IOOOmL0用稀釋液將金標稀釋到工作濃度后，加入20% Sucrose和5%的海藻糖。實施例5該實施例的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實施例4相同，只是將該實施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標抗體的制備步驟替換為葡萄球菌A蛋白(SPA)金標抗體的制備，具體如下用pH9. 00. 2M硼酸緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ gSPA蛋白，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌 10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存
液將沉淀重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的葡萄球菌A蛋白(SPA)金標抗體和兔IgG金標抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。實施例6該實施例的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實施例4相同，只是將該實施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標抗體的制備步驟替換為鼠抗人IgG金標抗體的制備，具體如下用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.0 8.0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min， 離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的鼠抗人IgG金標抗體和兔IgG金標抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。實施例7該實施例的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實施例4相同，只是將該實施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標抗體的制備步驟替換為鏈球菌G蛋白金標抗體的制備，具體如下[0124]用pH9. 00. 2M硼酸緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ g鏈球菌G蛋白，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保
存液將沉淀重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的鏈球菌G蛋白金標抗體和兔IgG金標抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。本實用新型將重組表達的Ro52抗原蛋白引入到膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，能實現(xiàn)血液樣本中的抗R052抗體的檢測，能快速、便捷地輔助診斷干燥綜合癥。實施例8樣本處理取全血1 5ml，自然凝集5分鐘后，3000 5000g/5min lOmin，取上清即得到待測樣品溶液，至少有100 μ 1以上待測樣品溶液。用微量加樣器吸取以上血清50 70 μ 1樣本于樣品墊，緩慢加樣。或者用吸管將血清樣本緩慢滴加3 5滴于樣品墊上，5 IOmin觀察結果，根據(jù)條帶出現(xiàn)情況來判讀陰陽性結果。實施例9試劑盒的檢測和臨床性能評估本實用新型的膠體金抗Ro52抗體檢測試紙的金標抗體a的抗體A優(yōu)選為SPA，抗體b的抗體B為兔IgG，抗體c的抗體為羊抗兔IgG，對其試紙進行的臨床性能進行以下評估。1.穩(wěn)定性試驗1. 137°C加速穩(wěn)定性將試紙置于37°C進行加速實驗，每天取出用室內(nèi)質(zhì)控品進行測試，通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內(nèi)精密度來判斷試紙的穩(wěn)定性。4個月后結果顯示， 質(zhì)控品的檢測結果符合預期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。陰陽性參考品為 10份抗R052抗體陽性血清和10份抗R052抗體陰性血清。穩(wěn)定性實驗將試紙置于4°C進行常規(guī)穩(wěn)定性實驗，每月取出用室內(nèi)質(zhì)控品測試，同樣通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內(nèi)精密度來判斷試紙的穩(wěn)定性。12個月后結果顯示，質(zhì)控品檢測結果符合預期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。18個月后結果顯示，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率仍為100%。M個月后檢測結果顯示，出現(xiàn)一例假陰性。綜合以上結果說明試紙在2 8°C貯存，2年內(nèi)是穩(wěn)定的。2.診斷靈敏度從臨床中收集到100份確診為原發(fā)性膽汁肝炎(SQ病人的血清，用自制的膠體金試紙按照說明書上的操作步驟對上面收集到的SS病人血清進行檢測。5min后統(tǒng)計結果如下
權利要求1.膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，包括有樣品墊(1)、結合墊O)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)，所述樣品墊(1)、結合墊O)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)由底板(7)的一側(cè)依次向所述底板(7)的另一側(cè)相互搭接粘貼在所述底板(7)上，其特征在于所述的結合墊( 包被有金標抗體a層和金標抗體b層；所述的硝酸纖維素包被膜(3)上設置有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，所述的檢測線(4)包被有Ro52抗原蛋白層，所述的質(zhì)控線( 包被有金標抗體c層。
2.根據(jù)權利要求1所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述的金標抗體a層中的抗體A為抗人IgG多克隆抗體或抗人IgG單克隆抗體，所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種；所述的抗人IgG單克隆抗體為羊源或兔源中的一種。
3.根據(jù)權利要求1所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述金標抗體a層中的抗體A為葡萄球菌A蛋白。
4.根據(jù)權利要求1所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述的金標抗體b層中的抗體B和金標抗體c層中的抗體C同時或不同時為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種。
5.根據(jù)權利要求4所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，所述的單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。
6.根據(jù)權利要求1所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述的檢測線上包被的Ro52抗原蛋白層為通過原核表達克隆化基因獲得的Ro52抗原蛋白層。
專利摘要本實用新型公開了一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其包括有樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側(cè)依次向所述底板的另一側(cè)粘貼在所述底板上，其結合墊包被有金標抗體a層和金標抗體b層；硝酸纖維素包被膜上設置有檢測線和質(zhì)控線，檢測線包被有Ro52抗原蛋白層，質(zhì)控線包被有金標抗體c層。本實用新型采用間接免疫測定法，引入Ro52抗原蛋白，對結合墊和樣品墊進行了工藝優(yōu)化，來實現(xiàn)抗Ro52抗體的高靈敏度、高特異、高準確性的檢測性能，為輔助診斷干燥綜合癥提供參考依據(jù)。
文檔編號G01N33/558GK202083698SQ20112003198
公開日2011年12月21日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權日2011年1月28日
發(fā)明者孫宏彬, 張玥, 葛文斌, 錢杰, 韓永俊, 高成秀 申請人:上?？菩律锛夹g股份有限公司