專利名稱：一種水體中微囊藻毒素總量的氣相色譜-質譜聯用的檢測方法
一種水體中微囊藻毒素總量的氣相色譜-質譜聯用的檢測方法技術領域
一種水體中微囊藻毒素總量的氣相色譜-質譜聯用的檢測方法，屬于分析化學領域，同時也涉及水環(huán)境污染物的檢測技術領域。本發(fā)明設計先將樣品氧化后經氯甲酸甲酯甲酯化反應，最后由氯仿萃取，對微囊藻毒素的總量進行測定。
背景技術：
微囊藻毒素是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽毒素，具有肝臟毒性和腫瘤促進作用，它不僅對水生生物產生毒害作用，還可能通過飲用水和食物鏈的生物富集危害人類健康。世界各地由藻毒素引起的鳥類、魚類、家畜中毒事件頻繁發(fā)生，流行病學調查顯示，在我國原發(fā)性肝癌與飲用水水源中微囊藻毒素的高本底含量相關。因此，世界衛(wèi)生組織推薦的飲用水中藻毒素以MC-LR代表的標準值為1. 0 μ g/L。藻毒素毒性與MC-LR毒性相似，藻毒素種類繁多，已發(fā)現超過七十種。
目前微囊藻毒素的檢測方法很多，化學分析檢測包括薄層色譜法(TLC)，氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)和液相色譜-質譜法(LC-MQ，免疫檢測有酶聯免疫測定法 (ELISA)及生物化學檢測有蛋白磷酸酶抑制法。然而受到商品化標準品的限制，微囊藻毒素的定量檢測往往限于常見三種MC-LR、MC-RR、MC-YR，不能真實地反映出微囊藻毒素總量。 MMPB方法主要基于MC的氨基酸殘基Adda的特殊化學性質，可以有效提供所有類型MC (包括結合和非結合)的總量，MMPB未在自然環(huán)境中發(fā)現，因而可用于定量檢測MC。特別在毒性實驗中，可以獲得更加全面重要的信息。此前，藻毒素總量的測定是在一定條件下，MC分子中的共軛雙鍵氧化生成MMPB，采用液相色譜法檢測水中MMPB的含量，或將MMPB衍生化用氣相色譜法檢測，存在檢測靈敏度不夠的缺點。本發(fā)明主要提供了一種檢測MMPB的新方法，較之前的方法操作更便捷。
微囊藻毒素總量測定，采用氯甲酸甲酯對氧化產物甲酯化后進行氣相色譜-質譜聯用分析的方法尚未見文獻報道。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供了一種水體中微囊藻毒素總量的氣相色譜-質譜聯用的檢測方法，首先濃縮樣品并調節(jié)PH值至8. 5-9. 5，經高錳酸鉀溶液氧化，用亞硫酸氫鈉粉末終止反應并酸化，將氧化產物2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB)加入甲醇，以吡啶作為催化劑經氯甲酸甲酯甲酯化反應后由氯仿萃取，本方法用4-苯基丁酸作為內標物，并用氣相色譜-質譜聯用對甲酯化的MMPB進行檢測。該方法能夠有效檢測微囊藻毒素的總量 (以MMPB計)，具有良好的靈敏度和重現性，得到的結果令人滿意。
本發(fā)明的技術方案一種水體中微囊藻毒素總量的氣相色譜-質譜聯用的檢測方法，加入內標的樣品經高錳酸鉀與高碘酸鈉氧化溶液氧化后終止反應，氧化產物經氯甲酸甲酯甲酯化反應后由氯仿萃取，并用氣相色譜-質譜聯用對甲酯化的MMPB進行檢測。步驟為A、取IOOmL水樣，加入100μL含1. 0μ g/mL 4-苯基丁酸水溶液作為內標，在40°C下減壓濃縮至IOmL ；B、取上述濃縮液0.50-2. 00 mL,用0. 50mol/L K2C03水溶液調節(jié)pH值至8. 5-9. 5 ；C、加入25_50 μ L 的 0. 025 mol/L KMnO4 和飽和 NaIO4 水溶液，反應 60-120min ；D、加少量NaHSO3粉末終止反應后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹儀濃縮至2mL ；E、取0.5mL上述濃縮液，加入200 μ L甲醇和50 μ L吡啶，搖勻；加入50 μ L氯甲酸甲酯，振蕩Imin ；最后加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩后靜置5 min,溶液分層，用微量進樣針吸取底部的氯仿溶液直接進氣相色譜-質譜分析；氣相色譜-質譜分析條件為氣相色譜條件色譜柱DB-WAX石英彈性毛細管色譜柱，30mX0. 25mmX0. 25μπι ；載氣He，純度彡99. 999% ；流速lmL/min ；不分流進樣，進樣量1 μ L ；進樣口溫度260°C;柱初始溫度 100°C，以 15°C /min 升至 230°C，保持 ^iin ；質譜條件EI源；離子源溫度200°C ；傳輸線溫度250°C ；發(fā)射電流200 μ A ；檢測器電壓350V ；電子能量70eV ；選擇離子監(jiān)測模式，目標化合物以保留時間和特征離子定性；根據峰面積計算微囊藻毒素總量(以MMPB計)的濃度。
MMPB和內標物4-苯基丁酸甲酯化產物的保留時間及監(jiān)測離子見下表化合物保留時間(min)定量離子定性離子麗PB7. 891311904-苯基丁酸6. 95146178MMPB的質量濃度χ(μ g/L)為橫坐標，MMPB與內標4-苯基丁酸甲酯化產物的選擇離子色譜峰響應面積的比值y為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線為Y=6. 2401Χ+0. 1106。在 2. 0-200 μ g/L范圍內線性關系良好，可以滿足定量分析要求，方法的檢出限(S/N=3)為 0. 56 μ g/L。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明本方法較以往MC總量測定方法，較大縮短了檢測的時間，且檢出限和靈敏度更好。在甲酯化的部分，省去了萃取步驟，不僅是方法簡單而且減小了實驗誤差。且相對于用臭氧在_78°C氧化MC的方法而言，本文的反應均在室溫下進行，更有利于推廣到實際環(huán)境監(jiān)測中MC的總量檢測。


圖1天然水樣加標處理后得到MMPB與內標甲酯化產物的選擇離子色譜圖。
具體實施方式
實施例1 1、取IOOmL水樣，加入100μ L含1 μ g/mL 4-苯基丁酸水溶液作為內標，在40°C下減壓濃縮至IOmL ；2、取上述濃縮液0.50mL,用0. 5 mol/L K2CO3水溶液調節(jié)pH值至8. 5 ；3、加入25μ L的0. 025 mol/L KMnO4和飽和NaIO4水溶液，反應60min ；4、加少量NaHSO3粉末終止反應后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹儀濃縮至2mL ；5、取0. 5mL上述濃縮液，加入200 μ L甲醇和100 μ L吡啶，搖勻后加入50 μ L氯甲酸甲酯，振蕩Imin ；最后加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩后靜置5 min,溶液分層，用微量進樣針吸取底部的氯仿溶液直接進氣相色譜-質譜分析；氣相色譜-質譜分析條件為氣相色譜條件色譜柱DB-WAX石英彈性毛細管色譜柱，30mX0. 25mmX0. 25μ m ；載氣He，純度彡99. 999% ；流速lmL/min ；不分流進樣，進樣量1 μ L ；進樣口溫度260°C;柱初始溫度 100°C，以 15°C /min 升至 230°C，保持 ^iin ；質譜條件EI源；離子源溫度200°C ；傳輸線溫度250°C ；發(fā)射電流200 μ A ；檢測器電壓350V ；電子能量70eV ；選擇離子監(jiān)測模式，目標化合物以保留時間和特征離子定性；根據峰面積計算微囊藻毒素總量的濃度。
6、標準曲線的繪制，以內標法進行定量測定。
7、樣品及回收率的測定采集水樣，按以上步驟1-4用高錳酸鉀氧化，按步驟5進行甲酯化后，進行氣相色譜-質譜聯用儀檢測，并與上述得到的標準曲線比較，通過換算最終得到水樣中微囊藻毒素的總量。
采用相同水樣IOOmL加入2. OmL含250 μ g/L MC-LR水溶液，并按照下式進行回收率計算。
R= (C-C0) XlOOXk / (2. OX 1(Γ3Χ250) X 100%R-回收率，%C-添加標準溶液水樣的藻毒素含量(以MMPB計)，yg/L； Co"未添加標準溶液水樣的藻毒素含量(以MMPB計)，Ug/L； k~等物質量的藻毒素與MMPB換算系數，以4. 34計； 本方法的平均回收率70. 1% 實施例2 1、取IOOmL水樣，加入100μ L含1 μ g/mL 4-苯基丁酸水溶液作為內標，在40°C下減壓濃縮至IOmL ；2、取上述濃縮液1.00 mL，用0. 5 mol/L K2CO3水溶液調節(jié)pH至9. 0 ；3、加入50μ L的0. 025 mol/L KMnO4和飽和NaIO4水溶液，反應80min ；4、加少量NaHSO3粉末終止反應后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹儀濃縮至2mL ；5、取0.5mL上述濃縮液，加入100 μ L甲醇和50 μ L吡啶，搖勻；加入100 μ L氯甲酸甲酯，振蕩Imin ；最后加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩后靜置5 min,溶液分層，用微量進樣針吸取底部的氯仿溶液直接進氣相色譜-質譜分析；氣相色譜-質譜分析條件為采用GC-MS法檢測條件及標準曲線同實施例1。
6、樣品及回收率的測定采集水樣，按以上步驟1-4用高錳酸鉀氧化，按步驟5進行甲酯化后，進行氣相色譜-質譜聯用儀檢測，并與上述得到的標準曲線比較，通過換算最終得到水樣中微囊藻毒素的總量。
采用相同水樣IOOmL加入2. OmL含250 μ g/L MC-RR水溶液，并按照下式進行回收率計算。
R= ^C-C0) XlOOXk / (2. OX 1(Γ3Χ250) X 100%R-回收率，%C-添加標準溶液水樣的藻毒素含量(以MMPB計)，yg/L； Co"未添加標準溶液水樣的藻毒素含量(以MMPB計)，Ug/L； k~等物質量的藻毒素與MMPB換算系數，以4. 34計； 本方法的平均回收率75. 3% 實施例3 1、取IOOmL水樣，加入100μ L含1 μ g/mL4-苯基丁酸水溶液作為內標，在40°C下減壓濃縮至IOmL ；2、取上述濃縮液2.00 mL，用0. 5 mol/L K2CO3水溶液調節(jié)pH至9. 5 ；3、加入50 μ L 的 0. 025 mol/L KMnO4 和飽和 NaIO4 水溶液，反應 120min ；4、加少量NaHSO3粉末終止反應后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹儀濃縮至2mL ；5、取0.5mL上述濃縮液，加入IOOyL甲醇和50 μ L吡啶，搖勻；加入50 μ L氯甲酸甲酯，振蕩Imin ；最后加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩后靜置5 min,溶液分層，用微量進樣針吸取底部的氯仿溶液直接進氣相色譜-質譜分析；氣相色譜-質譜分析條件為采用GC-MS法檢測條件及標準曲線同實施例1。
6、樣品及回收率的測定采集水樣，按以上步驟1-4用高錳酸鉀氧化，按步驟5進行甲酯化后，進行氣相色譜-質譜聯用儀檢測，并與上述得到的標準曲線比較，通過換算最終得到水樣中微囊藻毒素的總量。
采用相同水樣IOOmL依次加入1. OmL含250 μ g/L MC-LR水溶液和3. OmL含 250yg/L MC-RR，并按照下式進行回收率計算。
R= (C-C0) XkXlOO/ (1. 0X IO-3X250+3. 0X IO-3X250) X 100%R-回收率，%C-添加標準溶液水樣的藻毒素含量(以MMPB計)，μ g/L； Co"未添加標準溶液水樣的藻毒素含量(以MMPB計)，μ g/L； k~等物質量的藻毒素與MMPB換算系數，以4. 34計； 本方法的平均回收率79. 6%上述實施例僅供說明發(fā)明之用，而不是對本發(fā)明的限定，任何對本發(fā)明簡單變化后的方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種水體中微囊藻毒素總量的氣相色譜-質譜聯用的檢測方法，其特征在于加入內標的樣品經氧化后加入甲醇，在吡啶催化下，經氯甲酸甲酯甲酯化反應后，用氯仿萃取， 氯仿層直接用于氣相色譜-質譜分析；該方法依次包括以下步驟A、取IOOmL水樣，加入IOOyL含1μ g/mL 4-苯基丁酸水溶液作為內標，在40°C下減壓濃縮至IOmL ；B、取上述濃縮液0.50-2. 00 mL,用0. 5 mol/L K2CO3水溶液調節(jié)pH值至8. 5-9. 5 ；C、加入25_50 μ L 的 0. 025 mol/L KMnO4 和飽和 NaIO4 水溶液，反應 60-120min ；D、加少量NaHSO3粉末終止反應后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹儀濃縮至2mL ；E、取0.5mL上述濃縮液，加入200μ L甲醇和50 μ L吡啶，搖勻；加入50 μ L氯甲酸甲酯，振蕩Imin ；最后加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩后靜置5 min,溶液分層，用微量進樣針吸取底部的氯仿溶液直接進氣相色譜-質譜分析；氣相色譜-質譜分析條件為氣相色譜條件色譜柱DB-WAX石英彈性毛細管色譜柱，30mX0. 25mmX0. 25μ m ；載氣He，純度彡99. 999% ；流速lmL/min ；不分流進樣，進樣量1 μ L ；進樣口溫度260°C;柱初始溫度 100°C，以 15°C /min 升至 230°C，保持 ^iin ；質譜條件EI源；離子源溫度200°C ；傳輸線溫度250°C ；發(fā)射電流200 μ A ；檢測器電壓350V ；電子能量70eV ；選擇離子監(jiān)測模式，目標化合物以保留時間和特征離子定性；根據峰面積計算微囊藻毒素總量以MMPB計的濃度。
2.根據權利要求1所述水體中微囊藻毒素總量的氣相色譜-質譜聯用的檢測方法，其特征在于進行檢測的水體為自然水體或飲用水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水體中微囊藻毒素總量的氣相色譜-質譜聯用的檢測方法，屬于分析化學領域，同時也涉及水環(huán)境污染物的檢測技術領域。本發(fā)明步驟包括濃縮樣品并調節(jié)pH值至8.5-9.5，經高錳酸鉀溶液氧化，用亞硫酸氫鈉粉末終止反應后酸化，將氧化產物2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB)加入甲醇，以吡啶作為催化劑經氯甲酸甲酯甲酯化反應后由氯仿萃取，本方法用4-苯基丁酸作為內標物，并用氣相色譜-質譜聯用對甲酯化的MMPB進行檢測。該方法能夠有效檢測微囊藻毒素的總量，具有良好的靈敏度和重現性，得到的結果令人滿意。
文檔編號G01N30/02GK102520086SQ201110419988
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權日2011年12月15日
發(fā)明者吳勝芳, 宋啟軍, 徐夏葉, 武鑠, 王利平, 虞銳鵬, 陶冠軍 申請人:江南大學