專利名稱：一種利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種利用浮萍評價(jià)重金屬生物毒性的方法。
背景技術(shù)：
浮萍(Lemna minor Lirm)是一種高等水生維管束植物，早在20世紀(jì)50年代，國外的毒理學(xué)家就提出應(yīng)用浮萍進(jìn)行毒理試驗(yàn)以監(jiān)測水環(huán)境質(zhì)量，并建立了標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法。歐洲標(biāo)準(zhǔn)(BS EN ISO 20079:2006)介紹了以浮萍葉片數(shù)的變化作為監(jiān)測指標(biāo)，試驗(yàn)過程中每天記錄生長指標(biāo)葉片數(shù)，通過葉片數(shù)計(jì)算生長速率抑制率從而得出EC50( R=(InXt2-InXtl) /T2-T1, Xtn代表Tn天時(shí)所測指標(biāo)值，R代表生長速度，Ir= (Rc-Rt)/RcX 100% (Ir生長抑制率，Rc對照組生長率，Rt處理組生長率)，以受試水樣的濃度對數(shù)對抑制率作圖，求出 EC50)。歐洲標(biāo)準(zhǔn)介紹的方法試驗(yàn)周期為7天，相對來說試驗(yàn)周期較長。試驗(yàn)設(shè)的對照培養(yǎng)有兩種選擇采用蒸餾水和營養(yǎng)液。對于用蒸餾水作對照，由于試驗(yàn)周期較長且浮萍生長需要營養(yǎng)，因此對照組的日生長速率值偏低，而且表現(xiàn)不一致，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的葉片發(fā)黃現(xiàn)象等，在此情況下，對照組浮萍不能正常生長因此影響了對照試驗(yàn)的準(zhǔn)確性；選用營養(yǎng)液作為對照時(shí)，為了保證各處理的一致性，各處理組相應(yīng)的也要添加等量的營養(yǎng)液， 營養(yǎng)液的添加可能會(huì)破壞受試水樣的組分，營養(yǎng)成分的存在也可能影響毒性測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，使EC50值受到影響。浮萍通常情況下是以出芽生殖為主，這種生殖方式類似于酵母的出芽生殖。正常生長狀態(tài)下浮萍的葉狀體通常含有2飛片葉子(frond)。當(dāng)浮萍受到逆境脅迫或營養(yǎng)脅迫時(shí)是不能夠完成出芽生殖的。在逆境脅迫下不僅浮萍的出芽生殖受到影響，葉狀體也會(huì)受到影響，表現(xiàn)之一是葉狀體分離，形成單葉，形成的單葉不能夠增殖。發(fā)明人在研究過程中通過觀察發(fā)現(xiàn)葉狀體的分離對不同重金屬污染表現(xiàn)敏感，并經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在銅、鐵、鋅、鉻這四種重金屬的處理下，短時(shí)間內(nèi)，浮萍便表現(xiàn)出了葉狀體分離現(xiàn)象。通過觀測浮萍葉狀體分離速度，來判斷污水毒性的強(qiáng)弱。此方法旨在調(diào)整試驗(yàn)周期，可將試驗(yàn)周期縮短為約 1天，解決長周期試驗(yàn)所帶來的對照組的結(jié)果不確定問題，建立運(yùn)用浮萍快速監(jiān)測污水的方法，使得污水的生物監(jiān)測更簡便、快速和準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過尋找一種新的試驗(yàn)方法和指標(biāo)，簡化試驗(yàn)過程，建立一種比現(xiàn)有方法更快速便捷的試驗(yàn)方法，即提供一種利用浮萍葉狀體分離對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法。本發(fā)明運(yùn)用浮萍對重金屬的毒理反應(yīng)即葉狀體的兩片葉子分離現(xiàn)象與重金屬的種類和濃度之間建立相關(guān)關(guān)系，通過培養(yǎng)過程中葉片的分離時(shí)間來對受試水樣的生物毒性進(jìn)行評價(jià)。本發(fā)明具體試驗(yàn)操作如下
3a.挑選浮萍并將其根剪成lmnT2mm后于受試水樣中培養(yǎng)；
b.240C 25°C連續(xù)光照條件下培養(yǎng)，光照條件為85 ;35ιιΕ/πι2/ν、40(Γ700ηπι ；
c.試驗(yàn)過程記錄記錄首次出現(xiàn)葉狀體分離的時(shí)間及單葉片數(shù)，隨后間隔時(shí)間記錄每株浮萍的單葉片數(shù)；
d.毒性評價(jià)根據(jù)步驟C所記錄的單葉片數(shù)評價(jià)受試水樣的毒性，若出現(xiàn)單葉片，即說明水樣受到污染，葉狀體分離現(xiàn)象越迅速，則水樣受污染程度越嚴(yán)重。優(yōu)選地，步驟a中挑選的浮萍每株含有兩個(gè)或三個(gè)葉狀體，一共挑選10株 15株； 步驟b中培養(yǎng)時(shí)間為1天，步驟c中記錄時(shí)間為15min、30min、lh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、 24h ；步驟b中光照溫度為。更優(yōu)選地，步驟c每次記錄浮萍的形態(tài)變化，包括根分離、葉片發(fā)黃情況，以進(jìn)一步判斷水樣毒性。采用本方法檢測水樣毒性時(shí)，浮萍對Fe、Cu、Cr的毒性反應(yīng)在20min時(shí)就能觀察至IJ，而Si的反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。且對Cu的檢測尤為靈敏，在0. 00064mmol/L的Cu存在下就可觀察到毒性效應(yīng)，此時(shí)培養(yǎng)時(shí)間為池。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于浮萍對某些重金屬(銅、鐵等)毒性反應(yīng)敏感，反應(yīng)時(shí)間較短，從而縮短試驗(yàn)的時(shí)間，節(jié)約成本，簡化操作。由于浮萍葉狀體對重金屬具有如此敏感的生理生態(tài)反應(yīng)，且觀測直接，可以作為水生生物監(jiān)測污水毒理效應(yīng)系統(tǒng)的有效補(bǔ)充方法。本發(fā)明主要在于監(jiān)測技術(shù)和指標(biāo)上的創(chuàng)新，浮萍的這種對于含有重金屬的污水特定的毒理反應(yīng)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)監(jiān)測指標(biāo)(葉片數(shù))的缺陷。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)還在于葉片分離是浮萍對重金屬離子毒性的生理反應(yīng)，該反應(yīng)直觀迅速，不用通過試驗(yàn)手段測量，在試驗(yàn)觀察上不存在系統(tǒng)誤差，以此來表征污水毒性具有參考價(jià)值，反應(yīng)了污水的急性毒性。急性毒性是指機(jī)體(人或試驗(yàn)動(dòng)物)一次(或M小時(shí)內(nèi)多次)接觸外來化合物之后所引起的中毒效應(yīng)，甚至引起死亡。急性毒性試驗(yàn)也可為慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供參考，如污水濃度系列的配置從而達(dá)到優(yōu)化慢性毒性試驗(yàn)的目的。本發(fā)明還有以下有益效果
1、以葉片分離數(shù)為試驗(yàn)指標(biāo)無需復(fù)雜的試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)儀器，節(jié)約試驗(yàn)成本；
2、減少人為主觀因素，使客觀性增強(qiáng)，減少試驗(yàn)的系統(tǒng)誤差；
3、此觀測指標(biāo)對重金屬反應(yīng)敏感，并且反應(yīng)穩(wěn)定；
4、試驗(yàn)周期約為一天，大大縮短了現(xiàn)有方法的試驗(yàn)周期，縮減時(shí)間成本；
5、摒除了現(xiàn)有方法存在對照可能影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此提高了試驗(yàn)陰性對照的可靠性。


圖1為CuSO4處理下葉片分離情況； 圖2為FeSO4處理下葉片分離情況；
圖3為SiSO4處理下葉片分離情況； 圖4為K2Cr2O7處理下葉片分離情況。
具體實(shí)施方式
試驗(yàn)材料浮萍(Lemna minor Lirm)、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)箱、含重金屬污水樣品；時(shí)間 2010. 6 2010. 12 ；溫度25°C。試驗(yàn)過程
1.C存培養(yǎng)(stock culture)
將浮萍接種于 STEINBERG medium 中 25°C連續(xù)光照(85 135uE/m2/s乂40(T700nm))條件下培養(yǎng)以用于水質(zhì)檢測，STEINBERG medium配方如下 STEINBERG medium 配方(pH 5. 3 5. 7)
權(quán)利要求
1.一種利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于運(yùn)用浮萍對重金屬的毒理反應(yīng)即葉狀體的兩片葉子分離現(xiàn)象與重金屬的種類和濃度之間建立相關(guān)關(guān)系，通過培養(yǎng)過程中葉片的分離時(shí)間來對受試水樣的生物毒性進(jìn)行評價(jià)。
2.如權(quán)利要求1所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于具體試驗(yàn)操作如下a.挑選浮萍并將其根剪成lmnT2mm后于受試水樣中培養(yǎng)；b.240C 25°C連續(xù)光照條件下培養(yǎng)，光照條件為85 ;35ιιΕ/πι2/ν、40(Γ700ηπι ；c.試驗(yàn)過程記錄記錄首次出現(xiàn)葉狀體分離的時(shí)間及單葉片數(shù)，隨后間隔時(shí)間記錄每株浮萍的單葉片數(shù)；d.毒性評價(jià)根據(jù)步驟C所記錄的單葉片數(shù)評價(jià)受試水樣的毒性，若出現(xiàn)單葉片，即說明水樣受到污染，葉狀體分離現(xiàn)象越迅速，則水樣受污染程度越嚴(yán)重。
3.如權(quán)利要求1所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于步驟 a中挑選的浮萍每株含有兩個(gè)或三個(gè)葉狀體，一共挑選10株 15株。
4.如權(quán)利要求1所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于步驟 b中培養(yǎng)時(shí)間為1天，步驟c中記錄時(shí)間為15min、30min、lh、ai、4h、Mi、8h、10h、12h、Mh。
5.如權(quán)利要求1所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于步驟 b中光照溫度為M°C。
6.如權(quán)利要求1所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于步驟 c每次記錄浮萍的形態(tài)變化，包括根分離、葉片發(fā)黃情況，以進(jìn)一步判斷水樣毒性。
7.如權(quán)利要求1所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于所述重金屬為Fe、Cu、Zn、Cr。
8.如權(quán)利要求7所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于所述重金屬為Cu，最低檢出限為0. 00064mmoml/L。
9.如權(quán)利要求8所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于當(dāng)培養(yǎng)池或以后才出現(xiàn)葉狀體分離時(shí)，可判斷受試水樣的Cu濃度小于或等于最低檢出限。
10.如權(quán)利要求7所述的利用浮萍對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法，其特征在于浮萍對Fe、Cu、Cr的毒性反應(yīng)在20min時(shí)就能觀察到，而Si的反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用浮萍葉狀體分離對重金屬進(jìn)行生物毒性評價(jià)的方法。運(yùn)用浮萍對重金屬的毒理反應(yīng)即葉狀體的兩片葉子分離現(xiàn)象與重金屬的種類和濃度之間建立相關(guān)關(guān)系，通過葉片的分離時(shí)間來對受試水樣的生物毒性進(jìn)行評價(jià)。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于浮萍對某些重金屬(銅、鐵等)毒性反應(yīng)敏感，反應(yīng)時(shí)間較短，從而縮短試驗(yàn)的時(shí)間，節(jié)約成本，簡化操作。由于浮萍葉狀體對重金屬具有如此敏感的生理生態(tài)反應(yīng)，且觀測直接，可以作為水生生物監(jiān)測污水毒理效應(yīng)系統(tǒng)的有效補(bǔ)充方法。
文檔編號G01N33/18GK102507889SQ20111034918
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者丁芝海, 辛國榮, 鄭政偉, 郭旭英 申請人:中山大學(xué)