專利名稱：一種昆明山海棠藥材的質(zhì)量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥材的質(zhì)量檢測方法，特別是涉及昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法。
背景技術(shù)：
色譜指紋圖譜用于中藥質(zhì)量檢測符合中藥復(fù)雜的多組分特點(diǎn)，在某些化學(xué)結(jié)構(gòu)尚不清楚的情況下，能夠較為全面地控制中藥材的穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)鑒別相比較，指紋圖譜能夠更好的反映中藥(植物藥)的整體質(zhì)量信息，借助現(xiàn)代分析儀器等先進(jìn)手段進(jìn)行分析，方便易行。美國FDA及WHO通過了 “對植物藥允許以指紋圖譜判斷上市產(chǎn)品批間樣品的一致性”的規(guī)定。近年來，日、韓、德等國的植物藥研究也廣泛應(yīng)用指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量檢測。由此可見，指紋圖譜已成為控制植物藥的有效控制手段，廣·泛得到應(yīng)用。昆明山海棠為衛(wèi)矛科雷公藤屬多年生落葉藤本灌木[Tripterygiumhypoglaucum(Levl)Hutch],又名粉背雷公藤、火把花、紫金皮等，中醫(yī)用于殺蟲、舒筋活絡(luò)、清熱解毒、祛風(fēng)除濕等。國內(nèi)外研究相繼發(fā)現(xiàn)昆明山海棠在眾多自身免疫性疾病(如紅斑狼瘡等)、腫瘤、白血病、以及艾滋病等方面的重要價值。但目前，現(xiàn)有方法僅上海市藥材標(biāo)準(zhǔn)和廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)有收載昆明山海棠的質(zhì)量檢測方法。對昆明山海棠藥材的質(zhì)量檢測手段僅限于簡單的性狀和顯微鑒別，沒有對主要有效成分的定性或定量的鑒別，質(zhì)量檢測方法及其缺乏。本發(fā)明建立了昆明山海棠藥材的指紋圖譜的鑒別方法，通過藥材的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，以確保藥材質(zhì)量穩(wěn)定、可控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法，該方法包括如下步驟A、供試品溶液制備稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末O. 5 1. 5重量份，置錐形瓶中，加入甲醇60 100體積份，置30 50°C超聲水浴中超聲提取O. 5 1. 5小時，室溫放置O. 5 1. 5小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5 15分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?體積份溶解，在冰箱I 5°C下放置O. 5 1. 5小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5體積份稀釋，稀釋液用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；B、對照品溶液制備取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每體積份含O. 00005 O. 00015重量份雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液；
C、色譜條件色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250X4. 6mm,5 μ m);流動相乙腈-甲醇-O. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫10 30°C;流速1. Oml/分鐘；檢測波長210nm ；D、測定法吸取供試品溶液與對照品溶液各O. 00001體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰,其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰,各峰號相對保留時間為5號峰O. 140 O. 160,24號峰O. 560 O. 580,32號峰O. 820 O. 840,36號峰1、37號峰1. 030 1. 050。本發(fā)明昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法，優(yōu)選如下步驟A、供試品溶液制備稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末I重量份，置錐形瓶中，加入甲醇80體積份，置40°C超聲水浴中超聲提取I小時，室`溫放置I小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?體積份溶解，在冰箱I 5°C下放置I小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5體積份稀釋，稀釋液用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；B、對照品溶液制備取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每體積份含O. 0001重量份雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液；C、色譜條件色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250X4. 6mm,5 μ m);流動相乙腈-甲醇-O. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫20°C;流速1. Oml/分鐘；檢測波長2IOnm ；D、測定法吸取供試品溶液與對照品溶液各O. 00001體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰,其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰,各峰號相對保留時間為5號峰O. 156,24號峰O. 569,32號峰O. 829,36號峰1、37號峰1. 044。本發(fā)明昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法，還可以優(yōu)選如下步驟A、供試品溶液制備稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末O. 8重量份，置錐形瓶中，加入甲醇90體積份，置45°C超聲水浴中超聲提取O. 8小時，室溫放置O. 8小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心12分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?體積份溶解，在冰箱I 5°C下放置O. 6小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5體積份稀釋，稀釋液用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；B、對照品溶液制備取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每體積份含O. 00008重量份雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液；
C、色譜條件色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250X4. 6mm,5 μ m);流動相乙腈-甲醇-O. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫15。。;流速1. Oml/分鐘；檢測波長2IOnm ； D、測定法吸取供試品溶液與對照品溶液各O. 00001體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰,其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰,各峰號相對保留時間為5號峰O. 148,24號峰O. 560,32號峰O. 819,36號峰1、37號峰1. 035。本發(fā)明昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法還可以優(yōu)選如下步驟A、供試品溶液制備稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末1. 2重量份，置錐形瓶中，加入甲醇70體積份，置35°C超聲水浴中超聲提取1. 3小時，室溫放置1. 2小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心6分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?體積份溶解，在冰箱I 5°C下放置1. 2小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5體積份稀釋，稀釋液用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；B、對照品溶液制備取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每體積份含O. 00012重量份雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液；C、色譜條件色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250X4. 6mm,5 μ m);流動相乙腈-甲醇-O. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫25°C;流速1. Oml/分鐘；檢測波長2IOnm ；D、測定法吸取供試品溶液與對照品溶液各O. 00001體積份，注入液相色譜儀，測定，即得。上述昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法步驟C中的梯度洗脫流動相按下述比例設(shè)定:1、梯度I流動相A : B : C = 30 : 70 : 0，洗脫時間為30分鐘；2、梯度2流動相A : B : C = 49 : 51 : 0，洗脫時間20分鐘；3、梯度3流動相A B C = 61 29 10，洗脫時間為10分鐘；4、梯度4流動相A B C = 65 20 15，洗脫時間為15分鐘；5、梯度5流動相A B C = 92 8 0，洗脫至特征峰完全出現(xiàn)為止。上述梯度洗脫的流動相為連續(xù)變化的一個整體過程，其中A為乙腈，B為甲醇，C為O. 02% 磷酸溶液；A+B+C =100%。本發(fā)明昆明山海棠藥材的質(zhì)量檢測方法，5號峰為雷公藤甲素、36號峰為雷公藤紅素、37號峰為雷公藤內(nèi)酯甲。雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲含量可通過供試品溶液的峰面積與對照品溶液的峰面積比值計(jì)算得到。上述發(fā)明重量份與體積份的關(guān)系為g/ml的關(guān)系。本發(fā)明方法特點(diǎn)雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲是昆明山海棠藥材的主要有效成分，其含量的高低可直接反應(yīng)藥材質(zhì)量的好壞；本發(fā)明的指紋圖譜不僅可以測定上述三種成分的含量，還對其微觀的成分組成進(jìn)行分析，制定了指紋圖譜共有模式，從定性和定量方面都達(dá)到了最先進(jìn)的水平。


附圖1 :甲醇溶劑提取效果圖附圖2 :乙酸乙酯提取效果圖附圖3:提取次數(shù)的比較圖附圖4 :檢測波長的比較圖附圖5:穩(wěn)定性比較圖附圖6 :重復(fù)性比較圖附圖7 :昆明山海棠藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜附圖8 :昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有特征峰附圖9 :昆明山海棠藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜與對照樣品圖譜疊加圖下面實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例一方法學(xué)實(shí)驗(yàn)1、提取溶劑的選擇取昆明山海棠藥材粉末lg，分別加入乙酸乙酯、甲醇各80ml，依照本發(fā)明實(shí)施例1所述的方法測定，結(jié)果顯示乙酸乙酯提取液雜質(zhì)比甲醇少，脂溶性成分除32號峰提取率高于甲醇外，其余如雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲等成分相當(dāng)，而水溶性成分則是甲醇提取較為充分，衡量利弊，最后選擇甲醇為提取溶劑。見附圖一和二。2、提取次數(shù)的比較取昆明山海棠藥材粉末lg，分別用甲醇先后提取3次，每次80ml，依法測定，結(jié)果顯示一次提取可以便可滿足指紋圖譜技術(shù)要求。見附圖三。3、檢測檢測波長的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，比較了 210nm、220nm、267nm、280nm四種檢測波長，最后選取基本能顯示整體信息的210nm為測定檢測波長。見附圖四(l_210nm ;2_220nm ;3_267nm ;4_280nm)。實(shí)驗(yàn)例二 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，分別在O、1. 5、3、4. 5、6、7. 5、24、48、72小時不同時間點(diǎn)進(jìn)樣，所得色譜圖導(dǎo)入相似度計(jì)算軟件，計(jì)算夾角余弦相似度，各時間點(diǎn)的相似度均在O. 99以上，圖譜一致，表明穩(wěn)定性良好，見附圖五。實(shí)驗(yàn)例三重復(fù)性試驗(yàn)取昆明山海棠藥材粉末，稱取一式五份，依照本發(fā)明實(shí)施例1所述的方法測定，所得色譜圖導(dǎo)入相似度計(jì)算軟件，計(jì)算夾角余弦相似度，結(jié)果均在O. 99以上，5份樣品圖譜一致，表明重復(fù)性良好，見附圖六。實(shí)驗(yàn)例四建立昆明山海棠根的HPLC指紋圖譜共有模式將圖譜導(dǎo)入指紋圖譜分析軟件，選取10批昆明山海棠樣品，采用中位數(shù)篩選建立共有模式，共選了 42個特征峰，其中5號峰為雷公藤甲素triptolide，36號峰為雷公藤紅素Tripterine, 37號峰為雷公藤內(nèi)酯甲wilforlide,見附圖七(圖中從左到右的色譜峰分別是I到42號峰)、附圖八、附圖九(圖中從左到右三個色譜峰分別是雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲)。下述實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)施例一A、供試品溶液制備稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末lg，置錐形瓶中，加入甲醇80ml，置40°C超聲水浴中超聲提取I小時，室溫放置I小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?ml溶解，在冰箱I 5°C下放置I小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5ml稀釋，用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；B、對照品溶液制備取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每Iml含O. OOOlg雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液；C、色譜條件色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250 X 4. 6mm,5 μ m);流動相乙腈-甲醇-O. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫20°C;流速1. Oml/分鐘；檢測波長2IOnm ；

D、測定法吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰，其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰，各峰號相對保留時間為5號峰O. 156,24號峰O. 569,32號峰O. 829,36號峰1、37號峰1. 044。上述昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法步驟C中的梯度洗脫流動相按下述比例設(shè)定1、梯度I流動相Α : B : C = 30 : 70 : 0，洗脫時間為30分鐘；2、梯度2流動相Α B C = 49 51 0，洗脫時間20分鐘；3、梯度3流動相A B C = 61 29 10，洗脫時間為10分鐘；4、梯度4流動相A B C = 65 20 15，洗脫時間為15分鐘；5、梯度5流動相A B C = 92 8 0，洗脫至特征峰完全出現(xiàn)為止。上述梯度洗脫的流動相為連續(xù)變化的一個整體過程，其中A為乙腈，B為甲醇，C為O. 02% 磷酸溶液；A+B+C =100%。實(shí)施例二 A、供試品溶液制備稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末O. Sg,置錐形瓶中，加入甲醇90ml，置45°C超聲水浴中超聲提取O. 8小時，室溫放置O. 8小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心12分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?ml溶解，在冰箱I 5°C下放置O. 6小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5ml稀釋，用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
B、對照品溶液制備取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每Iml含O. OOOOSg雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液；C、色譜條件色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250 X 4. 6mm,5 μ m);流動相乙腈-甲醇-O. 02%磷酸溶液梯度洗脫;柱溫15°C;流速1. Oml/分鐘；檢測波長2IOnm ；D、測定法吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰，其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰，各峰號相對保留時間為5號峰O. 148,24號峰O. 560,32號峰O. 819,36號峰1、37號峰1. 035。上述昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法步驟C中的梯度洗脫流動相按下述比例設(shè)定1、梯度I流動相Α : B : C = 30 : 70 : 0，洗脫時間為30分鐘；2、梯度2流動相Α B C = 49 51 0，洗脫時間20分鐘；3、梯度3流動相A B C = 61 29 10，洗脫時間為10分鐘；4、梯度4流動相 A B C = 65 20 15，洗脫時間為15分鐘；5、梯度5流動相A B C = 92 8 0，洗脫至特征峰完全出現(xiàn)為止。上述梯度洗脫的流動相為連續(xù)變化的一個整體過程，其中A為乙腈，B為甲醇，C為O. 02% 磷酸溶液；A+B+C =100%。實(shí)施例三、A、供試品溶液制備稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末1. 2g，置錐形瓶中，加入甲醇70ml，置35°C超聲水浴中超聲提取1. 3小時，室溫放置1. 2小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心6分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?ml溶解，在冰箱I 5°C下放置1. 2小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5ml稀釋，用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；B、對照品溶液制備取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每Iml含O. 00012g雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液；C、色譜條件色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250 X 4. 6mm,5 μ m);流動相乙腈-甲醇-O. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫25°C;流速1. Oml/分鐘；檢測波長2IOnm ；D、測定法吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰，其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰，各峰號相對保留時間為5號峰O. 160,24號峰O. 578,32號峰O. 835,36號峰1、37號峰1. 048。上述昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法步驟C中的梯度洗脫流動相按下述比例設(shè)定1、梯度I流動相A : B : C = 30 : 70 : 0，洗脫時間為30分鐘；2、梯度2流動相A B C = 49 51 0，洗脫時間20分鐘；3、梯度3流動相A B C = 61 29 10，洗脫時間為10分鐘；4、梯度4流動相A B C = 65 20 15，洗脫時間為15分鐘；5、梯度5流動相A B C = 92 8 0，洗脫至特征峰完全出現(xiàn)為止。 上述梯度洗脫的流動相為連續(xù)變化的一個整體過程，其中A為乙腈，B為甲醇，C為O. 02% 磷酸溶液；A+B+C =100%。
權(quán)利要求
1.一種昆明山海棠藥材的質(zhì)量檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟 A、供試品溶液制備 稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末0. 5 1. 5重量份，置錐形瓶中，加入甲醇60 100體積份，置30 50°C超聲水浴中超聲提取0. 5 1. 5小時，室溫放置0. 5 1.5小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5 15分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?體積份溶解，在冰箱I 5°C下放置0. 5 1. 5小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5體積份稀釋，稀釋液用孔徑為0. 45 y m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液； B、對照品溶液制備 取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每體積份含.0.00005 0. 00015重量份雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液； C、色譜條件 色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250 X 4. 6mm, 5 u m)；流動相乙腈-甲醇-0. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫10 30°C ;流速1. Oml/分鐘；檢測波長2IOnm ； D、測定法 吸取供試品溶液與對照品溶液各0. 00001體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰，各峰號相對保留時間為5號峰0. 140 0. 160,24號峰.0.560 0. 580,32號峰0. 820 0. 840,36號峰1、37號峰1. 030 1. 050 ;其中5號峰為雷公藤甲素、37號峰為雷公藤內(nèi)酯甲，36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰。
2.如權(quán)利要求1所述的昆明山海棠藥材的質(zhì)量檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟 A、供試品溶液制備 稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末I重量份，置錐形瓶中，加入甲醇80體積份，置40°C超聲水浴中超聲提取I小時，室溫放置I小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?體積份溶解，在冰箱I 5°C下放置I小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5體積份稀釋，稀釋液用孔徑為0. 45 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液； B、對照品溶液制備 取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每體積份含·0.0001重量份雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液； C、色譜條件 色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250 X 4. 6mm, 5 u m)；流動相乙腈-甲醇-0. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫20°C ;流速1. Oml/分鐘；檢測波長·21 Onm ； D、測定法 吸取供試品溶液與對照品溶液各0. 00001體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰，其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰，各峰號相對保留時間為5號峰0. 156,24號峰0. 569,32號峰0. 829,36號峰1、37號峰1. 044。
3.如權(quán)利要求1所述的昆明山海棠藥材的質(zhì)量檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟 A、供試品溶液制備 稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末0. 8重量份，置錐形瓶中，加入甲醇90體積份，置45°C超聲水浴中超聲提取0. 8小時，室溫放置0. 8小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心12分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?體積份溶解，在冰箱I 5°C下放置0. 6小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5體積份稀釋，稀釋液用孔徑為0. 45 y m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液； B、對照品溶液制備 取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每體積份含.0.00008重量份雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液； C、色譜條件 色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250 X 4. 6mm, 5 u m)；流動相乙腈-甲醇-0. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫15°C ;流速1. Oml/分鐘；檢測波長21 Onm ； D、測定法 吸取供試品溶液與對照品溶液各0. 00001體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰，其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰，各峰號相對保留時間為5號峰0. 148,24號峰0. 560,32號峰0. 819,36號峰1、37號峰1. 035。
4.如權(quán)利要求1所述的昆明山海棠藥材的質(zhì)量檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟 A、供試品溶液制備 稱取昆明山海棠藥材經(jīng)粉碎過2號篩后的粉末1. 2重量份，置錐形瓶中，加入甲醇70體積份，置35°C超聲水浴中超聲提取1. 3小時，室溫放置1. 2小時，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心6分鐘，取出，傾取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘?jiān)眉状?體積份溶解，在冰箱I 5°C下放置1. 2小時，取出，在10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用甲醇5體積份稀釋，稀釋液用孔徑為0. 45 y m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液； B、對照品溶液制備 取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲三種對照品，分別用甲醇配成每體積份含,0.00012重量份雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的溶液，作為對照品溶液； C、色譜條件 色譜儀Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱Symmetry C18 (250 X 4. 6mm, 5 u m)；流動相乙腈-甲醇-0. 02%磷酸溶液梯度洗脫；柱溫25°C ;流速1. Oml/分鐘；檢測波長21Onm ； D、測定法吸取供試品溶液與對照品溶液各0. 00001體積份，注入液相色譜儀，測定，即得；昆明山海棠藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有42個特征峰，共有特征峰按照出峰順序?yàn)榈?號峰、24號峰、32號峰、36號峰、37號峰五個峰，其中36號峰為參照峰雷公藤紅素色譜峰，各峰號相對保留時間為5號峰0. 160,24號峰0. 578,32號峰0. 835,36號峰1、37號峰1. 048。5、如權(quán)利要求1-4任一所述的昆明山海棠藥材的質(zhì)量檢測方法，其特征在于昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量測定方法步驟C中的梯度洗脫中流動相按下述比例設(shè)定 梯度I流動相A : B : C = 30 : 70 : 0，洗脫時間為30分鐘； 梯度2流動相A : B : C = 49 : 51 : 0，洗脫時間20分鐘； 梯度3流動相A : B : C = 61 : 29 : 10，洗脫時間為10分鐘； 梯度4流動相A B C = 65 20 15，洗脫時間為15分鐘； 梯度5流動相A B C = 92 8 0，洗脫至特征峰完全出現(xiàn)為止； 上述梯度洗脫的流動相為連續(xù)變化的一個整體過程，其中A為乙腈，B為甲醇，C為.0.02% 磷酸溶液；A+B+C =100%。
全文摘要
本發(fā)明目的在于公開一種昆明山海棠藥材的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法。以乙腈-甲醇-0.02％磷酸溶液為流動相，梯度洗脫；注溫20℃；本發(fā)明的指紋圖譜不僅可以測定雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲三種成分的含量，還對其微觀的成分組成進(jìn)行分析，制定了指紋圖譜共有模式，從定性和定量方面都達(dá)到了最先進(jìn)的水平。
文檔編號G01N30/02GK103033570SQ20111030112
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者莫國強(qiáng), 謝培山, 郭忠慧, 顏玉貞, 何風(fēng)雷, 謝琳 申請人:廣州陳李濟(jì)藥廠有限公司