專利名稱：一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境污染技術(shù)，具體的說是一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類 及四環(huán)素類抗生素的方法。
背景技術(shù)：
抗生素因具有促進(jìn)生長和防止動物疾病的雙重功效而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)。 但是，由于對經(jīng)濟利益的過分追求和對抗生素的盲目依賴，近年來抗生素的使用量不斷提 高甚至以不合理的高劑量和高頻率使用。據(jù)統(tǒng)計，美國年消耗農(nóng)用抗生素24. 6 X 107t ;中國 是世界抗生素生產(chǎn)第一大國，僅2003年就生產(chǎn)青霉素2. 8 X 104t，土霉素1.0X 104t，分別占 當(dāng)年世界總產(chǎn)量的60%和65%。在眾多抗生素中，磺胺類和四環(huán)素類抗生素是國內(nèi)外畜禽 養(yǎng)殖場使用最為廣泛的兩類抗生素。大量的生產(chǎn)和使用導(dǎo)致抗生素通過多種途徑進(jìn)入各種 環(huán)境基質(zhì)從而引發(fā)污染事故。
磺胺類和四環(huán)素類抗生素長期以來被用于動物疾病的治療和預(yù)防，通常是作為動 物飼料添加劑以亞治療劑量添加到動物飼料中。這些作為飼料添加劑的抗生素被動物食用 后，并不能被動物完全吸收利用，其中70%以上的藥物會以母體形式通過糞便排出進(jìn)入生 態(tài)環(huán)境中，當(dāng)這些含有抗生素的畜禽糞便作為有機肥料施入農(nóng)田后，造成抗生素在土壤中 殘留。此外，由于缺乏針對性的處理工藝，污水處理廠并不能將抗生素有效地去除，很多抗 生素殘留在污泥中，這些含有抗生素的污泥回用農(nóng)田時，也會將抗生素帶入土壤環(huán)境，從而 造成土壤環(huán)境污染。
近年來，抗生素的環(huán)境污染問題及其生態(tài)危害已經(jīng)成為國際環(huán)境領(lǐng)域普遍關(guān)注的 熱點問題?？股貧埩魴z測方法的建立對于實現(xiàn)抗生素在環(huán)境基質(zhì)中的遷移轉(zhuǎn)化、生物有 效性、生態(tài)毒理效應(yīng)以及生態(tài)風(fēng)險評估等方面的研究具有重要的現(xiàn)實意義。由于抗生素種 類繁多，抗生素殘留檢測的方法也不盡相同。目前已有報道的關(guān)于磺胺類和四環(huán)素類抗生 素的檢測方法主要有微生物法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、高效液相色譜法、 液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等，不同的檢測方法有其不同的適用領(lǐng)域和優(yōu)缺點。例如，微生物法操 作簡單，但測定時間長、靈敏度低、特異性差；薄層色譜法具有簡單、快速、不需復(fù)雜儀器等 優(yōu)點，但該法分辨率和靈敏度較低；液相-質(zhì)譜聯(lián)用法提供的信息量最多，既可以進(jìn)行準(zhǔn)確 定量又可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析，靈敏度高，但該法通常情況下樣品前處理比較復(fù)雜，儀器 昂貴不易推廣應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類 抗生素的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法，其特征在于
I)將預(yù)處理后的樣品加入到含有CaCl2的提取劑中溶解，溶解后依次經(jīng)超聲提取、 震蕩提取，而后離心收集上清液，待用；
2)將上述收集的上清液通過HLB固相萃取柱分離，萃取富集收集洗脫液，過濾后待用；
3)利用高效液相色譜測定上述收集的濾液中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的量；
其中，提取劑為按體積比1:1組成的甲醇和EDTA-Mcllvaine緩沖液，CaCl2與提取劑的質(zhì)量比為1: 9 ;固相萃取洗脫液為甲醇。
所述高效液相色譜條件為流動相由乙腈㈧和O.Olmol/L草酸溶液⑶ 組成，柱溫為30°C，流速為1. Oml/min ;進(jìn)樣量為20 μ I。所述檢測器波長范圍設(shè)定為270nm-370nm ;高效液相色譜儀采用Waters2695_2696,液相色譜柱選用Waters X TerraRP-18(250X4. 6mm，5ym)。所述流動相為經(jīng)過O. 45 μ m有機膜超聲震蕩IOmin后的乙腈㈧，經(jīng)O. 45 μ m水膜超聲震蕩IOmin后的濃度為O. 01mol/L的草酸溶液⑶。
所述樣品預(yù)處理為將污水處理廠采集的脫水污泥、畜禽養(yǎng)殖場采集的畜禽糞或土壤樣品用錫箔紙包裹，冷凍干燥后于_20°C中保存，備用。
所述步驟I)將2g預(yù)處理后的樣品加入到IOml含有CaCl2的提取劑中溶解，溶解后依次經(jīng)超聲提取、震蕩提取，各15min,而后以4000r/min離心IOmin收集上清液,沉淀再次溶解在含有CaCl2的提取劑中提取2-3次，收集上清液，合并上述上清液待用。
所述步驟2)將上述收集的上清液通過采用提取劑活化處理后的HLB固相萃取柱分離，先用高純水淋洗HLB小柱， 干抽20min，再用3ml甲醇洗脫HLB小柱，洗脫液流速為 lml/min，萃取富集收集洗脫液在40°C水浴下用氮氣吹至近干，用體積比3 2的甲醇和水溶液定容，定溶后溶液過0. 22 μ m濾膜后收集樣品，待測。所述EDTA-Mcllvaine緩沖液的配置過程為，稱取12. 9g檸檬酸，27. 5gNa2HP04, 37. 2g乙二胺四乙酸二鈉，溶于水中并定容至 IL (pH = 4. 0) ο
本發(fā)明所具有的優(yōu)點
本發(fā)明對不同類型的固體樣品的前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。提取劑的成分價格低廉，前提取的步驟簡單快速；選用固相萃取技術(shù)對樣品進(jìn)行萃取、濃縮和凈化，萃取過程中有機溶劑用量少，便捷安全，且萃取柱具有防交叉污染、防霧化真空槽設(shè)計，質(zhì)量穩(wěn)定，樣品回收率高，精密度好；
本發(fā)明優(yōu)化了高效液相色譜儀對樣品中磺胺類和四環(huán)素類抗生素的測定條件。采用程序升溫的方法縮短了對八種抗生素的分離檢測時間，并且根據(jù)八種抗生素的特征吸收波長，選取270-370nm波長范圍內(nèi)連續(xù)掃描以更為準(zhǔn)確的測定抗生素的濃度。
總之，本發(fā)明通過優(yōu)化前處理及檢測條件，建立了同步提取、同時測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類和四環(huán)素類共八種抗生素的分析方法，在35min內(nèi)完成了對這兩大類八種抗生素的快速分離檢測，具有可操作性強、高效、快速、靈敏度和檢出率高等優(yōu)點。


圖1為本發(fā)明實施例提供的磺胺類和四環(huán)素類抗生素的高效液相色譜分離圖 (10mg/l)(其中SDZ :磺胺嘧啶；SMR :磺胺甲嘧啶；SM2 :磺胺二甲嘧啶；SMZ :磺胺甲惡唑；OTC :土霉素；TC :四環(huán)素；CTC :金霉素；DC :強力霉素)。
圖2為本發(fā)明實施例提供的樣品采樣地點分布圖。
具體實施方式
實施例
(I)樣品前處理
將按環(huán)境監(jiān)測要求布點采集的土壤樣品置于室內(nèi)風(fēng)干后粉碎過60目篩，備用；將污水處理廠采集的脫水污泥以及畜禽養(yǎng)殖場采集的畜禽糞便樣品用錫箔紙包裹，冷凍干燥后保存于_20°C冰柜中，備用。
準(zhǔn)確稱取2g土壤(污泥、糞便)樣品置于25ml玻璃離心瓶中，加入含有10% (質(zhì)量比)CaCl2的提取劑(V甲醇· VEDTA-Mcllcaine緩沖液一丄 I) IOml (其中CaCl2與提取劑的質(zhì)量比為1: 9)，依次超聲和振蕩提取各15min，4000r/min離心收集上清液；固體殘渣按上述方法提取2次，合并上清液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至IOml左右；將濃縮液通過事先用6ml甲醇和6ml EDTA-Mcllvaine緩沖液活化的HLB固相萃取小柱，萃取富集；先用6ml高純水淋洗HLB小柱，干抽20min，再用3ml甲醇洗脫HLB小柱，洗脫液流速為lml/min，收集全部洗脫液；洗脫液在40°C水浴下用氮氣吹至近干，用甲醇/水(體積比3 2)溶液定容至lml，溶液過 O. 22 μ m濾 旲后收集于樣品瓶中待測。
所述EDTA-Mcllvaine緩沖液的配置過程為，稱取12. 9g檸檬酸，27. 5gNa2HP04, 37. 2g乙二胺四乙酸二鈉，溶于水中并定容至IL(pH = 4. O)。
(2)色譜條件
采用Waters2695-2696高效液相色譜儀，連接UV檢測器，檢測器波長范圍設(shè)定為 270nm-370nm ;選用 Waters X TerraRP-18 (250 X 4. 6mm, 5 μ m)液相色譜柱；流動相為分別過O. 45 μ m有機膜的乙腈(A)和過水膜的O. Olmo 1/L草酸溶液(B)，超聲震蕩IOmin后待用和；柱溫為30°C，流速為1. Oml/min ;梯度洗脫程序見表I ;進(jìn)樣量為20 μ I。八種抗生素的色譜分離圖見圖1。
表1.程序升溫過程
權(quán)利要求
1.一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法，其特征在于1)將預(yù)處理后的樣品加入到含有CaCl2的提取劑中溶解，溶解后依次經(jīng)超聲提取、震蕩提取，而后離心收集上清液，待用；2)將上述收集的上清液通過HLB固相萃取柱分離，萃取富集收集洗脫液，過濾后待用；3)利用高效液相色譜測定上述收集的濾液中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的量；其中，提取劑為按體積比1:1組成的甲醇和EDTA-Mcllvaine緩沖液，CaCl2與提取劑的質(zhì)量比為 I 9;固相萃取洗脫液為甲醇。
2.按權(quán)利要求1所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法，其特征在于所述高效液相色譜條件為流動相由乙腈(A)和O.Olmol/L草酸溶液(B) 組成，柱溫為30°C，流速為l.Oml/min ;進(jìn)樣量為20 μ I。
3.按權(quán)利要求2所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法，其特征在于所述檢測器波長范圍設(shè)定為270nm-370nm;高效液相色譜儀采用 Waters2695-2696,液相色譜柱選用 Waters XTerraRP-18 (250 X 4. 6mm, 5 μ m)。
4.按權(quán)利要求2所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法，其特征在于所述流動相為經(jīng)過0.45μπι有機膜超聲震蕩IOmin后的乙腈(A)，經(jīng)O.45 μ m水膜超聲震蕩IOmin后的濃度為O. 01mol/L的草酸溶液(B)。
5.按權(quán)利要求1所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法，其特征在于所述樣品預(yù)處理為將污水處理廠采集的脫水污泥、畜禽養(yǎng)殖場采集的畜禽糞或土壤樣品用錫箔紙包裹，冷凍干燥后于_20°C中保存，備用。
6.按權(quán)利要求1所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法，其特征在于所述步驟I)將2g預(yù)處理后的樣品加入到IOml含有CaCl2的提取劑中溶解，溶解后依次經(jīng)超聲提取、震蕩提取，各15min,而后以4000r/min離心IOmin收集上清液， 沉淀再次溶解在含有CaCl2的提取劑中提取2-3次，收集上清液，合并上述上清液待用。
7.按權(quán)利要求1所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法，其特征在于所述步驟2)將上述收集的上清液通過采用提取劑活化處理后的HLB固相萃取柱分離，先用高純水淋洗HLB小柱，干抽20min，再用3ml甲醇洗脫HLB小柱，洗脫液流速為lml/min，萃取富集收集洗脫液在40°C水浴下用氮氣吹至近干，用體積比3 2的甲醇和水溶液定各，定溶后溶液過0. 22 μ m濾I吳后收集樣品，待測。
全文摘要
本發(fā)明涉及環(huán)境污染技術(shù)，具體的說是一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法。具體為將預(yù)處理后的樣品加入到含有CaCl2的提取劑中溶解，溶解后依次經(jīng)超聲提取、震蕩提取，而后離心收集上清液，待用；將上述收集的上清液通過HLB固相萃取柱分離，萃取富集收集洗脫液，過濾后待用；利用高效液相色譜測定上述收集的濾液中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的量；其中，提取劑為按體積比1∶1組成的甲醇和EDTA-Mcllvaine緩沖液；固相萃取洗脫液為甲醇。本發(fā)明通過優(yōu)化前處理及檢測條件，建立了同步提取、同時測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類和四環(huán)素類共八種抗生素的分析方法，在35min內(nèi)完成了對這兩大類八種抗生素的快速分離檢測。
文檔編號G01N30/88GK102998405SQ201110267859
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者安婧, 周啟星, 林琳 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所