專利名稱:一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及環(huán)境污染技術(shù),具體的說是一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類 及四環(huán)素類抗生素的方法。
背景技術(shù):
抗生素因具有促進(jìn)生長和防止動物疾病的雙重功效而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)。 但是,由于對經(jīng)濟利益的過分追求和對抗生素的盲目依賴,近年來抗生素的使用量不斷提 高甚至以不合理的高劑量和高頻率使用。據(jù)統(tǒng)計,美國年消耗農(nóng)用抗生素24. 6 X 107t ;中國 是世界抗生素生產(chǎn)第一大國,僅2003年就生產(chǎn)青霉素2. 8 X 104t,土霉素1.0X 104t,分別占 當(dāng)年世界總產(chǎn)量的60%和65%。在眾多抗生素中,磺胺類和四環(huán)素類抗生素是國內(nèi)外畜禽 養(yǎng)殖場使用最為廣泛的兩類抗生素。大量的生產(chǎn)和使用導(dǎo)致抗生素通過多種途徑進(jìn)入各種 環(huán)境基質(zhì)從而引發(fā)污染事故。
磺胺類和四環(huán)素類抗生素長期以來被用于動物疾病的治療和預(yù)防,通常是作為動 物飼料添加劑以亞治療劑量添加到動物飼料中。這些作為飼料添加劑的抗生素被動物食用 后,并不能被動物完全吸收利用,其中70%以上的藥物會以母體形式通過糞便排出進(jìn)入生 態(tài)環(huán)境中,當(dāng)這些含有抗生素的畜禽糞便作為有機肥料施入農(nóng)田后,造成抗生素在土壤中 殘留。此外,由于缺乏針對性的處理工藝,污水處理廠并不能將抗生素有效地去除,很多抗 生素殘留在污泥中,這些含有抗生素的污泥回用農(nóng)田時,也會將抗生素帶入土壤環(huán)境,從而 造成土壤環(huán)境污染。
近年來,抗生素的環(huán)境污染問題及其生態(tài)危害已經(jīng)成為國際環(huán)境領(lǐng)域普遍關(guān)注的 熱點問題??股貧埩魴z測方法的建立對于實現(xiàn)抗生素在環(huán)境基質(zhì)中的遷移轉(zhuǎn)化、生物有 效性、生態(tài)毒理效應(yīng)以及生態(tài)風(fēng)險評估等方面的研究具有重要的現(xiàn)實意義。由于抗生素種 類繁多,抗生素殘留檢測的方法也不盡相同。目前已有報道的關(guān)于磺胺類和四環(huán)素類抗生 素的檢測方法主要有微生物法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、高效液相色譜法、 液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等,不同的檢測方法有其不同的適用領(lǐng)域和優(yōu)缺點。例如,微生物法操 作簡單,但測定時間長、靈敏度低、特異性差;薄層色譜法具有簡單、快速、不需復(fù)雜儀器等 優(yōu)點,但該法分辨率和靈敏度較低;液相-質(zhì)譜聯(lián)用法提供的信息量最多,既可以進(jìn)行準(zhǔn)確 定量又可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析,靈敏度高,但該法通常情況下樣品前處理比較復(fù)雜,儀器 昂貴不易推廣應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類 抗生素的方法。
為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法,其特征在于
I)將預(yù)處理后的樣品加入到含有CaCl2的提取劑中溶解,溶解后依次經(jīng)超聲提取、 震蕩提取,而后離心收集上清液,待用;
2)將上述收集的上清液通過HLB固相萃取柱分離,萃取富集收集洗脫液,過濾后待用;
3)利用高效液相色譜測定上述收集的濾液中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的量;
其中,提取劑為按體積比1:1組成的甲醇和EDTA-Mcllvaine緩沖液,CaCl2與提取劑的質(zhì)量比為1: 9 ;固相萃取洗脫液為甲醇。
所述高效液相色譜條件為流動相由乙腈㈧和O.Olmol/L草酸溶液⑶ 組成,柱溫為30°C,流速為1. Oml/min ;進(jìn)樣量為20 μ I。所述檢測器波長范圍設(shè)定為270nm-370nm ;高效液相色譜儀采用Waters2695_2696,液相色譜柱選用Waters X TerraRP-18(250X4. 6mm,5ym)。所述流動相為經(jīng)過O. 45 μ m有機膜超聲震蕩IOmin后的乙腈㈧,經(jīng)O. 45 μ m水膜超聲震蕩IOmin后的濃度為O. 01mol/L的草酸溶液⑶。
所述樣品預(yù)處理為將污水處理廠采集的脫水污泥、畜禽養(yǎng)殖場采集的畜禽糞或土壤樣品用錫箔紙包裹,冷凍干燥后于_20°C中保存,備用。
所述步驟I)將2g預(yù)處理后的樣品加入到IOml含有CaCl2的提取劑中溶解,溶解后依次經(jīng)超聲提取、震蕩提取,各15min,而后以4000r/min離心IOmin收集上清液,沉淀再次溶解在含有CaCl2的提取劑中提取2-3次,收集上清液,合并上述上清液待用。
所述步驟2)將上述收集的上清液通過采用提取劑活化處理后的HLB固相萃取柱分離,先用高純水淋洗HLB小柱, 干抽20min,再用3ml甲醇洗脫HLB小柱,洗脫液流速為 lml/min,萃取富集收集洗脫液在40°C水浴下用氮氣吹至近干,用體積比3 2的甲醇和水溶液定容,定溶后溶液過0. 22 μ m濾膜后收集樣品,待測。所述EDTA-Mcllvaine緩沖液的配置過程為,稱取12. 9g檸檬酸,27. 5gNa2HP04, 37. 2g乙二胺四乙酸二鈉,溶于水中并定容至 IL (pH = 4. 0) ο
本發(fā)明所具有的優(yōu)點
本發(fā)明對不同類型的固體樣品的前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。提取劑的成分價格低廉,前提取的步驟簡單快速;選用固相萃取技術(shù)對樣品進(jìn)行萃取、濃縮和凈化,萃取過程中有機溶劑用量少,便捷安全,且萃取柱具有防交叉污染、防霧化真空槽設(shè)計,質(zhì)量穩(wěn)定,樣品回收率高,精密度好;
本發(fā)明優(yōu)化了高效液相色譜儀對樣品中磺胺類和四環(huán)素類抗生素的測定條件。采用程序升溫的方法縮短了對八種抗生素的分離檢測時間,并且根據(jù)八種抗生素的特征吸收波長,選取270-370nm波長范圍內(nèi)連續(xù)掃描以更為準(zhǔn)確的測定抗生素的濃度。
總之,本發(fā)明通過優(yōu)化前處理及檢測條件,建立了同步提取、同時測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類和四環(huán)素類共八種抗生素的分析方法,在35min內(nèi)完成了對這兩大類八種抗生素的快速分離檢測,具有可操作性強、高效、快速、靈敏度和檢出率高等優(yōu)點。
圖1為本發(fā)明實施例提供的磺胺類和四環(huán)素類抗生素的高效液相色譜分離圖 (10mg/l)(其中SDZ :磺胺嘧啶;SMR :磺胺甲嘧啶;SM2 :磺胺二甲嘧啶;SMZ :磺胺甲惡唑;OTC :土霉素;TC :四環(huán)素;CTC :金霉素;DC :強力霉素)。
圖2為本發(fā)明實施例提供的樣品采樣地點分布圖。
具體實施方式
實施例
(I)樣品前處理
將按環(huán)境監(jiān)測要求布點采集的土壤樣品置于室內(nèi)風(fēng)干后粉碎過60目篩,備用;將污水處理廠采集的脫水污泥以及畜禽養(yǎng)殖場采集的畜禽糞便樣品用錫箔紙包裹,冷凍干燥后保存于_20°C冰柜中,備用。
準(zhǔn)確稱取2g土壤(污泥、糞便)樣品置于25ml玻璃離心瓶中,加入含有10% (質(zhì)量比)CaCl2的提取劑(V甲醇· VEDTA-Mcllcaine緩沖液一丄 I) IOml (其中CaCl2與提取劑的質(zhì)量比為1: 9),依次超聲和振蕩提取各15min,4000r/min離心收集上清液;固體殘渣按上述方法提取2次,合并上清液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至IOml左右;將濃縮液通過事先用6ml甲醇和6ml EDTA-Mcllvaine緩沖液活化的HLB固相萃取小柱,萃取富集;先用6ml高純水淋洗HLB小柱,干抽20min,再用3ml甲醇洗脫HLB小柱,洗脫液流速為lml/min,收集全部洗脫液;洗脫液在40°C水浴下用氮氣吹至近干,用甲醇/水(體積比3 2)溶液定容至lml,溶液過 O. 22 μ m濾 旲后收集于樣品瓶中待測。
所述EDTA-Mcllvaine緩沖液的配置過程為,稱取12. 9g檸檬酸,27. 5gNa2HP04, 37. 2g乙二胺四乙酸二鈉,溶于水中并定容至IL(pH = 4. O)。
(2)色譜條件
采用Waters2695-2696高效液相色譜儀,連接UV檢測器,檢測器波長范圍設(shè)定為 270nm-370nm ;選用 Waters X TerraRP-18 (250 X 4. 6mm, 5 μ m)液相色譜柱;流動相為分別過O. 45 μ m有機膜的乙腈(A)和過水膜的O. Olmo 1/L草酸溶液(B),超聲震蕩IOmin后待用和;柱溫為30°C,流速為1. Oml/min ;梯度洗脫程序見表I ;進(jìn)樣量為20 μ I。八種抗生素的色譜分離圖見圖1。
表1.程序升溫過程
權(quán)利要求
1.一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法,其特征在于1)將預(yù)處理后的樣品加入到含有CaCl2的提取劑中溶解,溶解后依次經(jīng)超聲提取、震蕩提取,而后離心收集上清液,待用;2)將上述收集的上清液通過HLB固相萃取柱分離,萃取富集收集洗脫液,過濾后待用;3)利用高效液相色譜測定上述收集的濾液中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的量;其中,提取劑為按體積比1:1組成的甲醇和EDTA-Mcllvaine緩沖液,CaCl2與提取劑的質(zhì)量比為 I 9;固相萃取洗脫液為甲醇。
2.按權(quán)利要求1所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法,其特征在于所述高效液相色譜條件為流動相由乙腈(A)和O.Olmol/L草酸溶液(B) 組成,柱溫為30°C,流速為l.Oml/min ;進(jìn)樣量為20 μ I。
3.按權(quán)利要求2所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法,其特征在于所述檢測器波長范圍設(shè)定為270nm-370nm;高效液相色譜儀采用 Waters2695-2696,液相色譜柱選用 Waters XTerraRP-18 (250 X 4. 6mm, 5 μ m)。
4.按權(quán)利要求2所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法,其特征在于所述流動相為經(jīng)過0.45μπι有機膜超聲震蕩IOmin后的乙腈(A),經(jīng)O.45 μ m水膜超聲震蕩IOmin后的濃度為O. 01mol/L的草酸溶液(B)。
5.按權(quán)利要求1所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法,其特征在于所述樣品預(yù)處理為將污水處理廠采集的脫水污泥、畜禽養(yǎng)殖場采集的畜禽糞或土壤樣品用錫箔紙包裹,冷凍干燥后于_20°C中保存,備用。
6.按權(quán)利要求1所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法,其特征在于所述步驟I)將2g預(yù)處理后的樣品加入到IOml含有CaCl2的提取劑中溶解,溶解后依次經(jīng)超聲提取、震蕩提取,各15min,而后以4000r/min離心IOmin收集上清液, 沉淀再次溶解在含有CaCl2的提取劑中提取2-3次,收集上清液,合并上述上清液待用。
7.按權(quán)利要求1所述的測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法,其特征在于所述步驟2)將上述收集的上清液通過采用提取劑活化處理后的HLB固相萃取柱分離,先用高純水淋洗HLB小柱,干抽20min,再用3ml甲醇洗脫HLB小柱,洗脫液流速為lml/min,萃取富集收集洗脫液在40°C水浴下用氮氣吹至近干,用體積比3 2的甲醇和水溶液定各,定溶后溶液過0. 22 μ m濾I吳后收集樣品,待測。
全文摘要
本發(fā)明涉及環(huán)境污染技術(shù),具體的說是一種測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的方法。具體為將預(yù)處理后的樣品加入到含有CaCl2的提取劑中溶解,溶解后依次經(jīng)超聲提取、震蕩提取,而后離心收集上清液,待用;將上述收集的上清液通過HLB固相萃取柱分離,萃取富集收集洗脫液,過濾后待用;利用高效液相色譜測定上述收集的濾液中磺胺類及四環(huán)素類抗生素的量;其中,提取劑為按體積比1∶1組成的甲醇和EDTA-Mcllvaine緩沖液;固相萃取洗脫液為甲醇。本發(fā)明通過優(yōu)化前處理及檢測條件,建立了同步提取、同時測定土壤、污泥及動物糞便中磺胺類和四環(huán)素類共八種抗生素的分析方法,在35min內(nèi)完成了對這兩大類八種抗生素的快速分離檢測。
文檔編號G01N30/88GK102998405SQ201110267859
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者安婧, 周啟星, 林琳 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所