專利名稱：DiI 顯微顆粒簡(jiǎn)易制作及其標(biāo)記神經(jīng)元的方法
Dil顯微顆粒簡(jiǎn)易制作及其標(biāo)記神經(jīng)元的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，適用于生理、病理?xiàng)l件下動(dòng)物的離體腦片上特定腦區(qū)神經(jīng)元標(biāo)記，以便對(duì)神經(jīng)元形態(tài)及其變化、神經(jīng)元樹(shù)突棘數(shù)目等進(jìn)行顯微觀察、定性和定量分析。
背景技術(shù)：
以熒光染料標(biāo)記特定腦部位神經(jīng)元，并借助熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡對(duì)這些標(biāo)記的神經(jīng)元進(jìn)行形態(tài)學(xué)定性或樹(shù)突棘的量化研究，對(duì)于分析神經(jīng)元之間聯(lián)系、神經(jīng)信號(hào)處理、神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理都是不可或缺的生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，幾乎所有進(jìn)行神經(jīng)科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室都需要應(yīng)用此類技術(shù)。親脂性羰花青染料(lipophilic carbocyanine dyes)能夠清晰標(biāo)記神經(jīng)元形態(tài)細(xì)節(jié)，是在神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中十分重要而常用的一類熒光示蹤劑。此類熒光染料包括種類較多，具有極強(qiáng)的親脂特性，當(dāng)以合適的技術(shù)給予腦組織后，它們會(huì)接觸到細(xì)胞膜，摻入其中并沿著細(xì)胞膜擴(kuò)散，從而完整地勾勒出細(xì)胞輪廓，達(dá)到標(biāo)記、顯示神經(jīng)元的目的。DiI (英文1,1 ‘ -dioctadecyl-3，3，3 ‘ , 3 ‘ -tetramethy Iindocarbocyanine perchlorate)就是最常用的一種親脂性羰花青染劑。目前，應(yīng)用DiI標(biāo)記神經(jīng)元時(shí)，常采用向組織注射溶液或埋入固體兩種形式進(jìn)行給藥。如果使用注射溶液的方法給藥，則DiI與其它非羰花青類神經(jīng)元示蹤劑在具體給藥技術(shù)和神經(jīng)元標(biāo)記效果等方面沒(méi)有太大差異。但是，當(dāng)將固體DiI埋入活的或固定的離體腦切片后，則該染料可以十分清晰顯示單個(gè)神經(jīng)元形態(tài)，藉此可以對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行動(dòng)態(tài)或靜態(tài)觀察，分析神經(jīng)元樹(shù)突棘的形態(tài)、數(shù)目變化等。 此類技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，在標(biāo)記神經(jīng)元方面具有其它標(biāo)記技術(shù)所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。然而， 該技術(shù)的關(guān)鍵是埋入腦組織中的DiI熒光染料顆粒要盡可能小，只有當(dāng)其大小在數(shù)個(gè)微米的條件下，才可能高清晰的標(biāo)記出單個(gè)神經(jīng)元。如若埋入腦組織的DiI染料顆粒過(guò)大，顯微鏡下只能觀察到以固體染料為中心的波及較大腦組織范圍的超強(qiáng)熒光區(qū)域，根本不能顯示單個(gè)神經(jīng)元形態(tài)。因此，如何得到DiI的顯微顆粒，就成了制約該類實(shí)驗(yàn)成功的瓶頸。目前，醫(yī)藥公司生產(chǎn)的DiI顆粒體積過(guò)大(大者可達(dá)到數(shù)個(gè)毫米大小甚至更大)， 根本不能直接用于以固體顆粒埋入腦組織的方法標(biāo)記單個(gè)神經(jīng)元。為保證DiI的標(biāo)記效果，實(shí)驗(yàn)者只能從購(gòu)買的DiI晶體中(或?qū)①?gòu)買的DiI機(jī)械研磨)于顯微鏡下挑選出盡可能小的晶體顆粒。條件好的實(shí)驗(yàn)室會(huì)自己制作染料“槍彈”。其基本步驟是首先用DiI包裹微米級(jí)的鎢微粒，制成染料的“槍彈”，并裝入專門制作的“基因槍”內(nèi)，再將染料“槍彈”射入特定腦結(jié)構(gòu)內(nèi)，標(biāo)記神經(jīng)元。這一技術(shù)的缺點(diǎn)是“槍彈”制作過(guò)程復(fù)雜、成本高、技術(shù)難度較大并需要“基因槍”。因此，研究人員希望有一種簡(jiǎn)便易行、成本低廉、操作方便的制作DiI 顯微顆粒的技術(shù)并用之高質(zhì)量標(biāo)記神經(jīng)元技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種成本低、便于操作和實(shí)現(xiàn)的DiI顯微顆粒制作方法以及利用這些顆粒高質(zhì)量顯示單個(gè)神經(jīng)元形態(tài)的生物醫(yī)學(xué)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作方法采用如下技術(shù)方案一種DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作方法，包括以下步驟將DiI顆粒溶解于純乙醇或純二甲基亞砜中，形成0. 01 0. lg/mlDil溶液；將DiI溶液加入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液上，析出粒徑3-10微米的DiI顯微顆粒。將DiI溶液分次加入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，一次加入1_5微升。將DiI溶液裝入玻璃微電極中，將玻璃微電極的尖端伸入人工腦脊液或0. lmol/L 磷酸鹽緩沖液中，使用微量注射儀脈沖式一次推入1-5微升DiI溶液。玻璃微電極的尖端內(nèi)徑為50-200微米。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元的方法采用如下技術(shù)方案一種DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元的方法包括以下步驟l)DiI顯微顆粒制作在固定于載玻片上的腦片上滴加人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液，形成人工腦脊液層或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液層；然后，將0. 01 0. lg/ml DiI溶液加入人工腦脊液層或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液層中；DiI溶液會(huì)迅速以薄膜形式漂浮于人工腦脊液層或 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液層上，析出粒徑3-10微米的DiI顯微顆粒；2) DiI顯微顆粒埋入使用尖端封閉的玻璃管微電極，將步驟1)制作好的DiI顆粒壓入腦片的腦組織內(nèi)；然后，以人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液清洗腦片或用軟毛筆輕輕刷拭以去除附在腦片表面的DiI顆粒；所述0. 01 0. lg/ml的DiI溶液為DiI顆粒溶解于純乙醇或純二甲基亞砜中形成。步驟1)中的腦片在滴加人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液前，使用0. 015 0. 02g/ml的多聚甲醛固定液進(jìn)行固定。3)腦片孵育將埋入DiI顆粒的腦片避光存放于0.01 0.02g/ml多聚甲醛固定液中，于37°C 烘箱或室溫下孵育1-4天。步驟1)形成的人工腦脊液層或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液層的厚度為200-500微米。步驟1)中將0. 01 0. lg/ml DiI溶液分次加入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，一次加入1-5微升。步驟1)中通過(guò)將0. 01 0. lg/ml的DiI溶液裝入玻璃微電極中，將玻璃微電極的尖端伸入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，使用微量注射儀脈沖式一次推入1-5 微升的DiI溶液。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作及其標(biāo)記神經(jīng)元的方法，通過(guò)將購(gòu)買得到的大顆粒的DiI顆粒溶于純乙醇或純二甲基亞砜中形成質(zhì)量體積濃度為0.01 0. lg/ml DiI溶液，然后將DiI溶液滴入與乙醇或二甲基亞砜互不相溶的人工腦脊液或磷酸鹽緩沖液中，使DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工腦脊液或磷酸鹽緩沖液上，并向四周移動(dòng)、擴(kuò)散析出細(xì)小的DiI顯微顆粒，該方法操作簡(jiǎn)單、成本低；本發(fā)明的關(guān)鍵在于控制DiI溶液的濃度和滴入人工腦脊液或磷酸鹽緩沖液中體積來(lái)控制析出的DiI顯微顆粒的粒徑在3-10微米，以方便進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)記；在腦片上形成的人工腦脊液層或磷酸鹽緩沖液層的厚度控制在200-500微米，可以使形成的DiI顯微顆粒附著于腦組織表面，不會(huì)因?yàn)槿斯つX脊液層或磷酸鹽緩沖液層厚度過(guò)大，隨著內(nèi)部液體的流動(dòng)被帶到不需要標(biāo)記的腦組織部位。

圖1為振動(dòng)切片機(jī)切取的活或固定的離體腦片示意圖。圖2為離體腦片平鋪置于載玻片上的示意圖。圖3顯示離體腦片上覆蓋一層aCSF液體或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液，預(yù)先裝好 DiI溶液的玻璃微電極尖端置于aCSF液體或磷酸鹽緩沖液中，迅速排出少量液體，并產(chǎn)生微小DiI顆粒。圖4顯示封閉的玻璃微電極尖端將DiI微顆粒壓入離體腦片內(nèi)。
具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。請(qǐng)參閱圖1至圖4所示，DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元方法包括4個(gè)步驟，即腦片制作、 DiI顆粒制作、DiI顆粒埋入和腦片孵育。(1)腦片制作。用以標(biāo)記神經(jīng)元的腦片可以是活或固定的腦片，分別參照腦片膜片鉗或免疫組織化學(xué)腦片制作技術(shù)進(jìn)行。兩種腦片均必需以振動(dòng)切片機(jī)切片，片厚200-350微米?；畹哪X片切下后于通氧的人工腦脊液(arificial cerebrospinal fluid，aCSF)孵育，而固定的離體腦片則放于質(zhì)量體積濃度為0. 015 0. 02g/ml的多聚甲醛固定液中。顯微顆粒制作。對(duì)于已經(jīng)固定的腦片1，將切好的腦片1平放于載玻片2上，并在其上滴加少量人工腦脊液3(或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液)，滴加的液體量以浸沒(méi)整個(gè)腦片為準(zhǔn)。然后，快速傾斜載玻片以傾去腦片上的人工腦脊液(或磷酸鹽緩沖液)，或用吸水紙?jiān)谀X片邊緣吸去多余的液體，使腦片上覆蓋一薄層O00-500微米后)液體即可(腦片上不能有肉眼可見(jiàn)的流動(dòng)液體)。最后，在體視顯微鏡或倒置顯微鏡下，將事先注入質(zhì)量體積濃度為0. 01 0. lg/ml DiI溶液(以純乙醇或純二甲基亞砜DMSO作溶劑，0.01 0. Ig DiI顆粒溶于 Iml純乙醇或純二甲基亞砜DMSO中；濃度可以依據(jù)具體情況調(diào)節(jié)，濃度愈高形成的顆粒體積愈大)的玻璃微電極4的(尖端內(nèi)徑50-200微米)尖端貼近“靶”神經(jīng)元所在腦部位的切片表面，但不進(jìn)入該部位的腦片組織，在電極尖端達(dá)到目的位置后，立即用微量注射儀 (picospritzer)脈沖式推出1_5微升DiI溶液，由于遇到不相溶的液體，此時(shí)DiI溶液會(huì)迅速以薄膜形式漂浮于人工腦脊液(或磷酸鹽緩沖液)上，并向四周移動(dòng)、擴(kuò)散形成粒徑3-10 微米的DiI顯微顆粒。至此，DiI顯微顆粒便制作成功。根據(jù)標(biāo)記的面積，可以通過(guò)微量注射儀重復(fù)分次注入1-5微升DiI溶液，以形成足夠多的DiI晶體顆粒。如果沒(méi)有微量注射儀，也可用其它方法使DiI溶液從電極內(nèi)流出(比如用電極蘸取一點(diǎn)DiI溶液(1-5微升)， 然后迅速將電極尖端放置在“靶”神經(jīng)元所在腦部位，DiI溶液會(huì)靠重力和擴(kuò)散作用，離開(kāi)電極并形成DiI晶體顆粒)。對(duì)于活的腦片，可將腦片置于小培養(yǎng)皿中，并加入已通氧的aCSF 液體使其剛好沒(méi)過(guò)腦片，然后依照上述方法制作DiI顯微顆粒。(3) DiI顯微顆粒埋入。預(yù)先拉制好尖端直徑為20-50微米左右的玻璃管微電極5，并將電極尖端以高溫加熱封閉。體視顯微鏡或倒置顯微鏡下定位要標(biāo)記的神經(jīng)元所在的腦部位，選擇位于靶區(qū)域表面的DiI顆粒，以電極尖端輕輕觸壓，將其埋入腦組織內(nèi)。最后，以aCSF或0. lmol/L 磷酸鹽緩沖液清洗腦片或用軟毛筆輕輕刷拭以去除附在腦片表面的DiI顆粒。(4)將含DiI的活腦片浸于通氧的aCSF (活腦片)中避光孵育1天，然后浸于質(zhì)量體積濃度為0.01 0.02g/ml多聚甲醛固定液中2小時(shí)后，裱片觀察。如為固定液固定的腦片，則直接將埋入DiI顆粒的腦片避光存放于質(zhì)量體積濃度為0. 01 0. 02g/ml多聚甲醛固定液中，于37°C烘箱或室溫下孵育1-4天，而后裱片并于激光共聚焦顯微鏡下觀察。本發(fā)明中單獨(dú)制作DiI顯微顆粒，可以將質(zhì)量體積濃度為0. 01 0. lg/ml DiI溶液(以純乙醇或純二甲基亞砜作溶劑)滴入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，每次滴入1-5微升，DiI溶液迅速向四周移動(dòng)、擴(kuò)散析出粒徑3-10的DiI顯微顆粒。
權(quán)利要求
1.一種DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作方法，其特征在于，包括以下步驟將DiI顆粒溶解于純乙醇或純二甲基亞砜中，形成0. 01 0. lg/ml DiI溶液；將DiI溶液加入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液上，析出粒徑3-10微米的DiI顯微顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的一種DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作方法，其特征在于，將DiI溶液分次加入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，一次加入1-5微升。
3.如權(quán)利要求2所述的一種DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作方法，其特征在于，將DiI溶液裝入玻璃微電極中，將玻璃微電極的尖端伸入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，使用微量注射儀脈沖式一次推入1-5微升DiI溶液。
4.如權(quán)利要求3所述的一種DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作方法，其特征在于，玻璃微電極的尖端內(nèi)徑為50-200微米。
5.一種DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元的方法，其特征在于，包括以下步驟1)DiI顯微顆粒制作在固定于載玻片上的腦片上滴加人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液，形成人工腦脊液層或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液層；然后，將0. 01 0. lg/ml DiI溶液加入人工腦脊液層或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液層中；DiI溶液會(huì)迅速以薄膜形式漂浮于人工腦脊液層或 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液層上，析出粒徑3-10微米的DiI顯微顆粒；2)DiI顯微顆粒埋入使用尖端封閉的玻璃管微電極，將步驟1)制作好的DiI顆粒壓入腦片的腦組織內(nèi)；然后，以人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液清洗腦片或用軟毛筆輕輕刷拭以去除附在腦片表面的DiI顆粒；所述0. 01 0. lg/ml的DiI溶液為DiI顆粒溶解于純乙醇或純二甲基亞砜中形成。
6.如權(quán)利要求5所述的一種DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元的方法，其特征在于，步驟1)中的腦片在滴加人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液前，使用0. 015 0. 02g/ml的多聚甲醛固定液進(jìn)行固定。
7.如權(quán)利要求5所述的一種DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元的方法，其特征在于，還包括以下步驟3)腦片孵育將埋入DiI顆粒的腦片避光存放于0. 01 0. 02g/ml多聚甲醛固定液中，于37°C烘箱或室溫下孵育1-4天。
8.如權(quán)利要求5所述的一種DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元的方法，其特征在于，步驟1)形成的人工腦脊液層或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液層的厚度為200-500微米。
9.如權(quán)利要求5所述的一種DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元的方法，其特征在于，步驟1)中將0. 01 0. lg/ml DiI溶液分次加入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，一次加入 1-5微升。
10.如權(quán)利要求9所述的一種DiI顯微顆粒標(biāo)記神經(jīng)元的方法，其特征在于，步驟1)中通過(guò)將0. 01 0. lg/ml的DiI溶液裝入玻璃微電極中，將玻璃微電極的尖端伸入人工腦脊液或0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，使用微量注射儀脈沖式一次推入1-5微升的DiI溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作及其標(biāo)記神經(jīng)元的方法，其中DiI顯微顆粒簡(jiǎn)易制作方法包括以下步驟將DiI顆粒溶解于純乙醇或二甲基亞砜中，形成質(zhì)量體積濃度為0.01～0.1g/ml DiI溶液；將0.01～0.1g/ml DiI溶液加入人工腦脊液或0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中；DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工腦脊液或磷酸鹽緩沖液上，并向四周移動(dòng)、擴(kuò)散，析出粒徑為3-10微米的DiI顯微顆粒。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，成本低。
文檔編號(hào)G01N21/84GK102408756SQ20111022134
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者張富興, 李云慶 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)