專利名稱：一種海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋生物能源領(lǐng)域，具體涉及一種海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法。
背景技術(shù)：
微藻光合利用效率高、個體小、營養(yǎng)豐富、生長繁殖迅速、對環(huán)境的適應(yīng)能力強、容易培養(yǎng)、不占用農(nóng)業(yè)耕地，許多國家先后進行了微藻培養(yǎng)、營養(yǎng)價值分析及開發(fā)利用研究， 取得了許多成就和進展。特別是近幾年，利用海洋微藻進行生物質(zhì)能源的開發(fā)與應(yīng)用吸引了許多研究者的重視。微藻細胞內(nèi)的淀粉可以通過降解、發(fā)酵，最終轉(zhuǎn)化為能被直接利用的能源，對此首先需要解決的一個重要問題是如何篩選富含淀粉的微藻以及如何通過優(yōu)化培養(yǎng)微藻提高淀粉含量，其中淀粉含量的準確測定則是關(guān)鍵。目前，關(guān)于海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法未見報道?，F(xiàn)有陸生植物中淀粉含量的測定方法主要歸納為碘直接顯色法和還原糖間接測定法兩大類。前者主要采用水作為淀粉提取劑，淀粉提取不徹底，干擾物質(zhì)難以去除；后者國際上瑞典人J. Holm提出的快速分析測定淀粉的方法[1]，方法精準，但實驗過程中樣品需要先后經(jīng)過α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶處理，三種酶國內(nèi)難以同時購得，且價格昂貴。國內(nèi)多采用蒽酮比色法和酶水解法(GB 5009. 9-85)，均是先將植物體內(nèi)淀粉提取轉(zhuǎn)化為還原糖，再通過定量測定還原糖含量間接計算淀粉含量，由于植物體內(nèi)本身固有的還原糖不易除盡影響結(jié)果準確性，實驗周期長、程序繁雜，這些不利因素給實驗室分析操作帶來諸多不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于提供一種用于靈敏、快速、準確地實現(xiàn)微藻胞內(nèi)淀粉提取及含量測定的技術(shù)方案。本發(fā)明所述的海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法包括如下具體步驟a.將待測微藻樣品在3000 3500rpm離心3 8min得到微藻藻泥，用去離子水反復清洗3遍，以達到去除反應(yīng)體系雜質(zhì)的同時改變細胞內(nèi)外的滲透壓的目的；b.將步驟a所得的微藻藻泥反復凍融4 6次后，超聲處理10 20min，使微藻細胞充分破碎，同時準確稱重并記錄質(zhì)量；c.將步驟b所得的微藻藻泥與無水乙醇混合，振蕩:3min后，3000 3500rpm離心 3 8min，收集沉淀；所述無水乙醇與步驟b中微藻藻泥的比例為6ml Ig ；d.向步驟c所得沉淀中加入沸程為60 90°C的石油醚，混合振蕩5min后，繼續(xù)加入90%乙醇，再混合振蕩5min，在3000 3500rpm離心3 8min并收集沉淀；所述石油醚與步驟b中微藻藻泥的比例為細1 lg，所述乙醇與步驟b中微藻藻泥的比例為6ml lg；e.重復步驟d三次；f.向步驟e所得沉淀中加入0. 6 0. 8g/ml的硝酸鈣溶液，煮沸10 30min后， 以充分提取微藻細胞內(nèi)的淀粉，冷卻至室溫；所述的硝酸鈣溶液與步驟b中微藻藻泥的比例為 IOml Ig ；g.向步驟f所得溶液中加入30%的過氧化氫，振蕩反應(yīng)20min后，加入0.05mol/L 鹽酸，煮沸20min后冷卻至室溫；以消除殘?zhí)堑冗€原性物質(zhì)及脫色并趕出殘留過氧化氫。所述30%過氧化氫的體積、0.05mol/L鹽酸的體積與步驟b中微藻藻泥的比例均為aiil Ig ；h.步驟g所得溶液經(jīng)過3000 3500rpm離心3 8min，收集上清液，沉淀再以f 步驟重復處理3 5次，合并所有上清液作為待測樣品溶液；i.步驟h所得的待測樣品溶液，與I2-KI標準溶液進行顯色反應(yīng)，于570nm波長下測定其吸光度值，利用淀粉標準曲線計算待測樣品溶液中的淀粉含量。對于上述海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法，其中所述的步驟f中加入硝酸鈣溶液的濃度，優(yōu)選的為0. 8g/ml ；所述的步驟h中重復處理的次數(shù)，優(yōu)選的為3次。本發(fā)明的上述技術(shù)方案針對海洋微藻細胞的物質(zhì)組成特點，首先采用無水乙醇、 石油醚、90%乙醇對微藻細胞依次進行脫脂、脫色及脫糖處理，進而采用0. 6 0. 8g/ml的硝酸鈣溶液作為微藻細胞內(nèi)淀粉的提取劑，煮沸15 30min以充分提取微藻細胞內(nèi)的淀粉，再采用過氧化氫氧化殘余還原糖和消除殘留色素并煮沸趕出過量的過氧化氫，最后以碘作為顯色劑，利用分光光度法直接測定海洋微藻中的淀粉含量，其吸光值是直接以水為提取劑時的1. 3 1. 4倍，結(jié)果具有更好的準確性。本發(fā)明所述的上述方法中，淀粉標準曲線的繪制方法是本領(lǐng)域所公知的現(xiàn)有技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所能獲得的條件來確定最適合的制備標準曲線的方案。無論以何種方法制備標準曲線，須嚴格地在同等條件下檢測待測樣品并計算其淀粉含量。本發(fā)明的具體實施方式
中，申請人采用以下方法制備淀粉標準曲線取不同體積的0. lg/L淀粉標準溶液，分別以與步驟f相同濃度的硝酸鈣溶液補充至相同體積，然后以相同體積的 0. 01mol/L I2-KI標準溶液顯色后于570nm波長下分別測定其吸光度值，最后以吸光度值對所取用淀粉標準溶液體積作圖得標準曲線。本方法針對海洋微藻細胞的物質(zhì)組成特點，在對海洋微藻進行簡單預(yù)處理之后， 以碘作為顯色劑，利用分光光度法直接測定海洋微藻中的淀粉含量，建立了直接定量測定海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的方法，與常用的陸生植物中淀粉含量的測定方法相比，過程簡單，實驗周期短，顯色穩(wěn)定時間長，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好。


本發(fā)明附圖1幅，即本發(fā)明實施例中制備的標準曲線。
具體實施例方式
下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得，或可以常規(guī)方法制備?？扇苄缘矸郏治黾?，購自國藥集團化學試劑有限公司；本發(fā)明涉及的海洋微藻均分離自渤海灣海域。
實施例1(一 )淀粉標準曲線的繪制準確稱取0. IOg左右的分析純淀粉，溶解于煮沸的去離子水中，冷卻后定容至IL 容量瓶，制備成淀粉標準溶液；再量取不同體積的該淀粉標準溶液，分別用0. 8g/mL硝酸鈣溶液補充至4ml，加0. 15mL 0. 01mol/L I2-KI標準溶液，搖勻，利用T6新世紀紫外可見分光光度計于570nm波長下分別測定其吸光度值，以的0. 8g/mL硝酸鈣溶液加0. 15mL 0. 01mol/L I2-KI標準溶液作為空白，結(jié)果見下表1，以吸光度對淀粉標準溶液體積作圖，見附圖1。表1不同體積標準淀粉溶液的吸光度值
權(quán)利要求
1. 一種海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法，其特征在于包括如下步驟a.將待測微藻樣品在3000 3500rpm離心3 8min得到微藻藻泥，用去離子水反復清洗3遍；b.將步驟a所得的微藻藻泥反復凍融4 6次后，超聲處理10 20min，準確稱重并記錄質(zhì)量；c.將步驟b所得的微藻藻泥與無水乙醇混合，振蕩:3min后，3000 3500rpm離心3 8min,收集沉淀；所述無水乙醇與步驟b中微藻藻泥的比例為6ml Ig ；d.向步驟c所得沉淀中加入沸程為60 90°C的石油醚，混合振蕩5min后，繼續(xù)加入 90%乙醇，再混合振蕩5min，在3000 3500rpm離心3 8min并收集沉淀；所述石油醚與步驟b中微藻藻泥的比例為細1 lg，所述乙醇與步驟b中微藻藻泥的比例為6ml lg；e.將步驟d重復三次；f.向步驟e所得沉淀中加入0.6 0. 8g/ml的硝酸鈣溶液，煮沸10 30min后冷卻至室溫；所述的硝酸鈣溶液與步驟b中微藻藻泥的比例為IOml Ig;g.向步驟f所得溶液中加入30%的過氧化氫，振蕩反應(yīng)20min后，加入0.05mol/L鹽酸，煮沸20min后冷卻至室溫；所述30%過氧化氫的體積、0. 05mol/L鹽酸的體積與步驟b 中微藻藻泥的比例均為anl Ig;h.步驟g所得溶液經(jīng)過3000 3500rpm離心3 8min，收集上清液，沉淀再以f步驟重復處理3 5次，合并所有上清液作為待測樣品溶液；1.步驟h所得的待測樣品溶液，與I2-KI標準溶液進行顯色反應(yīng)，于570nm波長下測定其吸光度值，利用淀粉標準曲線計算待測樣品溶液中的淀粉含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法，其特征在于所述的步驟f中加入硝酸鈣溶液的濃度為0. 8g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法，其特征在于所述的步驟h中重復處理的次數(shù)為3次。
全文摘要
一種海洋微藻細胞內(nèi)淀粉含量的測定方法。本發(fā)明針對海洋微藻細胞的物質(zhì)組成特點，首先采用乙醇、石油醚、90％乙醇對微藻細胞依次進行脫脂、脫色及脫糖處理，再采用0.6～0.8g/ml的硝酸鈣溶液作為微藻細胞內(nèi)淀粉的提取劑，煮沸15～30min以充分提取微藻細胞內(nèi)的淀粉，其次采用過氧化氫氧化殘余還原糖和殘留色素并煮沸趕出過量的過氧化氫，最后以碘作為顯色劑，利用分光光度法直接測定海洋微藻中的淀粉含量。該申請技術(shù)與常用的陸生植物中淀粉含量的測定方法相比，過程簡單，實驗周期短，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好。
文檔編號G01N1/28GK102323261SQ20111021863
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者于媛, 孟迎迎, 徐嬪, 楊海波 申請人:大連大學