專利名稱：一種鑒別和評(píng)價(jià)川貝母的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材川貝母的鑒別和評(píng)價(jià)方法。
背景技術(shù)：
川貝母味甘，間有微苦，有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳的功效，主治肺熱燥咳、咯痰帶血、 痰多胸悶等癥[1]。目前發(fā)現(xiàn)的貝母屬植物有60種、45變種和5變型。2005版藥典收載的川貝母的四個(gè)基源種為百合科植物卷葉貝母(川貝母)Fri. tillaria cirrhosa、暗紫貝母代 ffi i^raiaia、甘肅貝母/^ przewalskii和梭砂貝母/^ deIavayi的干燥鱗莖[2]。前三者按性狀不同分別習(xí)稱“松貝”和“青貝”，后者習(xí)稱“爐貝”。從植物來(lái)源考察[3]，卷葉貝母主產(chǎn)四川、西藏、云南等省區(qū)；暗紫貝母主產(chǎn)四川阿壩藏族自治州、青海；四川若爾蓋、小金、 南川等縣有少量栽培；甘肅貝母(又稱岷貝)主產(chǎn)甘肅、青海、云南、四川等??；梭砂貝母主產(chǎn)云南、四川、青海、西藏等省區(qū)，生于海拔3000m-4700m的流砂灘上的巖石縫隙中。從藥材規(guī)格看，松貝植物種源主要為川貝母，品質(zhì)最優(yōu)；青貝植物種源主要為暗紫貝母，品質(zhì)亦優(yōu)； 爐貝一般來(lái)源植物為梭砂貝母，品質(zhì)次于松貝、青貝。由于川貝母顯著的清熱潤(rùn)肺、化痰止咳之功效在臨床上廣泛應(yīng)用。但產(chǎn)量小，用量大，市場(chǎng)供不應(yīng)求，導(dǎo)致市場(chǎng)價(jià)格不斷上漲，因而各地相繼出現(xiàn)了一些偽品。同時(shí)川貝母本身存在的相互混用，亂代亂用現(xiàn)象嚴(yán)重。據(jù)調(diào)查[4]，除藥典收載品種外，尚有許多該屬其它植物的鱗莖在不同地區(qū)作“川貝母”使用。它們科屬接近，外形有相似之處，且貝母屬植物代謝產(chǎn)物的共同特征是均存在異留體生物堿，化學(xué)成分類同。因此，如何鑒別不同種類的貝母類藥材商品已成為中藥鑒定中的難點(diǎn)之一。目前對(duì)川貝母的真?zhèn)舞b別方法很多，如陳俊華等[5]對(duì)正品川貝和偽品的外觀形性和粉末特征進(jìn)行討論。程存歸等[6]采用傅里葉變換紅外光譜法直接測(cè)定植物中藥材的紅外光譜，對(duì)川貝母、浙貝母和東貝母進(jìn)行區(qū)別鑒定，發(fā)現(xiàn)其紅外光譜差異較大。孟燕等[7]對(duì)川貝母的易混品小平貝廠ritillaria ussuriensis的鱗莖進(jìn)行了藥材性狀、顯微特征及薄層色譜鑒別研究，并與松貝、平貝做了比較。張平等M用火焰原子吸收分光光度法(FAAS 法)對(duì)湖北貝母、浙貝母與川貝母三種貝母中的8種無(wú)機(jī)元素含量進(jìn)行了測(cè)定比較。余華等 [9]利用高效液相色譜法，對(duì)四個(gè)基源種的川貝母的共有有效成分貝母辛為指標(biāo)進(jìn)行定量分析，以達(dá)到建立控制川貝母質(zhì)量的定量方法。馬利瓊等[1°]采用雙相滴定法測(cè)定了中國(guó)藥典收載的四基源種17個(gè)不同產(chǎn)地的川貝母生物堿的含量，測(cè)得17個(gè)不同產(chǎn)地的川貝母中總生物堿的含量以川貝母較高，暗紫貝母偏低(川貝母的含量為0.08 %，暗紫貝母為0.04 %， 梭砂貝母為0.07 %，甘肅貝母為0.05 %)。還有很多關(guān)于川貝母鑒別與質(zhì)量控制研究的相關(guān)文章，但這些研究方法不外乎就是生藥性狀鑒別、顯微結(jié)構(gòu)鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒別、 高效液相法測(cè)定其生物堿含量等等。這些方法并不能完全達(dá)到區(qū)別不同來(lái)源藥材的目的。 本發(fā)明采集了主產(chǎn)區(qū)四個(gè)基源種的川貝母，采用1H-NMR結(jié)合模式識(shí)別(PR)法對(duì)這四基源種川貝母樣本進(jìn)行了研究，并嘗試建立川貝母的預(yù)測(cè)模型，然后以市場(chǎng)上流通的川貝母樣本商品作為測(cè)試集樣本對(duì)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示1H-NMR-I^R法能有效地鑒別四個(gè)基源種川貝母。所建立的預(yù)測(cè)模型也能很好地對(duì)市場(chǎng)上流通的川貝母樣本進(jìn)行快速分類鑒別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新的中藥材川貝母的鑒別和評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明所指的中藥材川貝母是《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版中規(guī)定的四種基源的川貝母。本發(fā)明所指的評(píng)價(jià)指標(biāo)是川貝母的整體化學(xué)成分的變化規(guī)律。本發(fā)明所用的測(cè)定技術(shù)是氫核磁共振技術(shù)。本發(fā)明所指的數(shù)據(jù)處理方法是主成分分析和最小偏二乘法。本發(fā)明涉及中藥材川貝母樣品采集、處理，氫核磁共振測(cè)定、數(shù)據(jù)處理和分析以及結(jié)果判斷方式由下述方式完成。1.川貝母樣品采集
四種基源的川貝母樣品為在野外采集，并按藥典和傳統(tǒng)的植物鑒定方式進(jìn)行鑒定，分別為
卷葉貝母:Fritillaria cirrhosa 甘肅貝母:Fritillaria przewalskii 梭砂貝母Fritillaria deIavayi 暗紫貝母Fritillaria unibratata 2.樣品的預(yù)處理
稱取研碎的川貝母樣品(過(guò)80目篩)約1.2g，加入甲醇15ml，稱重，于55°C水浴回流 90min ；再稱重，并補(bǔ)足至水浴前的重量，過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液10ml，減壓濃縮至干， 真空干燥30分鐘；殘?jiān)?. 05ml DMS0-d6溶解，轉(zhuǎn)入f 5mm核磁管，即得供1H-NMR譜測(cè)定的樣品溶液。3.氫核磁共振測(cè)定
1H-NMR的測(cè)定條件恒溫在296K，以DMS0_d6作為內(nèi)鎖，掃描1 次，采樣時(shí)間域?yàn)?4 k，譜寬為12335. 526 Hz，采樣時(shí)間為2. 66 s，脈沖間隔Dl為3. 00 s，采用標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)飽和脈沖序列(zgpr)壓制水峰信號(hào)，采用CPMG脈沖序列抑制大分子信號(hào)。獲得自由衰減信號(hào)(FID 信號(hào))。FID信號(hào)經(jīng)過(guò)傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。以TMS信號(hào)峰為內(nèi)標(biāo)0點(diǎn)調(diào)整化學(xué)位移值，即獲得各樣品相應(yīng)的1H-NMR圖譜。以每0. 05化學(xué)位移值單位對(duì)各樣品1H-NMR圖譜分為200段，并分別進(jìn)行積分，即得到每個(gè)樣本的各化學(xué)位移值段與相對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰面積積分值。以樣品為橫坐標(biāo)，積分值為縱坐標(biāo)，構(gòu)成數(shù)據(jù)矩陣。4.數(shù)據(jù)處理和分析
將數(shù)據(jù)矩陣中的各組數(shù)據(jù)，按統(tǒng)一方式進(jìn)行歸一化處理，然后導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，啟動(dòng)主成分分析模式進(jìn)行分析。5.結(jié)果判斷方式
將獲得的各主成分分別為橫縱坐標(biāo)進(jìn)行二維圖形制作。將已明確鑒定的川貝母樣品在二維圖形中的分布點(diǎn)區(qū)域劃定為鑒別基本區(qū)域。將未知川貝母樣品與上述與基本區(qū)域樣品點(diǎn)進(jìn)行比較，如未知川貝母樣品處于基本區(qū)域內(nèi)，則判斷該未知川貝母樣品為藥典允許使用的川貝母；如如未知川貝母樣品處于基本區(qū)域外，則判斷該未知川貝母樣品為藥典非允許使用的川貝母。


圖1是實(shí)施例1中卷葉貝母的1H-NMR圖示。圖2是實(shí)施例1中暗紫貝母的1H-NMR圖示。圖3是實(shí)施例1中甘肅貝母的1H-NMR圖示。圖4是實(shí)施例1中梭砂貝母的1H-NMR圖示。圖5是實(shí)施例1四種基源川貝母的1H-NMR-PCA分析結(jié)果圖示。圖6是實(shí)施例1未知川貝母樣品與四種基源川貝母的1H-NMR-PCA分析結(jié)果圖示。
具體實(shí)施方式
實(shí)施方式1:
用來(lái)源于青海西寧、瑪沁的暗紫貝母，青海貴德、青海西寧、甘孜州爐霍的甘肅貝母，四川康定縣的卷葉貝母以及來(lái)源于四川滬定縣的梭砂貝母各6各樣品為對(duì)象，分別稱取研碎的川貝母樣品(過(guò)80目篩)約1.2g，加入甲醇15ml，稱重，于55°C水浴回流90min ；再稱重， 并補(bǔ)足至水浴前的重量，過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液10ml，減壓濃縮至干，真空干燥30分鐘；殘?jiān)?. 05ml DMS0-d6溶解，轉(zhuǎn)入f5mm核磁管，即得供1H-NMR譜測(cè)定的樣品溶液。在恒溫在296K，以DMS0-d6作為內(nèi)鎖，掃描1 次，采樣時(shí)間域?yàn)?4 k，譜寬為 12335.526 Hz，采樣時(shí)間為2. 66 s，脈沖間隔Dl為3. 00 s，采用標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)飽和脈沖序列 (zgpr)壓制水峰信號(hào)，采用CPMG脈沖序列抑制大分子信號(hào)的條件下，在Bruker AV 11-600 核磁共振儀進(jìn)行測(cè)定，獲得自由衰減信號(hào)(FID信號(hào))。FID信號(hào)經(jīng)過(guò)傅立葉變換轉(zhuǎn)換，以TMS 信號(hào)峰為內(nèi)標(biāo)0點(diǎn)調(diào)整化學(xué)位移值，即獲得各樣品相應(yīng)的1H-NMR圖譜(圖1-圖4)。以每 0. 05化學(xué)位移值單位對(duì)各樣品1H-NMR圖譜分為200段，并分別進(jìn)行積分，即得到每個(gè)樣本的各化學(xué)位移值段與相對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰面積積分值。以樣品為橫坐標(biāo)，積分值為縱坐標(biāo)，構(gòu)成數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SMCA-P軟件，啟動(dòng)主成分分析程序，提取主成分，以主成分2 (PC2)和主成分1 (PCl)的得分值為橫縱坐標(biāo)繪制的得分散點(diǎn)圖(圖5)。將四種川貝母樣品所處的區(qū)域定位基本區(qū)域。將來(lái)源于中藥市場(chǎng)和各藥房的17個(gè)川貝母樣品(wzl-17)，按相同方式進(jìn)行提取、 測(cè)定、圖譜和數(shù)據(jù)處理后，將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件，以主成分2 (PC2)和主成分1 (PCl)的得分值為橫縱坐標(biāo)繪制的得分散點(diǎn)圖并與四種川貝母樣品所處的區(qū)域定位基本區(qū)域進(jìn)行比較(圖6)。未知川貝母樣品中wz2、wz9、wzll、wzl3、wzl4、wzl5、wzl6、wzl7樣品處于基本區(qū)域，則判斷這些樣品為藥典允許使用的川貝母；而wzl、wz3、wz5、wz6、wz7、wz8、wzl0和wzl2 則處于基本區(qū)域外，則判斷為藥非典允許使用品種。
權(quán)利要求
1.一種鑒別和評(píng)價(jià)川貝母的新方法，其內(nèi)容包括(1)川貝母；(2)川貝母樣品預(yù)處理； (3)川貝母樣品測(cè)定方法；(4)數(shù)據(jù)處理和分析；(5)數(shù)據(jù)庫(kù)建立；(6)鑒別和評(píng)價(jià)等部分。
2.如權(quán)利要求1中所述的(1)川貝母，川貝母指以《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版中川貝母項(xiàng)下所規(guī)定合法藥用的四種川貝母(卷葉貝母、暗紫貝母、甘肅貝母和梭砂貝母)。
3.如權(quán)利要求1中所述的(2)川貝母樣品預(yù)處理，川貝母樣品預(yù)處理指的是根據(jù)權(quán)利要求1中所述的(1)川貝母的物理性狀，相應(yīng)地采取的、以適應(yīng)測(cè)定方法需要的粉碎、提取、 濃縮、干燥、凍干、溶解等方法。
4.如權(quán)利要求1中所述的(3)測(cè)定方法，指的是本發(fā)明中的氫核磁共振法，所用儀器的兆周數(shù)一般應(yīng)在400兆周GOOMHz)以上。
5.如權(quán)利要求1中所述的(4)數(shù)據(jù)處理和分析，可以是本發(fā)明中的主成分分析法，也可以是PLS法，PLS-DA法，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法或者是采用各種數(shù)據(jù)過(guò)濾后的分析法。
6.如權(quán)利要求1中所述的(5)鑒別和評(píng)價(jià)方法，主要是以一定數(shù)量的川貝母樣品經(jīng)上述的預(yù)處理、測(cè)定、數(shù)據(jù)處理后獲得的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，構(gòu)成產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫(kù)，以此數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)川貝母樣品進(jìn)行鑒別和評(píng)價(jià)；如新的川貝母按相同的方法獲得的數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)比較，兩者一致，則判該川貝母樣品為藥典允許使用品種；如兩者不一致，則判該川貝母樣品為非藥典允許使用品種。
全文摘要
本發(fā)明涉及川貝母的鑒別和評(píng)價(jià)方法。以四種藥典允許使用的川貝母為對(duì)象，以這四種川貝母的總提取物為分析對(duì)象，以1H-NMR為檢測(cè)手段，采用主成分分析或最小偏二乘法為數(shù)據(jù)處理方法，以正四種川貝母的總提取物的1H-NMR數(shù)據(jù)為基本，判斷未知川貝母樣品是否屬于藥典允許使用范圍內(nèi)的川貝母樣品的方法。
文檔編號(hào)G01N24/08GK102175707SQ201110048610
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者冉堅(jiān), 劉淼, 羅喬奇, 譚小燕, 黃靜 申請(qǐng)人:四川大學(xué)