專利名稱：一種同時(shí)檢測(cè)蘋果中五種多酚并進(jìn)行品種識(shí)別的hplc方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蘋果中五種多酚的檢測(cè)方法，特別涉及利用多酚檢測(cè)含量進(jìn)行不同品種的識(shí)別方法的建立。
背景技術(shù)：
多酚類物質(zhì)是具有苯環(huán)并結(jié)合有多個(gè)羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)總稱，包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等。一般作為生長(zhǎng)代謝中的次生產(chǎn)物，廣泛存在于植物的組織中，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和調(diào)節(jié)，基因的誘導(dǎo)表達(dá)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，紫外輻射的吸收，生物固氮以及果蔬加工過(guò)程中風(fēng)味的形成，顏色變化(如褐變)，果蔬飲料的混濁與沉淀，等都有一定的影響。其中，沒(méi)食子酸，綠原酸，咖啡酸，原兒茶酸和蘆丁是植物中廣泛存在的五種多酚，以其抗病毒，抗癌癥等藥理特性越來(lái)越受到中外學(xué)者的關(guān)注。這五種化合物的結(jié)構(gòu)式如下所
不
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測(cè)蘋果中五種多酚的HPLC方法，其特征是，包括以下步驟(1)蘋果的前處理將蘋果去核，加入足量的抗壞血酸水溶液，用榨汁機(jī)粉碎后采用超聲、氮?dú)獗Ｗo(hù)或加熱方法防止褐變；(2)多酚物質(zhì)的提取采用甲醇-水溶液或乙酸乙酯提取，所述甲醇-水溶液提取為稱取粉碎好的蘋果樣品，加入甲醇-水溶液，渦旋震蕩后超聲；離心，將上清液過(guò)濾至燒瓶，然后重復(fù)萃取一次， 合并上清液；取上清液過(guò)0. 45 μ m的濾膜，然后用HPLC檢測(cè)；所述乙酸乙酯提取為稱取粉碎好的蘋果樣品，加入乙酸乙酯，渦旋震蕩后超聲；離心，將上清液過(guò)濾至燒瓶，然后重復(fù)萃取一次，合并上清液；旋轉(zhuǎn)蒸干后用乙腈定容，然后用HPLC檢測(cè)；(3)五種多酚的同時(shí)檢測(cè)HPLC-DAD檢測(cè)色譜柱=Atlantis C18，規(guī)格為5 μ m, 250mmX 4. 5mm，選擇柱溫，選擇流動(dòng)相梯度洗脫，選擇測(cè)定波長(zhǎng)后檢測(cè)；(4)多酚含量測(cè)定方法的建立用甲醇-水溶液逐級(jí)稀釋五種多酚標(biāo)準(zhǔn)品，配制成一組混合工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，以每個(gè)濃度下的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的相對(duì)響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，分別建立標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，在檢測(cè)樣品時(shí)，根據(jù)樣品所得的相對(duì)響應(yīng)值，然后分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品中各種多酚含量。
2.如權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)蘋果中五種多酚的HPLC方法，其特征是，所述步驟(1)采用超聲方法防止褐變，所述抗壞血酸溶液的質(zhì)量百分濃度為1%。
3.如權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)蘋果中五種多酚的HPLC方法，其特征是，所述步驟(2)多酚物質(zhì)的提取為稱取5g粉碎好的蘋果樣品，加入20mL甲醇-水溶液，渦旋震蕩IOs 后超聲30min，以4000rpm離心5min，將上清液過(guò)濾至150ml燒瓶，然后重復(fù)萃取一次，合并上清液；取2. Oml上清液過(guò)0. 45 μ m濾膜后，取40 μ L用HPLC檢測(cè)，所述甲醇-水溶液中甲醇與水的體積比為1 1。
4.如權(quán)利要求1-3中任意-項(xiàng)所述的同時(shí)檢測(cè)蘋果中五種多酚的HPLC方法，其特征是，所述步驟(3)流動(dòng)相為A 乙酸-水溶液，B:乙腈；所述梯度洗脫為流速為Iml/ min，初始比例為流動(dòng)相A B體積比95 5，到18min時(shí)流動(dòng)相A B體積比變?yōu)?5 35， 到19min時(shí)恢復(fù)為95 5，柱溫35°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，檢測(cè)時(shí)間20min。
5.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的同時(shí)檢測(cè)蘋果中五種多酚的HPLC方法，其特征是，所述驟(4)多酚含量測(cè)定方法的建立為首先稱取五種多酚標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，分別用甲醇-水溶液溶解為lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于_20°C保存，然后用甲醇-水溶液繼續(xù)稀釋到 10ug/mL的中間液，密封保存于4°C ；配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇-水溶液逐級(jí)稀釋使綠原酸含量為1-100 μ g/mL，其他四種多酚含量為0. 5-50μ g/mL ；然后以每個(gè)濃度下的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的相對(duì)響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，分別建立標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，在檢測(cè)樣品時(shí)，根據(jù)樣品所得的相對(duì)響應(yīng)值，然后分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品中各種多酚含量，所述甲醇-水溶液中甲醇與水的體積比為1 1。
6.利用蘋果中五種多酚的含量進(jìn)行品種識(shí)別的方法，其特征是，將不同品種不同地區(qū)的蘋果按照權(quán)利要求1所述方法進(jìn)行處理，并對(duì)其五種多酚含量數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，選擇含量差距較大的兩種多酚作為分布圖的橫縱坐標(biāo)做出分布圖，然后利用測(cè)定的待測(cè)蘋果的多酚含量數(shù)據(jù)，通過(guò)分布圖找出待測(cè)蘋果所對(duì)應(yīng)的品種和產(chǎn)地。
7.如權(quán)利要求6所述的利用蘋果中五種多酚的含量進(jìn)行品種識(shí)別的方法，其特征是， 選擇綠原酸和蘆丁含量作為分布圖的橫縱坐標(biāo)做分布圖。
8.如權(quán)利要求6或7所述的利用蘋果中五種多酚的含量進(jìn)行品種識(shí)別的方法，其特征是，所述不同品種不同地區(qū)蘋果的處理方法為稱取5g勻質(zhì)好的蘋果樣品，加入20mL體積比1 1的甲醇-水溶液，渦旋震蕩IOs后超聲30min，以4000rpm離心5min，將上清液過(guò)濾至150ml燒瓶，然后重復(fù)萃取一次，合并上清液；取2. Oml上清液過(guò)0. 45 μ m濾膜后，取 40yL用HPLC檢測(cè)；根據(jù)樣品所得的相對(duì)響應(yīng)值，然后分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品中各種多酚含量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)蘋果中五種多酚并進(jìn)行品種識(shí)別的HPLC方法。它首先將蘋果去核，加入抗壞血酸，粉碎后采用超聲、氮?dú)獗Ｗo(hù)或加熱方法防止褐變，然后加入甲醇-水溶液或乙酸乙酯超聲提取，收集上清液后重復(fù)提取一次，合并上清液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。根據(jù)不同品種不同地區(qū)所測(cè)五種多酚含量分析，采用綠原酸和蘆丁作為目標(biāo)化合物對(duì)七個(gè)不同蘋果品種進(jìn)行識(shí)別。本發(fā)明采用HPLC同時(shí)快速分離測(cè)定五種多酚，并達(dá)到對(duì)不同品種的蘋果識(shí)別的目的，此方法樣品前處理簡(jiǎn)單，成本低，可同時(shí)測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同品種蘋果的識(shí)別。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102175790SQ20111000217
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者呂瀟, 李增梅, 苑學(xué)霞, 谷小紅, 趙善倉(cāng), 鄧立剛, 郭長(zhǎng)英, 陳學(xué)兵, 陳寧寧 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室