專利名稱：Fkbp52-tau相互作用作為新穎治療靶點用于治療涉及tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及神經(jīng)障礙(包括阿爾茨海默病)的神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)，該神經(jīng)障礙涉及Tau機(jī)能失調(diào)。本發(fā)明描述了蛋白FKBP52和Tau之間的直接相互作用。本發(fā)明涉及作用于FKBP52-Tau相互作用的分子的篩選方法，從而調(diào)節(jié)病原性Tau的有害影響。最后本發(fā)明涉及神經(jīng)障礙的治療性診斷、預(yù)后和監(jiān)測分析，該神經(jīng)障礙涉及Tau機(jī)能失調(diào)。
背景技術(shù)：
Tau蛋白是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(主要是神經(jīng)元)中廣泛表達(dá)的主要微管相關(guān)蛋白 (MAP)，其中它在調(diào)節(jié)微管動力學(xué)、軸突運輸和神經(jīng)突生長(neurite outgrowth)中起關(guān)鍵作用。Tau蛋白以位于染色體17上的單一基因初級轉(zhuǎn)錄物的外顯子2、3和10的可變剪接產(chǎn)生的六種不同的異形體存在于成人腦中。它們的序列長度為352到441個氨基酸不等。 越來越多的證據(jù)提示“聚集的”Tau的異常裝配(天然未折疊蛋白)是涉及Tau機(jī)能失調(diào)的總稱為tau蛋白病或神經(jīng)障礙的一系列人類認(rèn)知疾病的標(biāo)志，其包括阿爾茨海默病、皮克病、皮質(zhì)基底節(jié)退化癥、輕度認(rèn)知損害、進(jìn)行性核上性麻痹和具有染色體17-連鎖的震顫麻痹的額顳癡呆。Tau的異常(例如高磷酸化、突變、截斷和“纏結(jié)1集)可能是致病過程的起作用的因素。迄今為止，Tau改變在誘導(dǎo)神經(jīng)變性疾病中的作用尚未完全了解，因此譯解控制Tau結(jié)構(gòu)/功能的分子機(jī)制是非常重要的，并可以有助于發(fā)現(xiàn)這些疾病的新的治療方法。本發(fā)明基于Tau蛋白(所有6個異形體)特異性且直接地與親免素 FKBP52(H(506-結(jié)合蛋白)結(jié)合的發(fā)現(xiàn)。FKBP是強力免疫抑制藥物Π(506和雷帕霉素的普遍表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)受體家族，且因此發(fā)生于在稱為親免素的一大組蛋白質(zhì)中。這些蛋白質(zhì)顯示大的分布，且在神經(jīng)系統(tǒng)中尤其豐富，提示顯著不同于其免疫調(diào)節(jié)作用的新穎和意外的功能。此外，已報道了冊506的神經(jīng)保護(hù)作用。這些后來的觀察提供了 FKBP蛋白家族的新前景，以及Π(506及其非免疫抑制性衍生物分子作為設(shè)計用于治療神經(jīng)系統(tǒng)損害和疾病的新治療試驗的特別關(guān)注。最初鑒定并克隆為與類固醇受體相關(guān)(Lebeau等.，1992)的FKBP52呈現(xiàn)模塊化組織，其包括四個單獨的功能結(jié)構(gòu)域(Callebaut等.，1992)。定位于蛋白質(zhì)的N末端部中的 FKBP52的Π(506結(jié)合位點(結(jié)構(gòu)域I) (aa 1到149)包含所有親免素蛋白家族特征性的肽基脯氨酰基異構(gòu)酶(PPI酶)活性(Chambraud等·，1993)。而第二結(jié)構(gòu)域(aa 149到267) 與結(jié)構(gòu)域I具有共同的結(jié)構(gòu)同源性，PPI酶活性是剩留的且其不結(jié)合1^506(14，15)；結(jié)構(gòu)域 II的顯著方面是共有的ATP-GTP-結(jié)合序列(16)。覆蓋結(jié)構(gòu)域III和IV的C末端結(jié)構(gòu)域包括假定的鈣調(diào)素結(jié)合位點(Massol等.，1992)，且通過它的三個三十四肽重復(fù)序列(TPR) (aa 273到389)調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)與HSP90的相互作用(Radanyi等.，1994)，后者也是類固醇受體復(fù)合物的組分(Catelli 等·，1980，Tai 等.，1986 ；Renoir 等·，1990)。此外，F(xiàn)KBP52 與HSP90的結(jié)合活性也通過特異性地磷酸化FKBP52的酪蛋白激酶II來調(diào)節(jié)(Myata等.， 1997)。
最近報道，F(xiàn)KBP52與微管相互作用并阻止微管蛋白聚合(Chambraud等.，2007)。 迄今為止獲得的結(jié)果表明微管蛋白聚合被FKBP52抑制可能不僅是由微管蛋白的隔離產(chǎn)生或由FKBP52對其結(jié)構(gòu)的改變(例如彎曲)產(chǎn)生，而且可能涉及微管蛋白組裝成微管所需的另一個重要因素?，F(xiàn)在發(fā)明人在此假設(shè)，對一種或多種微管穩(wěn)定因子，例如微管相關(guān)蛋白(MAP)的干預(yù)可以解釋微管蛋白聚合被FKBP52抑制。采用典型的生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法，他們確定了 FKBP52對Tau功能的作用的牢固基礎(chǔ)，并發(fā)現(xiàn)FKBP52和Tau之間的直接和特異性的相互作用。這種FKBP52-Tau相互作用導(dǎo)致已知的Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，例如微管蛋白聚合(FKBP52抑制這種功能)、Tau積累(FKBP52抑制這種積累)和神經(jīng)突生長(neurite outgrowth)ο發(fā)明簡述發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)親免素FKBP52和微管相關(guān)蛋白Tau(以所有其已知異形體形式， 高磷酸化或未高磷酸化的)之間的直接和特異性的蛋白-蛋白相互作用。本發(fā)明確認(rèn) FKBP52-Tau相互作用提供可有利地用于涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙(尤其是阿爾茨海默病)的新穎治療方法的新靶點。因此本發(fā)明提供用于鑒別分子的方法，所述分子調(diào)節(jié)FKBP52_Tau相互作用，從而有利地作用于涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的有害影響。經(jīng)由本發(fā)明方法鑒別其調(diào)節(jié)Tau和FKBP52之間相互作用的能力的分子是用于預(yù)防和治療涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙(且尤其是阿爾茨海默病)的藥物候選物。本發(fā)明也確認(rèn)FKBP52_Tau相互作用提供可能涉及診斷、預(yù)后、臨床隨訪的生物標(biāo)志物。發(fā)明詳述本發(fā)明的篩選方法本發(fā)明的第一個目的是篩選用于預(yù)防和治療涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的藥物的方法，包括以下步驟a)測定候選化合物調(diào)節(jié)Tau多肽和FKBP52多肽之間的相互作用的能力，和b)正向選擇調(diào)節(jié)所述相互作用的候選化合物。如此處所使用，術(shù)語“涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙”包括但不限于阿爾茨海默病、額顳癡呆、皮質(zhì)基底節(jié)退化和額顳葉退化(也稱為皮克病)、以及將來也許證實為涉及 Tau的所有神經(jīng)障礙，例如帕金森病。在本發(fā)明上下文中，如此處所使用的術(shù)語“治療(treating)，，或“治療 (trerment)”是指逆轉(zhuǎn)、緩解或抑制該術(shù)語適用的疾病或病癥的發(fā)展，或該疾病或病癥的一種或多種癥狀。如本發(fā)明所使用，術(shù)語“預(yù)防”是指防止還沒有診斷為患病的受試者發(fā)生該疾病或病癥。如本發(fā)明所使用，“調(diào)節(jié)FKBP52和Tau之間的相互作用的化合物”的表達(dá)是指具有抑制、降低或增強蛋白Tau和蛋白FKBP52之間相互作用的能力的任何化合物。步驟a)中，適于篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的任何方法是合適的。不管篩選方法的步驟a)的實施方式，完整的Tau蛋白和完整的FKBP52蛋白可用作結(jié)合伴體?；蛘?，包括相互作用位點的Tau蛋白和FKBP52蛋白的片斷可用作結(jié)合伴體。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明篩選方法的步驟a)由以下步驟組成al)使待測試候選化合物與第一 Tau多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列和( 第二 FKBP52多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列的混合物接觸，a2)測定所述候選化合物調(diào)節(jié)所述Tau多肽和所述第二 FKBP52多肽之間的結(jié)合的能力。術(shù)語“多肽”在此處是指沒有特定長度的氨基酸聚合物。因此，肽、寡肽和蛋白質(zhì)包括在“多肽”的定義中，且這些術(shù)語在整個說明書以及權(quán)利要求書中可互換使用。術(shù)語“多肽”不排除翻譯后修飾，其包括但不限于磷酸化、乙酰化、糖基化等。尤其是，該術(shù)語包括多肽的所有磷酸化形式(例如Tau或Π(ΒΡ的所有磷酸化形式)。該“多肽”定義也包括其同系物。因此，術(shù)語“Tau多肽”是指包括與FKBP52蛋白相互作用的位點的Tau蛋白或其片段。以相同方式，術(shù)語“FKBP52多肽”是指包括與Tau蛋白相互作用的位點的FKBP52蛋白或其片段。當(dāng)大于80 %，優(yōu)選大于85 %，優(yōu)選大于90 %的氨基酸是相同的，或大于約90 %， 優(yōu)選大于95%的氨基酸是相似的(功能相同)時，兩個氨基酸序列是“基本上同源”或“基本上相似”的。術(shù)語“序列同一性”是指兩條肽之間的同一性。序列之間的同一性可通過比較可為比較目的而對準(zhǔn)的各序列的位置來確定。當(dāng)比較序列中的某位置被相同堿基或氨基酸占據(jù)時，則該序列在該位置是同一的。核酸序列之間的序列同一性程度是這些序列共有的位置上具有相同核苷酸的數(shù)目的函數(shù)。氨基酸序列之間的同一性程度是這些序列共有的相同氨基酸序列的數(shù)目的函數(shù)。為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，序列進(jìn)行對準(zhǔn)從而進(jìn)行最佳比較。例如，可在第一氨基酸序列或第一核酸序列的序列中引入空位以與第二氨基酸序列或第二核酸序列進(jìn)行最佳對準(zhǔn)。然后比較位于相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽缓偷诙蛄兄械南鄳?yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，該分子在該位置是同一的。兩條序列之間的同一性百分比是由該序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)。在該比較中，所述序列的長度可以相同或不同。用于確定比較窗的序列最佳對準(zhǔn)可通過Smith和Waterman的局部同源性算法 (J. Theor. Biol. ,91(2)pgs. 370-380(1981)進(jìn)行，通過 Needleman 和 Wunsch 的同源性比對算法(J. Miol. Biol.，48(3)pgs. 443-453(1972))進(jìn)行，通過經(jīng)由 Pearson 和 Lipman 的方法來尋找相似性(PNAS，USA，85(5)pgs. 2444-2448(1988))來進(jìn)行，通過這些算法的計算機(jī)化 Α^Τ (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, Wis.)來進(jìn)行或通過檢查來進(jìn)行。術(shù)語“序列相似性”是指氨基酸可以修飾但保持相同功能。已知氨基酸根據(jù)其側(cè)基的性質(zhì)來分類，且一些氨基酸例如堿性氨基酸可以彼此交換，但仍保持它們的基本功能。在一個實施方式中，步驟在于產(chǎn)生說明所述候選化合物是否具有調(diào)節(jié)所述第一多肽和所述第二多肽之間的相互作用的能力的物理值，并將所述值與不存在所述候選化合物時進(jìn)行的相同試驗中獲得的標(biāo)準(zhǔn)物理值相比較。取決于所進(jìn)行的結(jié)合試驗，上述“物理值”可以是各種各樣的，但特別包括吸光度值、放射性信號和熒光信號強度值。如果在比較物理值與標(biāo)準(zhǔn)物理值后確定所述候選化合物調(diào)節(jié)所述第一多肽和所述第二多肽之間的結(jié)合，則在步驟b)正向選擇該候選化合物。調(diào)節(jié)(i)Tau多肽和(ii)FKBP52多肽之間相互作用的化合物包括與Tau多肽或與 FKBP52多肽結(jié)合的那些化合物，條件是所述目標(biāo)化合物的結(jié)合然后調(diào)節(jié)Tau和FKBP52之間的相互作用。本發(fā)明多肽可通過本身是本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)產(chǎn)生，例如但不限于，單獨或組合使用的任何化學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)或酶學(xué)技術(shù)。知道所需序列的氨基酸序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地通過產(chǎn)生多肽的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備所述多肽。例如，它們可以通過用眾所周知的固相法，優(yōu)選用可商購的肽合成儀器(例如由Applied Biosystems, Foster City，California制備的那些)并根據(jù)廠商指導(dǎo)來合成?；蛘?，本發(fā)明的多肽可通過本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)來合成。例如，在將編碼所需(多)肽的DNA序列引入表達(dá)載體并將這種載體引入表達(dá)所需多肽的適當(dāng)?shù)恼婧嘶蛟怂拗骱?，這些片斷可作為DNA表達(dá)產(chǎn)物獲得，隨后可以用眾所周知的技術(shù)將它們從宿主中分離出來。多種宿主/表達(dá)載體組合可用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的核酸?？墒褂玫挠杏玫谋磉_(dá)載體包括例如染色體片斷、非染色體和合成DNA序列。適當(dāng)?shù)妮d體包括但不限于SV40和 pcDNA 的衍生物；和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如 col EI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9 及其衍生物；質(zhì)粒，例如RP4 ；噬菌體DNA，例如噬菌體I的眾多衍生物，例如NM989，以及其他的噬菌體DNA，例如M13和細(xì)絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA ；酵母質(zhì)粒，例如2微米質(zhì)粒或2微米質(zhì)粒的衍生物，以及著絲粒和整合酵母穿梭載體；用于真核細(xì)胞中的載體，例如可用于昆蟲或哺乳動物細(xì)胞中的載體；來源于質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合的載體，例如已修飾以使用噬菌體DNA或表達(dá)控制序列的質(zhì)粒；等等。因此，哺乳動物和典型的人細(xì)胞，以及細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、線蟲和植物細(xì)胞可用于本發(fā)明中，且可通過此處定義的核酸或重組載體來轉(zhuǎn)染。適當(dāng)細(xì)胞的實例包括但不限于，VERO 細(xì)胞；HELA 細(xì)胞，例如 ATCC No. CCL2 ；CHO 細(xì)胞系，例如 ATCC No. CCL61 ；COS 細(xì)胞， 例如 C0S-7 細(xì)胞和 ATCC No. CRL 1650 細(xì)胞；W138、BHK、!fepG2、3T3，例如 ATCC No. CRL6361 ； A549、PC12、K562 細(xì)胞、293T 細(xì)胞、Sf9 細(xì)胞，例如 ATCC No. CRL1711 和 Cvl 細(xì)胞，例如 ATCC No. CCL70?？捎糜诒景l(fā)明的其他適當(dāng)?shù)募?xì)胞包括但不限于原核宿主細(xì)胞菌株，例如大腸桿菌(例如菌株DH5_[ α ])、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌或假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的菌株?？捎糜诒景l(fā)明的其他適當(dāng)?shù)募?xì)胞包括酵母細(xì)胞，例如酵母屬細(xì)胞，例如釀酒酵母。在一個實施方式中，本發(fā)明的任何Tau衍生的多肽或FKBP52多肽可檢測分子標(biāo)記以用于篩選目的。根據(jù)本發(fā)明，所述可檢測分子可以由能通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測的任何化合物或物質(zhì)組成。例如，有用的可檢測分子包括放射性物質(zhì)(包括含有32P、25S、3H或1251的那些)、熒光染料(包括5-溴脫氧尿苷、熒光素、乙酰氨基芴或毛地黃毒苷)、熒光蛋白(包括GFP和YFP)或可檢測的蛋白或肽(包括生物素、多組氨酸尾部或其他的抗原標(biāo)簽，如HA抗原、FLAG抗原、c-myc抗原和DNP抗原)。根據(jù)本發(fā)明，所述可檢測分子位于或結(jié)合至位于目標(biāo)氨基酸序列外部的氨基酸殘基上，從而最小化或阻止任何對所述多肽之間或所述候選化合物和或任何所述多肽之間的結(jié)合產(chǎn)生人為影響。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明多肽與GST標(biāo)簽(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)融合。 在該實施方式中，所述融合蛋白的GST部分可用作可檢測分子。在所述融合蛋白中，GST可以位于N末端或C末端。當(dāng)GST可檢測分子隨后與抗GST抗體接觸(包括與標(biāo)記的抗GST 抗體接觸)時，可以檢測到該分子。用各種可檢測分子標(biāo)記的抗GST抗體可容易地商購得到。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明多肽與多組氨酸標(biāo)簽融合。所述多組氨酸標(biāo)簽通常包括至少四個連續(xù)的組氨酸殘基，且通常包括至少六個連續(xù)的組氨酸殘基。這種多肽標(biāo)簽也可以包括高達(dá)20個連續(xù)的組氨酸殘基。所述多組氨酸標(biāo)簽可以位于N末端或C末端。在該實施方式中，當(dāng)所述多組氨酸標(biāo)簽與抗多組氨酸抗體接觸(包括與標(biāo)記的抗多組氨酸抗體接觸)時，可以檢測到該標(biāo)簽。用各種可檢測分子標(biāo)記的抗多組氨酸抗體可容易地商購得到。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明多肽與由轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域或激活劑域組成的蛋白質(zhì)部分融合。轉(zhuǎn)錄因子的所述蛋白部分結(jié)構(gòu)域可以位于N末端或C末端。這種DNA 結(jié)合域可以由來源于大腸桿菌的LexA蛋白的公知的DNA結(jié)合域組成。此外，轉(zhuǎn)錄因子的所述激活劑域可以由來源于酵母的公知的蛋白的激活劑域組成。在本發(fā)明篩選方法的一個實施方式中，上面描述的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽包括轉(zhuǎn)錄因子的部分。在所述試驗中，第一和第二部分結(jié)合在一起產(chǎn)生與特異性的調(diào)控 DNA序列結(jié)合的功能性轉(zhuǎn)錄因子，其再誘導(dǎo)報告DNA序列的表達(dá)，所述表達(dá)進(jìn)一步進(jìn)行檢測和/或測定。所述報告DNA序列的表達(dá)的陽性檢測意味著由于所述第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽結(jié)合在一起，活性轉(zhuǎn)錄因子形成。通常，在雙雜合測試中，轉(zhuǎn)錄因子的第一和第二部分分別由(i)轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和(ii)轉(zhuǎn)錄因子的激活劑域組成。在一些實施方式中，DNA結(jié)合域和激活劑域均來源于相同的天然存在的轉(zhuǎn)錄因子。在一些實施方式中，DNA結(jié)合域和激活劑域來源于不同的天然存在的因子，而當(dāng)結(jié)合在一起時，這兩個部分形成活性的轉(zhuǎn)錄因子。此處轉(zhuǎn)錄因子所使用的術(shù)語“部分”包括涉及多個蛋白轉(zhuǎn)錄因子的完整蛋白，以及完整的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的特異性功能蛋白結(jié)構(gòu)域。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明篩選方法的步驟a)包括以下步驟(1)提供宿主細(xì)胞表達(dá)-⑴以上定義的Tau多肽和(ii)轉(zhuǎn)錄因子的第一蛋白部分之間的第一融合多肽，-⑴以上定義的FKBP52多肽和(ii)轉(zhuǎn)錄因子的第二部分之間的第二融合多肽，當(dāng)所述第一和第二蛋白部分結(jié)合在一起時，所述轉(zhuǎn)錄因子在DNA靶調(diào)控序列上是活性的，和所述宿主細(xì)胞還包含核酸，其含有(i)可由所述活性轉(zhuǎn)錄因子活化的調(diào)控DNA序列和(ii)可操作地與所述調(diào)控序列連接的DNA報告序列，(2)使步驟1)提供的所述宿主細(xì)胞與待測試候選化合物接觸，
(3)測定所述DNA報告序列的表達(dá)水平。由上述步驟(3)測定的所述DNA報告序列的表達(dá)水平與當(dāng)步驟⑵省略時所述 DNA報告序列的表達(dá)相比較。存在所述候選化合物時所述DNA報告序列的不同表達(dá)水平意味著所述候選化合物有效調(diào)節(jié)Tau多肽和FKBP52多肽之間的結(jié)合，以及所述候選化合物可以通過篩選方法的步驟b)正向選擇。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括但不限于原核細(xì)胞(例如細(xì)菌)和真核細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等)。然而優(yōu)選的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，更優(yōu)選是釀酒酵母細(xì)胞或粟酒裂殖酵母細(xì)胞。雙雜合測試的類似系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，因此可用于進(jìn)行本發(fā)明篩選方法(參見 Fields 等.1989 ；Vasavada 等.1991 ；Fearon 等· 1992 ；Dang 等.，1991，Chien 等.1991，US 5，283，173，US 5，667，973，US 5，468，614，US 5，525，490 和 US5, 637，463)。例如，如這些文獻(xiàn)中所描寫的，Gal4激活劑域可用于進(jìn)行本發(fā)明的篩選方法。Gal4由兩種物理學(xué)上離散的模塊化結(jié)構(gòu)域組成，一種作為DNA結(jié)合域發(fā)揮作用，另一種作為轉(zhuǎn)錄-活化域。以上文獻(xiàn)中描述的酵母表達(dá)系統(tǒng)利用了這種性質(zhì)。在Gal4-活化的啟動子控制下的Gall-LacZ報告基因的表達(dá)依賴于經(jīng)由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的活性的重建。用β —半乳糖苷酶的顯色底物檢測含有相互作用多肽的集落。用于鑒別蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的競爭試劑盒(MATCHMAKER，TM)可從 Clontech 商購。因此在一個實施方式中，以上定義的第一 Tau多肽與的DNA結(jié)合域融合，且以上定義的第二 FKBP52多肽與的激活劑域融合。所述可檢測的標(biāo)志物基因的表達(dá)可通過定量所產(chǎn)生的相應(yīng)的特異性mRNA的量來評估。然而，通常可檢測的標(biāo)志物基因序列編碼可檢測蛋白，從而所述可檢測的標(biāo)志物基因的表達(dá)水平通過定量所產(chǎn)生的相應(yīng)蛋白質(zhì)的量來評估。用于定量mRNA或蛋白質(zhì)的量的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。例如，在調(diào)控序列控制下的可檢測的標(biāo)志物基因可由上述半乳糖苷酶組成。在另一個實施方式中，步驟a)包括在存在或不存在待測試候選化合物的情況下使如上定義的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽的混合物進(jìn)行凝膠移位分析，然后通過進(jìn)行所述多肽之間形成的復(fù)合物的檢測來測定所述多肽一起的結(jié)合的步驟。凝膠移位分析可如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。因此在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明篩選方法的步驟a)包括以下步驟(1)提供如上定義的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽，(2)使待測試候選化合物與所述多肽接觸，(3)用適當(dāng)?shù)囊莆坏孜锱c所述多肽和步驟( 獲得的所述候選化合物進(jìn)行凝膠移位分析，(4)檢測并定量步驟( 進(jìn)行的移位分析上所述多肽之間形成的復(fù)合物。然后將多肽之間形成的復(fù)合物的存在或量與當(dāng)不存在待測試候選化合物時進(jìn)行的分析所獲得的結(jié)果相比較。所述兩種多肽之間形成的復(fù)合物的檢測可通過以下步驟容易地進(jìn)行用適當(dāng)?shù)娜玖先旧莆荒z，然后測定對應(yīng)于所分析蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)帶，因為第一和第二多肽之間形成的復(fù)合物具有特定的表觀分子量。凝膠中蛋白質(zhì)的染色可采用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行。適當(dāng)?shù)哪z是本領(lǐng)域熟知的，但優(yōu)選使用非變性凝膠。以通用方式，western印跡分析是本領(lǐng)域熟知的并被廣泛描述(Rybicki等·，1982 ；Towbin等· 1979 ；Kurien等· 2006)。在具體實施方式
中，對應(yīng)于進(jìn)行凝膠移位分析的多肽的蛋白質(zhì)帶可通過特異性抗體檢測。可使用抗Tau多肽的抗體和特異性地抗FKBP52多肽的抗體。在另一個實施方式中，如上所述用可檢測抗原標(biāo)記所述兩種多肽。因此，蛋白質(zhì)帶可通過抗所述可檢測抗原的特異性抗體來檢測。優(yōu)選地，與Tau多肽偶聯(lián)的可檢測抗原和與FKBP52多肽偶聯(lián)的抗原不同。例如，第一 Tau多肽可以與GST可檢測抗原融合，且第二 FKBP52多肽可以與HA抗原融合。然后兩種多肽之間形成的蛋白復(fù)合物可分別用抗GST和 HA抗原的抗體來定量并測定。在另一個實施方式中，步驟a)包括利用例如Edwards等(1997)或也如等 (1995)所描述的光學(xué)生物傳感器。該技術(shù)允許實時檢測分子之間的相互作用而不需要標(biāo)記的分子。事實上該技術(shù)是基于表面等離子體共振(SPR)現(xiàn)象。簡言之，第一蛋白伴體與表面(例如羧甲基右旋糖酐基質(zhì))連接。然后在存在或不存在待測試候選化合物的情況下， 第二蛋白伴體與之前固定的第一伴體一起孵育。然后檢測結(jié)合，包括結(jié)合水平，或所述蛋白伴體之間結(jié)合的不存在。為此目的，使光束指向在不含有待測試樣品的基質(zhì)的表面區(qū)域側(cè)， 并由所述表面反射。隨著角度和波長組合的變化，sra現(xiàn)象引起反射光強度的降低。第一和第二蛋白伴體的結(jié)合引起基質(zhì)表面上折射指數(shù)的變化，這種變化檢測為SH 信號的變化。在本發(fā)明的另一個實施方式中，篩選方法包括采用親和層析。用于上述篩選方法的候選化合物也可通過任何免疫親和層析技術(shù)使用如上定義的(i)第一 Tau多肽或(ii)第二 FKBP52多肽預(yù)先固定在其上的任何層析基質(zhì)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來選擇。簡言之，如上定義的Tau多肽或FKBP52多肽可采用常規(guī)技術(shù)結(jié)合至柱上，包括化學(xué)偶合至適當(dāng)?shù)闹|(zhì)(例如瓊膠糖、Affi Gel 或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他基質(zhì))上。在該方法的一些實施方式中，親和柱包含嵌合蛋白，其中如上定義的 Tau多肽或FKBP52多肽融合至谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)上。然后使候選化合物與所述第一和第二多肽中的另一種多肽預(yù)先地、同時地或隨后地與親和柱的層析基質(zhì)接觸。洗滌后， 對層析基質(zhì)進(jìn)行洗脫，且通過檢測和/或定量所述較晚施加的第一或第二多肽來分析收集的洗脫液，從而確定候選化合物是否調(diào)節(jié)(i)第一 Tau多肽和(ii)第二 FKBP52多肽之間的結(jié)合和/或調(diào)節(jié)到何種程度。本發(fā)明篩選方法的另一個實施方式中，用熒光分子或底物標(biāo)記如上定義的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽。因此，待測試候選化合物對如上定義的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽之間的結(jié)合的潛在改變效應(yīng)通過熒光定量來測定。例如，如上定義的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽可以與自動熒光多肽(如上述 GFP或YFP)融合。如上定義的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽也可用適于熒光檢測和/ 或用熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析進(jìn)行所述多肽之間結(jié)合的定量的熒光分子來標(biāo)記。如上定義的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽可通過與如GFP或YFP的熒光分子的共價化學(xué)結(jié)合來用熒光分子直接標(biāo)記。如上定義的第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽也可例如通過所述多肽和所述熒光分子之間的非共價結(jié)合來用熒光分子間接標(biāo)記。事實上，如上定義的所述第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽可與受體或配體融合，且所述熒光分子可與相應(yīng)配體或受體融合，這樣熒光分子可與所述第一 Tau多肽和第二 FKBP52多肽非共價地結(jié)合。適當(dāng)?shù)氖荏w/配體偶可以是生物素/抗生蛋白鏈菌素配對成員或可以選自抗原/抗體配對成員。例如，本發(fā)明多肽可以與多組氨酸尾融合，且熒光分子可以與抗多組氨酸尾的抗體融合。如已說明的，本發(fā)明篩選方法的步驟a)包括用FRET通過熒光分析測定候選化合物調(diào)節(jié)如上定義的Tau多肽和FKBP52多肽之間的相互作用的能力。因此，在一個具體實施方式
中，如上定義的第一 Tau多肽用第一熒光團(tuán)物質(zhì)標(biāo)記，且第二 FKBP52多肽用第二熒光團(tuán)物質(zhì)標(biāo)記。第一熒光團(tuán)物質(zhì)的波長值基本上等于第二熒光團(tuán)的激發(fā)波長，其中所述第一和第二多肽的結(jié)合通過測定第二熒光團(tuán)物質(zhì)的發(fā)射波長處發(fā)射的熒光信號強度來檢測?；蛘撸诙晒饣鶊F(tuán)質(zhì)也可以具有第一熒光團(tuán)的發(fā)射波長，從而所述第一和第二多肽的結(jié)合通過測定第一熒光團(tuán)物質(zhì)的波長處發(fā)射的熒光信號強度來檢測。所使用的熒光團(tuán)可以是各種適當(dāng)?shù)姆N類，例如眾所周知的鑭族元素螯合物。這些螯合物已被描述為在特異性生物親和試驗的生物綴合和顯著能量遷移后具有化學(xué)穩(wěn)定性、 長效熒光(持續(xù)時間大于0. lms)。文獻(xiàn)US 5，162，508公開了二吡啶穴狀化合物。具有 TEKES型光敏劑(EP0203047A1)和三吡啶型光敏劑(EP0649020A1)的聚羧酸鹽螯合物也是已知的。文獻(xiàn)W096/00901公開了二乙烯基三胺五乙酸(DPTA)螯合物，其使用喹諾酮作為敏化劑。具有其他敏化劑和其他示蹤金屬的另外的DPT螯合物對于診斷或成像應(yīng)用也是已知的(例如，EP0450742A1)。在優(yōu)選的實施方式中，篩選方法的步驟a)中進(jìn)行的熒光分析包括均相時間解析熒光(HTRF)分析，例如文獻(xiàn)WO 00/01663或US6，740，756中所描述的，該兩個文獻(xiàn)的全部內(nèi)容以引用方式合并于此。HTRF是基于TR-FRET的技術(shù)，其采用TRF(時間解析熒光)和 FRET兩者的原理。更具體地說，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用基于如Leblanc等^00 描述的時間解析擴(kuò)增穴狀化合物發(fā)射(TRACE)技術(shù)的HTRF分析。HTRF供體熒光團(tuán)是銪穴狀化合物，其具有與穴狀化合物包封的穩(wěn)定性結(jié)合的鑭系元素的長效發(fā)射。XL665，由紅藻純化得到的修飾的別藻青蛋白，是HTRF主要受體熒光團(tuán)。當(dāng)這兩種熒光團(tuán)通過生物分子相互作用組合在一起時，在激發(fā)期間由穴狀化合物捕獲的一部分能量通過620nm處的熒光發(fā)射釋放，同時將其余能量轉(zhuǎn)移給XL665。然后該能量作為在665nm處的特定熒光由XL665釋放。 665nm處的光僅通過具有銪的FRET來發(fā)射。因為銪穴狀化合物始終存在于該分析中，即使當(dāng)生物分子相互作用不能使XL665緊密接近時，仍能檢測到620nm處的光。因此，在一個實施方式中，篩選方法的步驟a)可以包括以下步驟(1)使包含以下組分的分析前樣品形成接觸-與第一抗原融合的第一Tau多肽，-與第二抗原融合的第二FKBP52多肽，-待測試候選化合物，(2)將以下組分加入步驟(2)所述的分析前樣品中-特異性抗所述第一抗原的用European穴狀化合物標(biāo)記的至少一種抗體，-抗第二所述抗原的用XL665標(biāo)記的至少一種抗體，(3)在所述European穴狀化合物的激發(fā)波長處照射步驟O)的分析樣品，(4)檢測和/或定量XL665發(fā)射波長處發(fā)射的熒光信號，(5)將步驟(4)獲得的熒光信號與當(dāng)不存在待測試候選化合物時制備的步驟(1) 的分析前樣品獲得的熒光進(jìn)行比較。
如果在上述步驟(5)中，熒光信號強度與當(dāng)不存在待測試候選化合物時制備的步驟(1)的分析前樣品獲得的熒光信號強度不同(更低或更高)，則可在篩選方法的步驟b) 中正向選擇該候選化合物。用European穴狀化合物標(biāo)記或用XL665標(biāo)記的抗體可以抗不同的目的抗原， 包括GST、多組氨酸尾部、DNP、c-myx、HA抗原和其包含的FLAG。這些抗體包括可從 CisBio (Bedfors，MA，USA)商購得到的那些，以及特別地分別稱為61GSTKLA或61HISKLB的那些。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明方法還可以包括測定候選化合物調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白(APP)多肽和FKBP52多肽之間的相互作用的能力的步驟。事實上，最近研究表明， FKBP52通過其Π(506相互作用域與APP形成穩(wěn)定的復(fù)合物。該研究確定了 FKBP52在調(diào)節(jié) A β 肽的毒性中的新作用(Sanokawa-Akakura R, Cao W, Allan K, Patel K, Ganesh A, Heiman G,Burke R,Kemp FW,Bogden JD,Camakaris J,Birge RB,Konsolaki Μ. Control of Alzheimer' s amyloid beta toxicity by the high molecular weight immunophilin FKBP52and copper homeostasis in Drosophila. PLoS One. 20IOJan 13 ；5 (1) :e8626)。因此，調(diào)節(jié)Tau和FKBP52之間的相互作用和APP和FKBP52之間的相互作用的化合物可用于治療阿爾茨海默病。本發(fā)明的細(xì)胞水平(in cellulo)篩選方法本發(fā)明說明書之前描述的體外篩選的任何一個實施方式結(jié)束時正向選擇的候選化合物可進(jìn)行進(jìn)一步的選擇步驟以進(jìn)一步測定其對Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能(例如微管蛋白聚合)、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾的性能。為此目的，可進(jìn)一步選擇根據(jù)如上所述的一般體外篩選方法正向選擇的候選化合物調(diào)節(jié)Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau 聚集和所有翻譯后Tau修飾的能力。因此本發(fā)明的另一方面涉及篩選用于預(yù)防和治療涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的藥物的方法，其中所述方法包括以下步驟i)通過進(jìn)行權(quán)利要求1到6任一項所述的體外篩選方法來篩選調(diào)節(jié)Tau和FKBP52 蛋白之間的相互作用的化合物，和ii)對步驟i)結(jié)束時正向選擇的化合物的Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾進(jìn)行篩選。在上述篩選方法的某些優(yōu)選實施方式中，所述篩選方法的步驟ii)包括以下步驟(1)使細(xì)胞與步驟i)結(jié)束時正向選擇的化合物接觸，(2)測定該化合物調(diào)節(jié)Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau 修飾的能力，(3)將步驟( 測定的Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau 修飾與當(dāng)不存在所述正向選擇的化合物的情況下進(jìn)行步驟(1)時測定的Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾進(jìn)行比較。為進(jìn)行步驟(1)，任何細(xì)胞可能是合適的，但優(yōu)選神經(jīng)元。上述步驟(1)可通過將一定量待測試候選化合物加入培養(yǎng)基來進(jìn)行。通常，制備多個培養(yǎng)物樣品，從而將增加量的待測試候選化合物加入不同的培養(yǎng)物樣品中。通常，也制備至少一個不含候選化合物的培養(yǎng)物樣品，其作為陰性對照來進(jìn)行進(jìn)一步比較。任選地，也制備至少一個含有調(diào)節(jié)Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾的已知試劑的培養(yǎng)物樣品，其作為陽性對照來使所述方法標(biāo)準(zhǔn)化。因此，步驟C3)可通過將與待測試候選化合物一起孵育的細(xì)胞培養(yǎng)物所獲得其中 Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾被調(diào)節(jié)的細(xì)胞的百分比與用不含所述候選化合物的陰性對照細(xì)胞培養(yǎng)物所獲得的其中Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾被調(diào)節(jié)的細(xì)胞的百分比進(jìn)行比較來進(jìn)行。例證性地，候選化合物的效力可通過將(i)與其一起孵育的細(xì)胞培養(yǎng)物所測定的其中Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾被調(diào)節(jié)的細(xì)胞的百分比與(ii)與調(diào)節(jié)Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾的已知試劑一起孵育的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液所測定的其中Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾被調(diào)節(jié)的細(xì)胞的百分比進(jìn)行比較來評估。進(jìn)一步例證性地，候選化合物的效力可通過測定其中Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾被調(diào)節(jié)細(xì)胞的百分比接近于或高于用調(diào)節(jié)Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾的已知試劑所測定的其中Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾被調(diào)節(jié)的細(xì)胞的百分比所需加入細(xì)胞培養(yǎng)物中的候選化合物的量來評估。本發(fā)明的候選化合物根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，候選化合物可選自下組肽、擬肽、有機(jī)小分子、抗體、適體或核酸。例如本發(fā)明候選化合物可以選自之前合成的化合物文庫，或數(shù)據(jù)庫中結(jié)構(gòu)確定的化合物的文庫，或選自已經(jīng)從頭合成的化合物的文庫。在一個具體的實施方式中，候選化合物可以選自有機(jī)小分子。如此處所使用的，術(shù)語“有機(jī)小分子”是指大小與通常用于藥物的有機(jī)分子相當(dāng)?shù)姆肿?。該術(shù)語排除生物大分子(例如蛋白質(zhì)、核酸等)；優(yōu)選的有機(jī)小分子的大小范圍為最高2000Da，最優(yōu)選最高約lOOODa。本發(fā)明候選化合物可選自通過干擾其合成、翻譯和配體/底物/產(chǎn)物結(jié)合來中和 FKBP52的PPI酶活性的分子。在優(yōu)選的實施方式中，所述分子選自蛋白FKBP52的結(jié)構(gòu)域I的PPI酶配體，優(yōu)選阻止、阻斷或抑制FKBP52的結(jié)構(gòu)域I的PPI酶活性的PPI酶配體。有利地，本發(fā)明分子可在不誘導(dǎo)免疫抑制活性的情況下阻止/抑制/阻斷蛋白 FKBP52的結(jié)構(gòu)域I的PPI酶活性。第一系列的分子是缺乏免疫抑制活性的Π(506衍生物。FK506由以下結(jié)構(gòu)式表示
權(quán)利要求
1.篩選用于預(yù)防和治療涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的藥物的方法，包括以下步驟a)測定候選化合物調(diào)節(jié)Tau多肽和FKBP52多肽之間的相互作用的能力，和b)正向選擇調(diào)節(jié)所述相互作用的候選化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟a)由以下步驟組成al)使待測試候選化合物與第一 Tau多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列和第二 FKBP52多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列的混合物接觸，a2)測定所述候選化合物調(diào)節(jié)所述Tau多肽和所述第二 FKBP52多肽之間的結(jié)合的能力。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述Tau多肽或FKBP52多肽用可檢測分子標(biāo)記。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述Tau多肽用第一熒光團(tuán)物質(zhì)標(biāo)記，和所述 FKBP52多肽用第二熒光團(tuán)物質(zhì)標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述第一熒光團(tuán)物質(zhì)的發(fā)射波長值基本等于第二熒光團(tuán)物質(zhì)的激發(fā)波長值，以使得所述Tau多肽和所述FKBP52多肽的結(jié)合通過測量第二熒光團(tuán)物質(zhì)的發(fā)射波長值處發(fā)射的熒光信號強度來檢測。
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其中所述候選化合物選自下組肽、擬肽、有機(jī)小分子、抗體、適體或核酸。
7.篩選用于預(yù)防和治療涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的藥物的方法，其中所述方法包括以下步驟i)通過進(jìn)行權(quán)利要求1到6任一項的體外篩選方法來篩選調(diào)節(jié)Tau和FKBP52蛋白之間的相互作用的化合物，和 )對步驟i)結(jié)束時正向選擇的化合物進(jìn)行Tau介導(dǎo)的細(xì)胞功能、Tau積累、Tau聚集和所有翻譯后Tau修飾的篩選。
8.用于預(yù)防和治療涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的調(diào)節(jié)Tau和FKBP52蛋白之間的相互作用的化合物。
9.測試被認(rèn)為患有或易患涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的受試者的方法，其包括分析從所述受試者獲得的目標(biāo)樣品的步驟，該步驟用于i)測量FKBP52蛋白和Tau蛋白的復(fù)合物的水平；和/或 )檢測編碼FKBP52蛋白的基因和/或其相關(guān)啟動子中突變的存在；和/或iii)分析編碼FKBP52蛋白的基因的表達(dá)；iv)測量FKBP52蛋白的濃度；和/或 ν)檢測FKBP52蛋白的翻譯后修飾。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述目標(biāo)樣品選自任何細(xì)胞樣品；生物流體，包括血液、血清、尿、脊髓液；或從受試者的組織中獲得的任何活檢樣品。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及神經(jīng)障礙(包括阿爾茨海默病)的神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)，該神經(jīng)障礙涉及Tau機(jī)能失調(diào)。本發(fā)明描述并包括蛋白FKBP52和Tau之間的直接相互作用。更特別地，本發(fā)明涉及篩選用于預(yù)防和治療涉及Tau機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)障礙的藥物的方法，包括以下步驟a)測定候選化合物調(diào)節(jié)Tau多肽和FKBP52多肽之間的相互作用的能力，和b)正向選擇調(diào)節(jié)所述相互作用的候選化合物。最后本發(fā)明涉及神經(jīng)障礙的診斷、預(yù)后和監(jiān)測分析，該神經(jīng)障礙涉及Tau機(jī)能失調(diào)。
文檔編號G01N33/68GK102549438SQ201080044098
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者艾蒂安·博利安, 貝亞特麗斯·尚布羅 申請人:國家健康與醫(yī)學(xué)研究院