專利名稱：基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，尤其是一種 可以對樣品進行多方位照明成像的光激活定位顯微成像系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
生物科學(xué)領(lǐng)域中，精確定位特定蛋白對研究蛋白的位置和功能有著重要作用。電 子顯微鏡和非光學(xué)類掃描探針顯微術(shù)可以達到納米級的分辨率，但是其無法特異性標記研 究單個蛋白分子，同時也無法用于觀察研究活體。光學(xué)顯微成像可以進行無損傷性活體檢測及單分子檢測，并且可以提供偏振態(tài)、 光譜等重要的光學(xué)信息，這些優(yōu)點使光學(xué)顯微成像在生物研究中有著廣泛的應(yīng)用。但是普 通的遠場光學(xué)顯微成像由于受到阿貝的瑞利衍射極限的限制，寬場和共聚焦顯微鏡的分辨 率只能達到200nm左右。由于受到有限的空間分辨率的限制，普通的遠場光學(xué)顯微成像無 法用于微小結(jié)構(gòu)的研究如蛋白質(zhì)功能的研究等。近年來，隨著新型熒光探針的出現(xiàn)及成像 方式的革新，光激活定位顯微技術(shù)的分辨率已經(jīng)達到約20nm。光激活定位顯微技術(shù)利用光激活蛋白的光激活特性，通過控制激活光的光強以實 現(xiàn)視野內(nèi)稀疏的光激活熒光蛋白分子被激活，然后使用成像光激發(fā)激活態(tài)的熒光蛋白發(fā)出 熒光，而其他未被激活的熒光蛋白則無法發(fā)出熒光，這樣實現(xiàn)每個衍射限制區(qū)域內(nèi)至多出 現(xiàn)一個激活態(tài)的熒光蛋白。最后將采集到的單分子空間光強信息進行處理，計算出單分子 精確的位置信息。這樣經(jīng)過多次重復(fù)，直至熒光蛋白幾乎都被漂白，將所有定位信息疊加起 來即可獲得突破衍射極限的超分辨成像。存在的一個重要問題是，其需要探測的是單分子 的光強信息，由于單分子信號很弱，并且很容易受到背景噪聲的影響，所以一般光激活定位 顯微技術(shù)利用的是全內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝場進行照明。全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝場來照明樣品，由于倏逝場只存在 于百納米級的薄層內(nèi)，所以只有處于該層的熒光分子受到激發(fā)發(fā)出熒光，可以很好的抑制 了背景噪聲，得到很高信噪比的熒光成像。然而，倏逝場只存在于與樣品貼壁面IOOnm左右的范圍內(nèi)，所以光激活定位顯微 技術(shù)一般只能用于觀察細胞貼壁面的淺層信息，而無法觀察可能具有生物功能的細胞上表 面和側(cè)面；同時為了得到較好效果倏逝場而使用的高數(shù)值孔徑的物鏡增加了系統(tǒng)的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，利用光纖倏逝場照明，設(shè)計了一種基于光 纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，本發(fā)明在傳統(tǒng)的光激活定位顯微成像系統(tǒng)的 基礎(chǔ)上將照明光路和成像光路分離開，簡化了光路；利用光纖倏逝場照明器進行照明，不需 要高數(shù)值孔徑的物鏡，降低了系統(tǒng)成本；同時通過控制光纖倏逝場照明器的位置、深度和角 度，以實現(xiàn)對細胞樣品各表面進行成像。本發(fā)明技術(shù)方案為
3
基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，主要由激活激光器11、成像 激光器12、中性濾光片(9，10)、快門及其控制器(7，8)、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4、光纖倏 逝場照明器1、操控器3、倒置熒光顯微鏡14、探測器電子倍增EMCCD13組成；激活激光器11 發(fā)射的激活激光依次經(jīng)過中性濾光片9、快門及其控制器7、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4入射 到光纖倏逝場照明器1 ；成像激光器12發(fā)射的成像激光依次經(jīng)過中性濾光片10、快門及其 控制器8、二色鏡5、透鏡4入射到光纖倏逝場照明器1 ；光纖倏逝場照明器1固定在操控器 3上，光纖倏逝場照明器1放置在倒置熒光顯微鏡14的樣品池內(nèi)，探測器電子倍增EMCCD13 采集倒置熒光顯微鏡14的物鏡收集到熒光信號。激活激光器11用于發(fā)射激活激光，中性 濾光片9控制激活光的光強，快門及其控制器7用于控制激活激光的照射時間；成像激光器 12用于發(fā)射成像激光，中性濾光片10用于控制成像激光的光強，快門及其控制器8用于控 制成像激光的照射時間；反射鏡6用于改變激活光方向；二色鏡5能反射成像激光，而對激 活激光透射，經(jīng)過反射鏡6和二色鏡5的激活激光和經(jīng)過二色鏡5的成像激光的光軸重合； 透鏡4用于將激活激光和成像激光耦合入光纖倏逝場照明器；光纖倏逝場照明器1用于為 樣品提供倏逝場照明；操控器3可以對光纖倏逝場照明器進行三維位置調(diào)節(jié)，這樣光纖倏 逝場照明器的位置、深度及角度可自由變化；探測器EMCCD13用于接收倒置熒光顯微鏡14 的物鏡收集到熒光信號。所述的光纖倏逝場照明器1采用專利號為200810237414. 0的“光纖倏逝場照明
典”
'ΠΒ' ο本發(fā)明的特點為(1)將照明光路和成像光路分離開，簡化了系統(tǒng)光路；(2)不需 要大數(shù)值孔徑物鏡，降低了系統(tǒng)成本；(3)通過控制光纖倏逝場照明器的位置對細胞各表 面進行成像，并且調(diào)節(jié)方便。


圖1為基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為光纖倏逝場照明器工作原理圖。圖3為光激活定位成像過程中激活成像時序圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細的說明如圖1所示，本發(fā)明主要由激活激光器11、成像激光器12、中性濾光片(9，10)、快 門及其控制器(7，8)、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4、光纖倏逝場照明器1、操控器3、倒置熒光 顯微鏡14、探測器電子倍增EMCCD13組成；激活激光器11發(fā)射的激活激光依次經(jīng)過中性濾 光片9、快門及其控制器7、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4入射到光纖倏逝場照明器1 ；成像激光 器12發(fā)射的成像激光依次經(jīng)過中性濾光片10、快門及其控制器8、二色鏡5、透鏡4入射到 光纖倏逝場照明器1 ；光纖倏逝場照明器1固定在操控器3上，光纖倏逝場照明器1放置在 倒置熒光顯微鏡14的樣品池內(nèi)，探測器電子倍增EMCXD13采集倒置熒光顯微鏡14的物鏡 收集到熒光信號。激活激光器11用于發(fā)射激活激光，中性濾光片9控制激活光的光強，快門 及其控制器7用于控制激活激光的照射時間；成像激光器12用于發(fā)射成像激光，中性濾光 片10用于控制成像激光的光強，快門及其控制器8用于控制成像激光的照射時間；反射鏡
46用于改變激活光方向；二色鏡5能反射成像激光，而對激活激光透射，經(jīng)過反射鏡6和二 色鏡5的激活激光和經(jīng)過二色鏡5的成像激光的光軸重合；透鏡4用于將激活激光和成像 激光耦合入光纖倏逝場照明器；光纖倏逝場照明器1用于為樣品提供倏逝場照明；操控器 3可以對光纖倏逝場照明器進行三維位置調(diào)節(jié)，這樣光纖倏逝場照明器的位置、深度及角度 可自由變化；探測器EMCCD13用于接收倒置熒光顯微鏡14的物鏡收集到熒光信號。所述的光纖倏逝場照明器1采用專利號為200810237414. 0的“光纖倏逝場照明
典”
'ΠΒ' ο實施例一利用基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)實現(xiàn)生物細胞 的超分辨顯微成像。圖1為基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu) 示意圖。實驗細胞為mEosFP光轉(zhuǎn)換熒光蛋白標記的hek293細胞BK通道。激活激光使用 波長為405nm的激光，成像激光使用波長為561nm的激光。利用反射鏡6和二色鏡5將激 活激光和成像激光的光軸調(diào)節(jié)至重合。利用透鏡4將激活激光和成像激光耦合入光纖倏逝 場照明器中。操控器3可以調(diào)節(jié)光纖倏逝場照明器的三維位置，以控制光纖倏逝場照明器 的位置、深度和角度。圖2為光纖倏逝場照明器工作原理圖。光纖的一端磨成斜面，當光從光纖芯2入 射至斜面發(fā)生反射，光反射至光纖端面處，并在光纖端面發(fā)生全內(nèi)反射產(chǎn)生倏逝場。首先將樣品放在顯微鏡的載物臺上，移動載物臺將細胞樣品移入視野中，然后將 光纖倏逝場照明器移入視野并貼近需要觀察的細胞區(qū)域，利用倏逝場激活并激發(fā)mEosFP 熒光蛋白。根據(jù)樣品實際情況選取合適激活光光強，激活光照射時間，激發(fā)光光強，激發(fā)光 照射時間，并通過中性濾光片(9，10)和快門及其控制器(7，8)實現(xiàn)上述參數(shù)的控制。成像 過程激活成像時序如圖3所示。根據(jù)樣品實際情況選取合適的EMCCD采圖參數(shù)，如曝光時 間和增益等，然后開始采集一系列成像圖。最后經(jīng)過后期的數(shù)據(jù)處理，精確定位采集到的單 分子，并進行疊加得到最終的超分辨顯微成像重構(gòu)圖。
權(quán)利要求
基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，主要由激活激光器、成像激光器、中性濾光片、快門及其控制器、反射鏡、二色鏡、透鏡、光纖倏逝場照明器、操控器、倒置熒光顯微鏡、探測器電子倍增EMCCD組成；激活激光器發(fā)射的激活激光依次經(jīng)過中性濾光片、快門及其控制器、反射鏡、二色鏡、透鏡入射到光纖倏逝場照明器；成像激光器發(fā)射的成像激光依次經(jīng)過中性濾光片、快門及其控制器、二色鏡、透鏡入射到光纖倏逝場照明器；光纖倏逝場照明器固定在操控器上，光纖倏逝場照明器放置在倒置熒光顯微鏡的樣品池內(nèi)，探測器電子倍增EMCCD采集倒置熒光顯微鏡的物鏡收集到熒光信號。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，激活激光器發(fā)射的激活激光依次經(jīng)過中性濾光片、快門及其控制器、反射鏡、二色鏡、透鏡入射到光纖倏逝場照明器；成像激光器發(fā)射的成像激光依次經(jīng)過中性濾光片、快門及其控制器、二色鏡、透鏡入射到光纖倏逝場照明器；光纖倏逝場照明器固定在操控器上，光纖倏逝場照明器放置在倒置熒光顯微鏡的樣品池內(nèi)，探測器電子倍增EMCCD采集倒置熒光顯微鏡的物鏡收集到熒光信號。本發(fā)明將照明光路和成像光路分離開，簡化了光路；利用光纖倏逝場照明器進行照明，不需要高數(shù)值孔徑的物鏡，降低了系統(tǒng)成本；同時通過控制光纖倏逝場照明器的位置、深度和角度，以實現(xiàn)對細胞樣品各表面進行成像。
文檔編號G01N21/64GK101949849SQ20101027552
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者付玲, 呂曉華, 曾紹群, 駱清銘, 黃振立 申請人:華中科技大學(xué)