專利名稱：一種檢測(cè)氯霉素的試劑板的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)蜂蜜中氯霉素殘留的試劑板的制備方法，具體涉及一種檢測(cè) 氯霉素的免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的制備方法。
背景技術(shù)：
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種高效廣譜抗生素，常用于蜜蜂的各種傳染性疾病的治療。但是，氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用，在蜂蜜中的殘留嚴(yán)重威脅人體健康， 能引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，長(zhǎng)期微量攝入還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥 性、引起機(jī)體正常菌群失調(diào)。歐盟理事會(huì)508/1999/EEC號(hào)指令中將氯霉素列入動(dòng)物性食品 中禁用藥物。2002年農(nóng)業(yè)部發(fā)布第193號(hào)公告《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》 將氯霉素及其鹽、酯列入食品動(dòng)物禁用獸藥名單。同年12月農(nóng)業(yè)部發(fā)布第253號(hào)公告《動(dòng) 物性食品中獸藥殘留最高限量》將氯霉素及其鹽、酯被列為禁止使用藥物，在動(dòng)物性食品中 不得檢出。農(nóng)業(yè)部對(duì)氯霉素殘留確認(rèn)的推薦方法為酶聯(lián)免疫試劑盒ELISA+氣相色譜儀確證 (農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-21-2008)或氣相色譜-質(zhì)譜法(農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-1-2006)，檢出 限為0. lppb，定量限為0. 2ppb，方法特異性好、準(zhǔn)確率高，但存在對(duì)設(shè)備、環(huán)境、操作技能等 要求，所需費(fèi)用高，不利于大規(guī)模樣本篩選。相比前述幾種方法，免疫膠體金技術(shù)將反應(yīng)時(shí)間大大縮短，且操作簡(jiǎn)單，不需要配 備復(fù)雜儀器設(shè)備，結(jié)果直觀肉眼可判斷。食品安全關(guān)系國(guó)計(jì)民生，研制開發(fā)一種檢測(cè)限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測(cè)時(shí)間短， 適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，技術(shù)產(chǎn)品或儀器設(shè)備成本較低，運(yùn)行費(fèi)用低的快速檢測(cè)試劑迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高，特異性好，簡(jiǎn)便快速，生產(chǎn)成本低的氯霉素 免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的制備方法。本發(fā)明試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、 膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有l(wèi)_2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。本發(fā)明試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標(biāo)示各功能區(qū)(加樣孔、檢測(cè)區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部 分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液PH值的作用。膠金結(jié)合墊，由聚酯膜制成，其上有抗氯霉素單克隆抗體與膠體金顆粒的結(jié)合物。 為樣品溶液中有效成分和金標(biāo)抗體反應(yīng)提供場(chǎng)所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和質(zhì)控線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來(lái)。吸水墊，由濾紙制成，將反應(yīng)過(guò)程中多余的溶液吸收。本發(fā)明試劑板具有如下有益效果(1)特異性好。本發(fā)明試劑板對(duì)氯霉素的交叉反應(yīng)率為100%，對(duì)如甲砜霉素、氟 甲砜霉素、棕櫚氯霉素等抗生素的交叉反應(yīng)率均低于1%?？梢?，本發(fā)明試劑板對(duì)氯霉素反 應(yīng)具有高度專一性。(2)靈敏度高。本發(fā)明試劑板對(duì)原蜜、濃縮蜜中氯霉素的檢出限為0. lppb，符合國(guó) 家限量要求。(3)操作簡(jiǎn)單快捷。本發(fā)明試劑板將反應(yīng)所需的大部分原料整合到PVC背襯中， 滴樣后，抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，大大縮短檢樣時(shí)間，且樣品無(wú)需特殊處理，滴 樣后5-10分鐘即可用肉眼通過(guò)判斷硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線的顏色深淺讀取結(jié) 果。檢測(cè)實(shí)施過(guò)程不依賴任何實(shí)驗(yàn)設(shè)備，普通人員均可操作，不需專業(yè)培訓(xùn)。(4)成本低，易推廣。本發(fā)明試劑板生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，流程成熟。生產(chǎn)成本低廉，投資少，收效快。


圖1為氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板背襯結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣品墊，2為 膠金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測(cè)線，5為質(zhì)控線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC 底板。圖2為氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制 區(qū)，T為檢測(cè)區(qū)。圖3為氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T為 檢測(cè)區(qū)。具體實(shí)施方法本發(fā)明試劑板的制備包括氯霉素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備，抗氯霉素單克隆抗體 的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體的制備和氯霉素免疫膠體金 快速檢測(cè)試劑板的組裝。1.氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)采用碳二亞胺(EDC-HCl)法將氯霉素與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫抗原及包被抗原。 稱取20mg牛血清蛋白(BSA)，加入ImL蒸餾水。另外用ImL蒸餾水溶解20mg EDC · HCl和 20mg氯霉素，加入到上述溶液中。將溶液混勻后，置于4°C下避光反應(yīng)12小時(shí)(期間可顛 倒混勻)。之后用PBS緩沖液透析4天，期間每間隔8小時(shí)換液1次。再將溶液離心，收集 上清液，-20°C下凍存?zhèn)溆谩Ｂ亚宓鞍?OVA)替代BSA，同同樣方法制備氯霉素-OVA偶聯(lián)物。2.氯霉素單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的氯霉素-BSA偶聯(lián)物與等體積的 弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫1次，用不完全佐 劑替代完全佐劑進(jìn)行腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合 按常規(guī)方法進(jìn)行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1 10的比例混合，在50%PEG作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初 篩選擇10mg/L氯霉素-OVA偶聯(lián)物包被酶聯(lián)板，被測(cè)孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗 鼠IgG-HRPd 1000)，OPD顯色。篩選出的陽(yáng)性孔再用氯霉素-OVA偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板 進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2 X 10-3mol/L氯霉素溶液等量混合，37°C感作lh， 加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH 7.4)替代氯霉素溶液作對(duì)照，其余步 驟同上。若氯霉素阻斷后的OD值降至對(duì)照孔的50%以下，則判為陽(yáng)性孔。經(jīng)2 3次檢測(cè) 都呈陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5X105mL_l時(shí)停止換液，細(xì) 胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克 隆化細(xì)胞株107個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1% 的檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 的氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用0. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8. 0。邊攪拌 邊加入1. 5mg抗氯霉素單抗，攪拌20min，再逐滴加入2mL聚乙二醇20000 (25mol/L，PEG 20000)，攪拌15min。20，OOOrpm離心15min,棄上清液，加入IOmL pH 7. 4PBS緩沖液(含 0. 4mol/LPEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶解，用0. 22 μ m 無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，4 0C保存?zhèn)溆谩?.氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝參照?qǐng)D1，用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的氯霉素-BSA偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維 素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記氯霉 素單克隆抗體包被在膠金結(jié)合墊上。檢測(cè)試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素 膜和吸水墊。用切割機(jī)將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測(cè)試劑板， 再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。6.氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板檢測(cè)實(shí)施操作方法6. 1樣品制備對(duì)于無(wú)結(jié)晶的蜂蜜樣品，可直接攪拌均勻；對(duì)于有結(jié)晶的樣品，將裝有樣品的容器 于60V 80°C的熱水中溫浴至融化，攪勻。取蜂蜜3mL加入15mL刻度冷凍管中，再依次加入氯霉素A液和B液各ImL，于 60V 80°C的熱水中溫?zé)釘?shù)分鐘，溶解蜂蜜，振蕩混勻。加入SmL乙酸乙酯，上下翻轉(zhuǎn)振蕩 5min后靜置。用滴管轉(zhuǎn)移5mL上層有機(jī)溶劑于5mL刻度冷凍管中，用65°C氮(空)氣吹干。 在該5mL刻度冷凍管中滴加5滴氯霉素專用PBST緩沖液，充分溶解管內(nèi)壁上殘留物，待檢。6. 2檢測(cè)步驟從包裝袋中取出試劑板，用滴管吸取待檢溶液，在加樣孔中滴入3滴(約100 μ L)， 加樣后開始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在3 5min讀取，其他時(shí)間判讀無(wú)效。
6. 3結(jié)果判讀讀取結(jié)果時(shí)，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。陰性㈠T線顯色比C線深或一樣深，表明樣品中氯霉素濃度低于0. Ippb或無(wú)氯 霉素殘留。如圖3. a所示。陽(yáng)性⑴T線顯色比C線淺，或T線無(wú)顯色，表明樣品中氯霉素濃度高于0. Ippb ； T線比C線越淺，表明樣品中氯霉素濃度越高。如圖3. b所示。無(wú)效未出現(xiàn)C線，可能操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說(shuō)明書，并用新試劑板重新測(cè)試。如圖3. c所示。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)氯霉素的試劑板的制備方法，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有1-2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜上的膠體金結(jié)合 墊上包被有抗氯霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè) 線和質(zhì)控線，包被有氯霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色 表征出來(lái)。
3.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于膠金結(jié)合墊上包被有抗氯霉素單克隆抗 體與膠體金結(jié)合物，膠體金顆粒的平均大小為30nm。
4.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于偶聯(lián)氯霉素的載體蛋白可為牛血清蛋 白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白。
5.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于樣品中的氯霉素含量超過(guò)試劑板檢出限 時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色較控制線淺甚至無(wú)顯色，判定為陽(yáng)性；反之，當(dāng)樣品中氯霉素含 量在試劑板檢出限以下或無(wú)殘留時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色與控制線相近或偏深，判定為 陰性。
6.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于工藝流程包括制備氯霉素-BSA偶聯(lián)物、 制備抗氯霉素單克隆抗體、制備膠體金溶液、制備膠體金標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體和組裝 氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)氯霉素的免疫膠體金試劑板的制備方法，可用于檢測(cè)蜂蜜(包括原蜜和濃縮蜜)中的氯霉素殘留。本發(fā)明試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和質(zhì)控線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來(lái)。該試劑板可進(jìn)行半定量直觀檢測(cè)，整個(gè)操作過(guò)程僅需20～30min，且無(wú)需任何昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合工商部門、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)、養(yǎng)蜂場(chǎng)及蜂產(chǎn)品生產(chǎn)加工企業(yè)對(duì)蜂產(chǎn)品原料及產(chǎn)品中的氯霉素進(jìn)行大規(guī)?？焖贆z測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/566GK101839909SQ201010166288
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者張少恩, 桑麗雅, 邵偉 申請(qǐng)人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司