專利名稱：乙酰氨基酚的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及一種對(duì)樣品中存在的對(duì)氨基苯酚的濃度進(jìn)行測(cè)定的檢測(cè)方 法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種對(duì)樣品中的乙酰氨基酚的濃度進(jìn)行測(cè)定的基于酶的檢 測(cè)方法。
背景技術(shù)：
藥物毒性是導(dǎo)致急性肝功能衰竭的主要原因。在肝衰竭的評(píng)價(jià)中，臨床實(shí)驗(yàn)室 在診斷中起著至關(guān)重要的作用，使得能夠及時(shí)啟動(dòng)合適的治療。乙酰氨基酚(N-乙酰基_對(duì)氨基苯酚)一直在處方上作為解熱鎮(zhèn)痛藥。即使沒 有處方，它也是廣泛可得的，并且在許多常見的治療制劑(如，感冒和流感的治療藥物) 中，它是一種活性成分。這種藥物的廣泛應(yīng)用使得它在患有肝臟功能障礙的患者中成為 受到關(guān)注的可疑的肝毒性藥物。雖然以治療劑量服用乙酰氨基酚很少引起副作用，但有報(bào)道這樣的病例慢 性、過度地使用乙酰氨基酚導(dǎo)致了肝毒性和腎毒性。急性過量地?cái)z取大量乙酰氨基酚引 起了谷胱甘肽儲(chǔ)備的耗竭和毒性代謝產(chǎn)物在肝臟中的積累，這可導(dǎo)致嚴(yán)重甚至致命的肝衰竭。當(dāng)過量使用乙酰氨基酚時(shí)，高活性中間體N-乙?；鶎?duì)苯并醌亞胺會(huì)在肝臟中積 累。該中間體與肝臟中的硫醇(尤其是，谷胱甘肽)發(fā)生反應(yīng)。谷胱甘肽被氧化為谷胱 甘肽二硫化物(GSSG)。肝臟中過量的GSSG水平會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壞死。通常報(bào)道的乙酰氨 基酚中毒是在血清濃度超過約20mg/dL(1324l·! mol/L)。往往谷胱甘肽前體N-乙?；腚装彼?NAC)是作為治療乙酰氨基酚過量的 解毒劑而給藥的。給藥的大約70%的NAC是在肝臟中代謝。據(jù)信，至少由于以下原 因，NAC作為解毒劑它是谷胱甘肽前體，它是強(qiáng)效的抗氧化劑，并且它提高了肝臟中 GSSG還原酶的效率。據(jù)信，通過補(bǔ)充谷胱甘肽儲(chǔ)備并防止GSSG在肝臟中積累，NAC 的給藥(至少部分上)將由過量使用乙酰氨基酚造成的損害最小化、或避免由過量使用乙 酰氨基酚造成的損害。往往高濃度的NAC是這樣給藥的開始以初始負(fù)荷劑量的給藥水平，隨后在整 個(gè)療程中維持NAC的水平。該負(fù)荷劑量可導(dǎo)致NAC的血清水平在2000mg/L或更高， 并且維持水平通常為約800mg/L至1000mg/L。理想的是，在整個(gè)NAC療程中對(duì)乙酰 氨基酚水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)以保證維持合適的治療水平保持而避免不必要地或者過度地暴露于 NAC。偶然以及故意的過量使用乙酰氨基酚的發(fā)生率明顯增加。對(duì)于過量使用乙酰氨基酚的診斷和治療要求體內(nèi)藥物的早期檢測(cè)和準(zhǔn)確測(cè)量。必須迅速、準(zhǔn)確地測(cè)定原位(on board)的乙酰氨基酚的量，以便臨床醫(yī)師能迅速將合適治療劑量的NAC給藥于患者。非 常需要快速、可靠而穩(wěn)定的測(cè)定生物樣品中的乙酰氨基酚濃度的臨床檢測(cè)方法。已知的測(cè)定生物樣品中的乙酰氨基酚濃度的方法包括(例如)各種色譜技術(shù)和分 光光度法技術(shù)。氣相色譜法和高效液相色譜法已被證明是可靠和準(zhǔn)確地測(cè)定生物樣品中的乙酰 氨基酚水平的方法，不過兩者均為需要昂貴的儀器和高水平的技術(shù)人員來操作的冗長(zhǎng)方 法。這類方法并不特別適合于需要快速結(jié)果的Stat實(shí)驗(yàn)室。差式分光光度法已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用，但這個(gè)方法需要耗時(shí)的溶劑提取，這在臨 床檢測(cè)中是不需要的。更快速的分光光度法通常不能提供所需的特異性。比色技術(shù)包括單純比色法和基于酶的比色檢測(cè)法。多種基于免疫的檢測(cè)法也是 可適用的，但是它們往往明顯更貴，因此是不需要的，在臨床環(huán)境中尤其是如此。雖然與基于免疫的檢測(cè)方法相比，基于酶的檢測(cè)方法方便和經(jīng)濟(jì)，但是基于酶 的檢測(cè)方法通常是更不可靠的，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀资艿浇?jīng)常出現(xiàn)在患者樣品中的生物分子 (如，膽紅素和血紅蛋白)的干擾?；颊邩悠分械倪@種分子水平提高可引起假陽性結(jié)果 (參見例如Bertholf等，2003)，這可能潛在導(dǎo)致誤診以及治療的不合適的選擇和劑量。在治療水平的NAC存在下，已知的酶檢測(cè)法也受到干擾。因此，在NAC治療 過程中，由于測(cè)量的乙酰氨基酚水平不準(zhǔn)確，酶檢測(cè)法通常不能用于監(jiān)測(cè)乙酰氨基酚水 平。這是已知的酶促乙酰氨基酚檢測(cè)法的顯著缺點(diǎn)。已知的酶檢測(cè)法利用三個(gè)主要成分芳基酰基酰胺酶、顯色(或成色劑)化合物 和氧化劑，該氧化劑具有足夠的氧化潛力以催化偶合反應(yīng)。芳基?；０访笖嚅_乙酰氨基酚的酰胺鍵以得到對(duì)氨基苯酚和醋酸鹽。然后， 使對(duì)氨基苯酚在氧化催化劑存在下在氧化偶合反應(yīng)中與顯色化合物反應(yīng)以形成有色的產(chǎn) 物。典型的催化劑包括具有反應(yīng)性氧或官能團(tuán)的種類的金屬鹽或金屬配合物，如高錳酸 鹽、高碘酸鹽、過硫酸鹽、硫酸鹽、或者醋酸鹽。然后，利用吸光度的變化來測(cè)定樣 品的乙酰氨基酚濃度，所述吸光度通常是在該有色的產(chǎn)物達(dá)到最大吸光度的波長(zhǎng)處測(cè)量 的。這可以通過和針對(duì)具有已知的乙酰氨基酚濃度并通過同樣的方法檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)或一組 標(biāo)準(zhǔn)而獲得的吸光度數(shù)值比較來確定。形成的有色的產(chǎn)物的摩爾數(shù)通常與樣品中最初存 在的乙酰氨基酚的摩爾數(shù)成正比。最早的基于酶的乙酰氨基酚檢測(cè)方法需要很長(zhǎng)的溫育時(shí)間，對(duì)于水解和氧化偶 合反應(yīng)中的每種而言往往大于1小時(shí)，因此使其不適用于緊急臨床環(huán)境。Hammond等(1984)開發(fā)了一種用于測(cè)定血清中的乙酰氨基酚濃度的快速的基于 酶的檢測(cè)方法，該方法使用芳基?；０访竵硎挂阴０被铀獬蓪?duì)氨基苯酚。隨后， 使對(duì)氨基苯酚在由硫酸銅催化的氧化偶合反應(yīng)中與鄰甲酚反應(yīng)，以形成靛酚染料。然 后，使用在染料的峰波長(zhǎng)(615nm)處的吸光度的變化來測(cè)定乙酰氨基酚的水平。雖然這 種方法提供了對(duì)于乙酰氨基酚的快速檢測(cè)，但在治療水平的NAC存在下，這種方法會(huì)受 到嚴(yán)重干擾，因此在NAC治療中不能可靠地使用。類似的方法(在氧化催化劑存在下利 用鄰甲酚)容易受到膽紅素干擾(Bertholf等，2003年)，從而導(dǎo)致在高膽紅素血癥患者 中得到假陽性結(jié)果。
Morris等(1990)披露了測(cè)量樣品中的乙酰氨基酚的自動(dòng)的基于酶的檢測(cè)方法。 自動(dòng)的檢測(cè)方法通常為臨床實(shí)驗(yàn)室所優(yōu)選。該方法使用芳基酰基酰胺酶來將乙酰氨基酚 水解成對(duì)氨基苯酚，隨后，在錳離子存在下與8-羥基喹啉氧化偶合而形成藍(lán)色產(chǎn)物。為 保持貯存穩(wěn)定性，試劑被凍干，并且必須在使用前復(fù)原。與液體穩(wěn)定的檢測(cè)方法相比， 涉及復(fù)原步驟的檢測(cè)方法更不期望且更易出錯(cuò)。在治療水平的NAC(即，> 800mg/L)存在下，已知的使用8_羥基喹啉或其衍 生物作為發(fā)色團(tuán)的乙酰氨基酚檢測(cè)方法受到干擾。本發(fā)明人測(cè)試了兩種市售乙酰氨基酚 檢測(cè)方法(Genzyme Diagnostics P.E.I.Inc.，PEI，加拿大)，其中包含8-羥基喹啉-5-磺 酸(8-HQ5SA)或8-羥基喹啉半硫酸鹽(8-HQHS)作為發(fā)色團(tuán)。盡管觀察到在NAC不 存在下準(zhǔn)確的乙酰氨基酚測(cè)量，但在治療水平的NAC存在下，乙酰氨基酚的回收率顯著 (即，>大約10%)下降。發(fā)現(xiàn)NAC的存在影響檢測(cè)中的氧化偶合反應(yīng)，而不是影響乙 酰氨基酚到對(duì)氨基苯酚的酶轉(zhuǎn)化。在8-HQ5SA檢測(cè)和8-HQHS檢測(cè)之間的回收率有相 當(dāng)大的差異，8-HQ5SA檢測(cè)方法明顯更容易受到NAC干擾，這表明當(dāng)NAC存在時(shí)，即 使發(fā)色團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)有輕微不同，這可能對(duì)于偶合反應(yīng)都是很關(guān)鍵的的。Chen等(2004)描述了一種檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法用于對(duì)尿液中的對(duì)氨基苯酚進(jìn) 行量化以評(píng)價(jià)工作場(chǎng)所中暴露于苯胺的情況。尿液對(duì)氨基苯酚水平作為苯胺毒性的生物 指標(biāo)，因?yàn)榧s15%至60%的吸收的苯胺在體內(nèi)被氧化成對(duì)氨基苯酚。尿液必須經(jīng)酸化和 預(yù)處理，以從排泄在尿液中的共軛形式中釋放游離的對(duì)氨基苯酚。該檢測(cè)方法包括使用 2，5-二甲苯酚(對(duì)二甲苯酚)作為發(fā)色團(tuán)以形成有色的產(chǎn)物的氧化偶合反應(yīng)。該偶合反 應(yīng)由高碘酸鈉(強(qiáng)氧化劑)催化以形成有色的產(chǎn)物。據(jù)推測(cè)，對(duì)尿液中的對(duì)氨基苯酚水 平進(jìn)行量化可用于評(píng)價(jià)乙酰氨基酚的過量，盡管這即沒有經(jīng)考察，也未被證明。Afshari和Lui (2001)描述了 一種用于對(duì)血清中的對(duì)氨基苯酚進(jìn)行量化的非酶 法。首先通過提取步驟將游離的非共軛的乙酰氨基酚從內(nèi)生干擾物中分離，隨后利用熱 (即，煮沸10分鐘)和酸使對(duì)氨基苯酚水解。與酶促反應(yīng)相比，這是非選擇性水解反應(yīng)。 水解反應(yīng)之后使對(duì)氨基苯酚與2，5- 二甲苯酚(對(duì)二甲苯酚)在高碘酸鈉(強(qiáng)氧化劑)存 在下氧化偶合，以形成有色的產(chǎn)物。由于需要從樣品中提取乙酰氨基酚并將樣品沸騰， 因此這使得該方法不適用于緊急臨床環(huán)境，也不適用于自動(dòng)化。與基于免疫的檢測(cè)方法相比，雖然酶促乙酰氨基酚檢測(cè)方法方便和更容易負(fù)擔(dān) 得起，但是許多臨床實(shí)驗(yàn)室喜歡適用基于免疫的檢測(cè)方法，因?yàn)樵摲椒ú皇軜悠分蠳AC 存在的影響。需要在NAC的治療過程中可靠地測(cè)量酰氨基酚的水平?；诿庖叩臋z測(cè) 方法也不容易受到經(jīng)常存在在患者樣品中的生物分子(如，膽紅素和血紅蛋白)存在的干 擾。由于膽紅素和血紅蛋白的血清水平對(duì)于不同患者是不可預(yù)測(cè)的，因此容易受到這些 分子干擾的檢測(cè)方法不會(huì)提供對(duì)于所有的患者均可靠的穩(wěn)定的臨床測(cè)試。因此需要提供一種快速的乙酰氨基酚檢測(cè)方法，無論是否存在NAC，該檢測(cè)方 法均是準(zhǔn)確和可靠的，并且與常規(guī)的基于免疫的檢測(cè)方法相比，該檢測(cè)方法費(fèi)用較低。 還需要提供這樣一種檢測(cè)方法，與已知的檢測(cè)方法相比，該檢測(cè)方法也更不容易受到患 者樣品中存在的生物分子的干擾。附圖簡(jiǎn)述現(xiàn)在將僅通過例子、并參照附圖來描述本發(fā)明的實(shí)施方案，其中


圖1示出在存在或不存在治療水平的NAC的情況下進(jìn)行現(xiàn)有技術(shù)的乙酰氨基酚 檢測(cè)的結(jié)果，其中8-羥基喹啉-5-磺酸(8-HQ5SA)作為發(fā)色團(tuán)，其中結(jié)果證明在治療水 平的NAC存在下，8-HQ5SA示出顯著的干擾；圖2示出如以上圖1進(jìn)行的乙酰氨基酚檢測(cè)的結(jié)果，不同之處僅在于，使用對(duì) 二甲苯酚代替8-HQ5SA作為發(fā)色團(tuán)，其中結(jié)果證明對(duì)二甲苯酚相對(duì)不易受到治療水平的 NAC的存在的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明總體上涉及用于對(duì)樣品中的對(duì)氨基苯酚的進(jìn)行定量測(cè)定的可靠的檢測(cè)方 法。更具體地說，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中的乙酰氨基酚進(jìn)行定量測(cè)定的基于酶的檢測(cè)方 法。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，該檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于，無論是否存在NAC，該檢測(cè)方法均提供 準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果，因此，可用于在NAC治療中測(cè)量乙酰氨基酚的水平。與已知的檢測(cè) 方法相比，在某些實(shí)施方案中，該檢測(cè)方法具有提高性能和減少生物分子的干擾的附加 優(yōu)點(diǎn)。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在NAC存在下，與其他已知的發(fā)色團(tuán)相比，選擇二甲苯酚化 合物作為與對(duì)氨基苯酚的氧化偶合反應(yīng)的發(fā)色團(tuán)導(dǎo)致準(zhǔn)確性提高和干擾降低。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定水性樣品中的乙酰氨基酚濃度的方 法。該方法包括以下步驟使乙酰氨基酚水解為對(duì)氨基苯酚；在合適的催化劑存在下， 使對(duì)氨基苯酚與二甲苯酚發(fā)色團(tuán)氧化偶合，以形成有色的產(chǎn)物；以及測(cè)定形成的有色的 產(chǎn)物的量。形成的有色的產(chǎn)物的量與水性樣品中最初存在的乙酰氨基酚的量成正比。該 方法對(duì)于水性樣品中存在或不存在治療水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的情況均適用。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定水性樣品中的乙酰氨基酚濃度的檢測(cè) 方法，該檢測(cè)方法包括以下步驟使該水性樣品與第一試劑(Rl)接觸以形成水解溶液， 所述第一試劑包含芳基?；０访负秃线m的稀釋劑，并可任選地稀釋該水解溶液；溫育 該水解溶液以允許發(fā)生水解反應(yīng)，其中乙酰氨基酚被轉(zhuǎn)化為對(duì)氨基苯酚；使該水解溶液 與第二試劑(R2)接觸以形成氧化偶合溶液，所述第二試劑包含二甲苯酚發(fā)色團(tuán)和合適的 稀釋劑；溫育該氧化偶合溶液以允許發(fā)生氧化偶合反應(yīng)，其中在合適的催化劑存在下， 二甲苯酚發(fā)色團(tuán)與對(duì)氨基苯酚偶合，以形成有色的產(chǎn)物；以及測(cè)定形成的有色的產(chǎn)物的 量，形成的有色的產(chǎn)物的量與水性樣品中最初存在的乙酰氨基酚的量成正比，其中該檢 測(cè)方法對(duì)于水性樣品中存在或不存在治療水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的情況均適 用。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定水性樣品中的乙酰氨基酚濃度的方 法，該方法包括以下步驟使該樣品與芳基酰基酰胺酶接觸，從而使樣品中的乙酰氨基 酚轉(zhuǎn)化為對(duì)氨基苯酚；在催化劑存在下，使對(duì)氨基苯酚與二甲苯酚發(fā)色團(tuán)氧化偶合，以 形成染料；以及測(cè)定該染料的濃度，其中初始樣品中乙酰氨基酚的量與形成的染料的量 成正比。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定血液樣品中的乙酰氨基酚濃度的試劑 盒，該試劑盒包含芳基?；０访?、二甲苯酚和催化劑。在另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒用于在存在或不存在NAC的情況下測(cè)定水性樣品中的乙酰氨基酚濃度，該試劑盒包含含有第一試劑(Rl)的第一容 器，所述第一試劑包含用于將乙酰氨基酚水解為對(duì)氨基苯酚的芳基?；０访?；和含有 第二試劑(R2)的第二容器，所述第二試劑包含用于與對(duì)氨基苯酚氧化偶合的二甲苯酚發(fā) 色團(tuán)，其中Rl或者R2還包含適于對(duì)二甲苯酚發(fā)色團(tuán)與對(duì)氨基苯酚的偶合進(jìn)行催化的催 化劑。發(fā)明詳述本發(fā)明總體上涉及用于對(duì)樣品中的對(duì)氨基苯酚的進(jìn)行定量測(cè)定的可靠的檢測(cè)方 法。更具體地說，本發(fā)明涉及對(duì)樣品中的乙酰氨基酚進(jìn)行定量測(cè)定的基于酶的檢測(cè)方 法。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，該檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于，無論是否存在NAC，該檢測(cè)方法均提供 準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果。與已知的檢測(cè)方法相比，在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)方法具有提高 性能和減少生物分子的干擾的附加優(yōu)點(diǎn)。待測(cè)試的樣品優(yōu)選為水性樣品，這是指它們具有水基成分。可以在該檢測(cè)方 法中進(jìn)行測(cè)試的示例性水性樣品包括但不限于水、全血、血漿、血清、淋巴、膽汁、尿 液、脊髓液、痰、唾液、汗、大便分泌物等。也可以檢測(cè)人類或動(dòng)物組織(如，骨骼 肌、心臟、腎臟、肺、腦、骨髓、皮膚等)的流體制劑。示例性流體制劑包括組織勻漿 及其上清液。在一個(gè)實(shí)施方案中，待測(cè)試的水性樣品是血漿、血清或尿液。在另一個(gè)實(shí)施方 案，水性樣品是血漿或血清。在一個(gè)實(shí)施方案中，水性樣品是血清。雖然可以理解到，可以不進(jìn)行最初的水解步驟(即，如果直接測(cè)量樣品中的對(duì) 氨基苯酚)來實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法，但是，最典型的是，使用該檢測(cè)方法來測(cè)量樣品 中的乙酰氨基酚水平，因而在對(duì)氨基苯酚與選定的發(fā)色團(tuán)進(jìn)行氧化偶合之前，需要將乙 酰氨基酚水解為對(duì)氨基苯酚。根據(jù)本發(fā)明，選定的發(fā)色團(tuán)是二甲苯酚發(fā)色團(tuán)。雖然非酶 促水解反應(yīng)是可能的，但優(yōu)選反應(yīng)是乙酰氨基酚到對(duì)氨基苯酚的酶促轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的檢測(cè)方法通常分兩部分實(shí)施。第一部分包括乙酰氨基酚到對(duì)氨基苯酚 的酶促水解。第二部分包括在合適的催化劑存在下，使對(duì)氨基苯酚與二甲苯酚發(fā)色團(tuán)氧 化偶合，以形成有色的產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案，優(yōu)選的催化劑選自弱氧化劑。然后，可 以通過(例如)測(cè)量給定波長(zhǎng)處的吸光度的變化、并將所得到的數(shù)值與具有已知的乙酰氨 基酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)或一組標(biāo)準(zhǔn)相比較，來測(cè)量樣品中的乙酰氨基酚濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該檢測(cè)方法是按照如下步驟實(shí)施的兩部分的檢測(cè)方法。在第一部分中，將樣品的等分試樣與含有酶的第一試劑(Rl)接觸以形成水解溶 液。所述第一試劑可以被稱為酶試劑。將含有樣品的水解溶液在Rl中混合并可任選地 稀釋。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述可任選的稀釋步驟包括使用諸如去離子水之類的合適的 稀釋劑將Rl按1 1稀釋。將溶液混合并在合適的溫度下繼續(xù)水解反應(yīng)至完成，以使樣 品中的乙酰氨基酚水解為對(duì)氨基苯酚。在特定波長(zhǎng)處獲得吸光度值。在第二部分中，水解完成后，將含有二甲苯酚發(fā)色團(tuán)的第二試劑(R2)添加到水 解溶液并對(duì)得到的混合物進(jìn)行簡(jiǎn)單混合。所述第二試劑(R2)可以被稱為發(fā)色團(tuán)試劑。二 甲苯酚發(fā)色團(tuán)與對(duì)氨基苯酚的氧化偶合需要存在合適的催化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，氧 化偶合反應(yīng)的催化劑是Rl的成分，使得直到Rl和R2組合時(shí)，催化劑和發(fā)色團(tuán)才締合。 或者，催化劑可以是R2的成分，或可以添加到Rl和R2的混合物中以驅(qū)動(dòng)氧化偶合步驟。在合適的溫度下繼續(xù)氧化偶合反應(yīng)至完成。完成后，在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，并 計(jì)算第一部分和第二部分之間的吸光度變化。為測(cè)定樣品中最初存在的乙酰氨基酚的量，將該吸光度的變化與按照相同方 法、使用已知濃度的乙酰氨基酚制備的標(biāo)準(zhǔn)或一組標(biāo)準(zhǔn)相比較。必須考慮稀釋因素。對(duì) 于本領(lǐng)域的技術(shù)人員這樣的計(jì)算都是常規(guī)的。由于不需要提取和分離步驟、并且僅利用兩種試劑，因此，這種兩部分的檢測(cè) 方法適合于自動(dòng)化。也可以以自動(dòng)方式實(shí)施原位的稀釋和混合步驟。用于實(shí)施這樣的檢 測(cè)的自動(dòng)化儀器是本領(lǐng)域熟知的?；蛘?，也可以進(jìn)行手動(dòng)操作該檢測(cè)。用于該水解反應(yīng)的優(yōu)選的酶是芳基?；０访浮７蓟；０访笇?duì)酰替苯胺到 苯胺的水解進(jìn)行催化，并以IUB(國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì))號(hào)E.C.3.5.1.13標(biāo)識(shí)。這類酶的 CAS登記號(hào)為9025-18-7。通常芳基?；０访府a(chǎn)生并分離自微生物(如，細(xì)菌)。例 如Hammond等的美國(guó)專利No.4,430,433中對(duì)芳基?；０访负蛷奈⑸镏苽浞蓟；?胺酶的方法的非限定性例子進(jìn)行了描述。根據(jù)本發(fā)明可以使用任何合適的芳基酰基酰胺酶，只要它能在合適的反應(yīng)條件 下有效地對(duì)乙酰氨基酚到對(duì)氨基苯酚的水解進(jìn)行催化即可。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以結(jié)合 選擇的特定的酶在不脫離本發(fā)明的基礎(chǔ)上對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。芳基酰基酰胺酶可以以任何合適的量存在。優(yōu)選的是，芳基酰基酰胺酶以充分 的濃度存在，使得基本上樣品中存在的所有乙酰氨基酚均被轉(zhuǎn)化為對(duì)氨基苯酚。在一個(gè) 實(shí)施方案中，Rl包含的芳基?；０访傅臐舛葹榧s10U/L至約5000U/L、或約600U/L 至約1200U/L、或約800U/L至約1000U/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的芳基?；?胺酶的濃度為約932.7U/L。用于Rl的溶劑或稀釋劑可以為不對(duì)檢測(cè)造成不利影響的任何合適的水基溶劑或 稀釋劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶劑或稀釋劑為水，優(yōu)選為蒸餾水、去離子水、或反 滲透水。在一個(gè)實(shí)施方案，稀釋劑為去離子水。溶劑或稀釋劑可以包含各種添加劑和成 分。除了芳基?；０访福琑l還可以包含催化劑、輔因子、蛋白質(zhì)增溶劑、蛋白質(zhì) 穩(wěn)定劑、酶穩(wěn)定劑、金屬螯合劑、緩沖劑、表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑、稀釋劑、 溶劑、賦形劑等中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含用于氧化偶合反應(yīng)的催化劑。根據(jù)本發(fā)明，如果 能夠充分地催化氧化偶合反應(yīng)，可以以任何合適的濃度使用任何合適的催化劑。示例性 催化劑包括但不限于高錳酸鹽、高碘酸鹽、過硫酸鹽、醋酸鹽以及其他金屬鹽。在一個(gè) 實(shí)施方案中，催化劑是選自FeCl3、MnCl2> CuSO4> KIO4或它們的衍生物的金屬鹽。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，催化劑是弱氧化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，弱氧化催化劑是二氯化錳 (MnCl2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，催化劑是四水合二氯化錳(MnCl2 · 4H20)。在某些實(shí)施方案中，催化劑存在的濃度為約0.0005g/L至約1.000g/L、或約 0.005g/L 至約 1.000g/L、或約 0.010g/L 至約 0.100g/L、或約 0.025g/L 至約 0.075g/ L、或約0.040g/L至約0.060g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含濃度為約0.0525g/L的 MnCl2 · 4H20作為催化劑。除催化性能外，MnCl2 · 4H20還可以起到其他作用，例 如，據(jù)信，MnCl2 · 4H20還可以作為酶穩(wěn)定劑，從而提高酶試劑(Rl)的貯存期限。
在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含至少一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑將幫助試劑 中存在的酶的穩(wěn)定，從而提高試劑的貯存期限。根據(jù)本發(fā)明，可以利用任何合適的蛋白 質(zhì)穩(wěn)定劑或其組合。一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑是PVP-40，它也可以作為試劑中的蛋白質(zhì)增溶劑。本 發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PVP-40可以減少或消除檢測(cè)中由試劑中的蛋白質(zhì)的存在而造成的測(cè)量誤 差，并且可以防止試劑中的蛋白質(zhì)沉淀，從而改善試劑的貯存期限和檢測(cè)的整體性能。 在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的PVP-40的濃度為約0.1g/L至約10g/L、或約0.5g/L至約 5g/L、或約lg/L至約3g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的PVP-40的濃度為約2g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含至少一種選自PVP-40、BSAFraction V、海藻糖、 對(duì)羥基苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸或其組合的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至 少一種酶穩(wěn)定劑包含PVP-40、BSA Fraction V、海藻糖與對(duì)羥基苯甲酸鈉或?qū)αu基苯甲 酸的組合。BSAFraction V存在的濃度可以為(例如)約0.1g/L至約10g/L、或約0.5g/ L至約5g/L、或約lg/L至約2.5g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的BSA Fraction V的濃度為約lg/L。海藻糖存在的 濃度可以為(例如)約0.1g/L至約10g/L、或約0.5g/L至約5g/L、或約lg/L至約2.5g/ L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的海藻糖的濃度為約4.04g/L。對(duì)羥基苯甲酸鈉或?qū)αu 基苯甲酸的存在的濃度可以為(例如)約0.1g/L至約10g/L、或約0.5g/L至約5g/L、或 約lg/L至約2.5g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的對(duì)羥基苯甲酸鈉的濃度為約lg/L。 在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的對(duì)羥基苯甲酸的濃度為約lg/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含約2g/L的PVP-40、約lg/L的BSA FractionV、約 4.04g/L的海藻糖和約lg/Ι的對(duì)羥基苯甲酸鈉。Rl可以可任選地包含緩沖劑。根據(jù)本發(fā)明可以使用任何合適的緩沖劑。合適 的緩沖劑包括但不限于磷酸鹽、焦磷酸鹽、磷酸鉀、CAPS (N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸)、 CAPS/偏硼酸鹽、CAPS/碳酸鹽、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、2{[三(羥甲基)甲 基]氨基}"I-乙磺酸(TES)、TRIS/碳酸鹽、4-(2_羥基乙基)-1_哌嗪乙磺酸(HEPES)、 3-[4-(2_羥基乙基)-1_哌嗪基]丙磺酸(EPPES)、2-羥基_3_{N_[三(羥甲基)甲基] 氨基丙磺酸(TAPSO)、及其組合。緩沖劑存在的濃度可以為(例如)約1至10g/L或約5至8g/L。在一個(gè)實(shí)施方 案中，Rl包含CAPS緩沖劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的CAPS緩沖劑的濃度為約 6.4g/L。Rl可以可任選地包含防腐劑。根據(jù)本發(fā)明可以使用任何合適的防腐劑。合適 的防腐劑包括但不限于硫酸慶大霉素、疊氮化鈉、和苯甲酸鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl 包含的硫酸慶大霉素的濃度為約0.001g/L至約O.lg/L、或約0.01g/L至約0.05g/L。在 一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含約0.01g/L的硫酸慶大霉素。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的 疊氮化鈉的濃度為約0.001g/L至約O.lg/L、或約0.01g/L至約0.05g/L。在一個(gè)實(shí)施方 案中，Rl包含約0.05g/L的疊氮化鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含約0.01g/L的硫酸 慶大霉素和約0.05g/L的疊氮化鈉。Rl可以可任選地包含金屬螯合劑。根據(jù)本發(fā)明可以使用任何合適的金屬螯合 劑。合適的金屬螯合劑包括但不限于EDTA。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含的EDTA的濃度為約0.001g/L至約0.1g/L、或約0.01g/L至約0.05g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包 含的EDTA的濃度為約0.025g/L。Rl可以可任選地包含表面活性劑。根據(jù)本發(fā)明可以使用任何合適的表面活 性劑。示例性表面活性劑包括但不限于Brij _35、Triton X-100、Olin-lOG 、 TX -102、TX-405 、Zonyl FSN 、ΤΧ-ΙΟΟ 、和 TX-165 。優(yōu)選水解反應(yīng)發(fā)生的ρΗ范圍為約5.9至約12.0、或約6.5至約9.0、或約7.5至 約9.4、優(yōu)選為約8至9。在一個(gè)實(shí)施方案中，ρΗ為約8.6?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適的方式來調(diào)節(jié)Rl的ρΗ。例如，可以使用氫氧 化鈉或任何其他合適的堿來提高ρΗ?？梢允褂肏CI或其他合適的酸來降低ρΗ。在一個(gè) 實(shí)施方案中，使用氫氧化鈉來調(diào)節(jié)Rl的ρΗ。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含約500 μ L/L 至約1000 μ L/L的量的2N的氫氧化鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rl包含約833 μ L/L的2N 的氫氧化鈉。下表1示出示例性Rl配方。按照這種示例性實(shí)施方案，可以通過向小于100% 總體積的合適的稀釋劑(優(yōu)選的是，蒸餾水、去離子水、或反滲透水)中添加除酶和疊氮 化鈉外的各種成分來制備R1。然后使用氫氧化鈉來調(diào)節(jié)ρΗ至所需的范圍，隨后添加疊 氮化鈉。最后添加酶。然后，使用稀釋劑使配方達(dá)到100%體積。在本發(fā)明的自動(dòng)檢測(cè)的一個(gè)實(shí)施方案中，將10 μ L樣品(或?qū)φ掌坊驑?biāo)準(zhǔn)樣品) 添加到比色皿中的IOOyL的Rl中。然后用100 yL的水(優(yōu)選蒸餾水、去離子水、或反 滲透水)將Rl按1 1原位稀釋，并將溶液簡(jiǎn)單混合。在比色皿中發(fā)生水解反應(yīng)?？?以根據(jù)特定的自動(dòng)化儀器(即，化學(xué)分析儀)所要求的比色皿尺寸來調(diào)節(jié)體積。在一個(gè) 實(shí)施方案中，化學(xué)分析儀是 Hitachi 717 Chemical Analyzer (Roche Dignostics)。水解反應(yīng)可發(fā)生的溫度在約10°C至約60°C、或約30°C至約50°C、或約35°C至約 40°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，水解反應(yīng)發(fā)生在約37°C的溫度。允許水解反應(yīng)進(jìn)行足夠的時(shí)間以使得基本上樣品(或標(biāo)準(zhǔn)樣品)中存在的所有乙 酰氨基酚均被水解，通常在約2至20分鐘之間或者是約3至10分鐘之間。在一個(gè)實(shí)施 方案中，將水解反應(yīng)持續(xù)約5分鐘。由于對(duì)于較低的溫度通常需要更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，所 以對(duì)于選定的溫度可以優(yōu)化反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)。在水解反應(yīng)完成并且基本上樣品(或標(biāo)準(zhǔn)樣品)中存在的所有乙酰氨基酚均被轉(zhuǎn) 化為對(duì)氨基苯酚后，實(shí)施氧化偶合步驟。在本發(fā)明的自動(dòng)檢測(cè)的一個(gè)實(shí)施方案中，通過向含有水解溶液的比色皿中直接 添加含有發(fā)色團(tuán)的第二試劑(R2)來引發(fā)氧化偶合步驟。根據(jù)上面描述的實(shí)施方案， 將200yL的R2添加到水解溶液中，簡(jiǎn)單混合，至最終比色皿中氧化偶合反應(yīng)體積達(dá) 410 μ L (10 μ L 的樣品 +100 μ L 的 R1+100 μ L 的水 +200 μ L 的 R2)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的發(fā)色團(tuán)是二甲苯酚發(fā)色團(tuán)。本發(fā)明人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，在 本檢測(cè)方法中選擇二甲苯酚發(fā)色團(tuán)顯著降低了 NAC存在的干擾。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè) 方法，這個(gè)驚訝的結(jié)果提供下列優(yōu)點(diǎn)可以在NAC的治療中推薦使用本檢測(cè)方法。本發(fā) 明人已經(jīng)證明，在高達(dá)至少2000mg/L的治療水平的NAC存在的情況下，乙酰氨基酚測(cè) 量是可靠的，這一結(jié)果是之前現(xiàn)有技術(shù)的酶促乙酰氨基酚檢測(cè)方法所沒有證實(shí)的。在實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人也驚訝地發(fā)現(xiàn)，使用2，5-二甲苯酚代替市售乙酰氨基酚檢測(cè)方法(得自 Genzyme Diagnostics P.E.I.Inc.，PEI,加拿大)中的 8-HQ5SA 發(fā)色團(tuán)，
導(dǎo)致檢測(cè)中膽紅素的干擾顯著降低，這進(jìn)一步證實(shí)了發(fā)色團(tuán)的選擇可顯著影響檢測(cè)中的 干擾水平。根據(jù)本發(fā)明可以使用任何合適的二甲苯酚發(fā)色團(tuán)，例如，2，5-二甲苯酚、3， 4-二甲苯酚、2，6-二甲苯酚、2，4-二甲苯酚、3，5-二甲苯酚或2，3-二甲苯酚。在 存在治療水平的NAC的檢測(cè)中，優(yōu)選的二甲苯酚發(fā)色團(tuán)導(dǎo)致最小的干擾。在實(shí)驗(yàn)中， 2，5-二甲苯酚、2，6-二甲苯酚或2，3-二甲苯酚在干涉檢測(cè)中顯示出不受1471mg/L 的NAC的顯著干擾。在一個(gè)實(shí)施方案中，二甲苯酚發(fā)色團(tuán)是2，5-二甲苯酚(對(duì)二甲苯 酚)。在氧化偶合反應(yīng)中，二甲苯酚發(fā)色團(tuán)可以以任何合適的濃度存在。然而，為了 準(zhǔn)確計(jì)算初始樣品中存在的乙酰氨基酚的濃度，發(fā)色團(tuán)應(yīng)理想地以達(dá)到或超過水解溶液 的對(duì)氨基苯酚的最大摩爾濃度(其與初始樣品中的乙酰氨基酚的量成正比)的摩爾濃度存 在。在一個(gè)實(shí)施方案中，R2包含的二甲苯酚發(fā)色團(tuán)的濃度為約0.075g/L至約115g/ L、或約2.5g/L至約20g/L、或約5g/L至約10g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，二甲苯酚發(fā)色 團(tuán)是2，5-二甲苯酚，并且存在于R2中的濃度為約7.5g/L。為了使氧化偶合反應(yīng)發(fā)生在合適的時(shí)間范圍內(nèi)，必須存在合適的催化劑。催化 劑可以是Rl或者R2的成分，或者可以被添加到Rl與R2的混合物中。根據(jù)本發(fā)明可以 使用各種催化劑，如高錳酸鹽、高碘酸鹽、過硫酸鹽、及各種金屬鹽。在一個(gè)實(shí)施方案 中，催化劑是金屬鹽，如FeCl3、MnCl2> CuSO4或004。在一個(gè)實(shí)施方案中，催化劑包 括無水或水合的MnCl2。驚訝地發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他測(cè)試的金屬鹽，MnCl2 (弱氧化劑)對(duì) 于與二甲苯酚的氧化偶合步驟的催化尤其有效。典型地，對(duì)于乙酰氨基酚檢測(cè)中的氧化偶合步驟，選擇強(qiáng)氧化潛力的催化劑以 確保提供足夠的能量來驅(qū)動(dòng)偶合反應(yīng)至完成。通常采用的催化劑是具有反應(yīng)性氧或官能 團(tuán)的種類的金屬鹽，如高碘酸鈉、硫酸銅和醋酸錳。例如，已知的乙酰氨基酚檢測(cè)方法 利用由醋酸錳催化的羥基喹啉或其衍生物(即，Genzyme Diagnostics P.E.I.Inc.，PEI,加 拿大)、由高碘酸鹽催化的鄰甲酚(GDSDiagnostics)或硫酸銅(Hammond等，1984)、或 由高碘酸鈉催化的對(duì)二甲苯酚(Afshari和Lui，2001)。已知這些乙酰氨基酚檢測(cè)方法均 顯示干擾。例如，在生物樣品中存在高水平的膽紅素的干擾會(huì)在這樣的樣品中產(chǎn)生錯(cuò)誤 的結(jié)果。本發(fā)明人推測(cè)，使用強(qiáng)氧化性催化劑可以成為常規(guī)的乙酰氨基酚檢測(cè)中所見的 膽紅素干擾的起作用的因素。例如，某些試劑制造商使用高碘酸鹽通過選擇性破壞膽紅 素以形成膽腺素來測(cè)量膽紅素。當(dāng)膽紅素被氧化成膽腺素或更高氧化程度的產(chǎn)物時(shí)，吸 光度有顯著變化，這可能會(huì)對(duì)常規(guī)的檢測(cè)中所見的干擾起作用。因此，本發(fā)明人由此出 發(fā)來確定(a)弱氧化劑是否能夠成功地驅(qū)動(dòng)二甲苯酚發(fā)色團(tuán)(如，2，5-二甲苯酚)與 對(duì)氨基苯酚之間的氧化偶合反應(yīng)；(b)使用弱氧化劑是否會(huì)對(duì)檢測(cè)中的膽紅素干擾起到 積極作用。驚訝地證實(shí)，選擇弱氧化劑(如，MnCl2)作為示例性催化劑(與含有反應(yīng)性氧 種類的高碘酸鈉或者其他強(qiáng)氧化劑相比，其具有低的氧化潛力)提供了足夠的能量來催化反應(yīng)中對(duì)氨基苯酚與2，5-二甲苯酚的偶合。此外，已成功地證實(shí)，選擇弱氧化劑作 為催化劑顯著降低了檢測(cè)中的膽紅素干擾，從臨床角度看，這是十分需要的發(fā)現(xiàn)。還驚 訝地地發(fā)現(xiàn)，與測(cè)試的其他催化劑相比，需要較低濃度的MnCl2以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)，并且在檢 測(cè)中出現(xiàn)更強(qiáng)的顯色。試劑中使用較少的催化劑降低了催化劑與其他試劑成分或與患者 樣品中的生物或化學(xué)成分反應(yīng)的幾率，從而改善了檢測(cè)。因此選擇弱氧化劑作為催化劑可以減少隨著時(shí)間的推移二甲苯酚發(fā)色團(tuán)的自然 氧化反應(yīng)的可能、以及與檢測(cè)試劑中的其他成分反應(yīng)的可能，從而改善試劑的穩(wěn)定性并 延長(zhǎng)了液體穩(wěn)定試劑的貯存期限。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠區(qū)分出強(qiáng)氧化劑和弱氧化 劑，并能夠根據(jù)發(fā)明的實(shí)施方案選擇合適的弱氧化劑作為催化劑。據(jù)推測(cè)，向發(fā)色團(tuán)試劑添加抗氧化劑能進(jìn)一步提高發(fā)色團(tuán)試劑的顏色的經(jīng)時(shí)穩(wěn) 定性。令人驚訝的是，已證明，添加還原型谷胱甘肽(顯色檢測(cè)法中不常見的成分)成功 地防止發(fā)色團(tuán)試劑隨著時(shí)間的推移的顯色，可能部分原因是防止二甲苯酚的自動(dòng)氧化， 從而改善試劑的穩(wěn)定性。谷胱甘肽還作為清除劑，從而可以去除試劑中可能影響氧化偶 合反應(yīng)的自由基。使用羥胺、3，3' _硫代二丙酸、硫脲或還原型谷胱甘肽進(jìn)行了研究。定性與 定量監(jiān)測(cè)了這些試劑的顏色隨時(shí)間的變化。向試劑中添加還原型谷胱甘肽最有效地防止 隨時(shí)間而顯色。因此，R2可以可任選地含有抗氧化劑。根據(jù)本發(fā)明可以利用任何合適的抗氧 化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，R2包含的抗氧化劑的濃度為約0.005g/L至約5.00g/L、或約 0.05g/L至約5g/L、或約0.1g/L至約lg/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗氧化劑是谷胱甘肽。 尤其優(yōu)選的是還原型谷胱甘肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，R2包含的還原型谷胱甘肽的濃度為 約 0.5g/L。R2可以可任選地含有一種或多種緩沖劑或表面活性劑或它們的組合。根據(jù)本 發(fā)明可以利用任何合適的緩沖劑或表面活性劑，例如，上面涉及水解溶液時(shí)所提到的那 些。試劑中存在表面活性劑可以抑制檢測(cè)中的脂血干涉，尤其是在低乙酰氨基酚水平 (即，< 200ymol/L)時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，R2包含的TRIS的濃度為約10至50g/L、或約15至30g/ L、或約20至30g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，R2包含約24.2g/L的TRIS。在一個(gè)實(shí)施方 案中，R2包含的碳酸鈉的濃度為約5至20g/L、或約10至15g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中， R2包含約10.6g/L的碳酸鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，R2包含約24.2g/L的TRIS和約10.6g/ L的碳酸鈉。在一些實(shí)施方案中，偶合反應(yīng)是在約37°C下、在約9至12之間、或約9.5至11.5 之間、或優(yōu)選的是約10至11之間的堿性pH下實(shí)施的。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH大于約 10。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH為約10.8?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域任何合適的方式來調(diào)節(jié)試劑的pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，向R2 添加氫氧化鈉小球至濃度為約lg/L至約4g/L、或約2g/L至約3g/L。在一個(gè)實(shí)施方案 中，R2包含約2.5g/L的氫氧化鈉小球。下表2示出示例性R2配方。當(dāng)按照這種示例性的實(shí)施方案制備R2時(shí)，建議最 后并按照谷胱甘肽和2，5- 二甲苯酚的順序?qū)⑵涮砑印?br> 制備后可以檢查檢測(cè)試劑的pH，如果需要，可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)。氧化偶合反應(yīng)可發(fā)生的溫度在約10°C至約60°C、或約30°C至約50°C、或約35°C 至約40°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，氧化偶合反應(yīng)發(fā)生在約37°C的溫度。允許氧化偶合反應(yīng)進(jìn)行足夠的時(shí)間以使得二甲苯酚發(fā)色團(tuán)基本上與反應(yīng)混合物 中存在的所有對(duì)氨基苯酚均發(fā)生偶合，通常在約2至20分鐘之間或者是約3至10分鐘之 間。在一個(gè)實(shí)施方案中，氧化偶合反應(yīng)持續(xù)約5分鐘。由于對(duì)于較低的溫度通常需要更 長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，所以對(duì)于選定的溫度可以優(yōu)化反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)。二甲苯酚發(fā)色團(tuán)與對(duì)氨基苯酚的氧化偶合導(dǎo)致藍(lán)色產(chǎn)物(即，染料)的形成，這 可以通過在合適的波長(zhǎng)處測(cè)量檢測(cè)混合物的吸光度的變化來檢測(cè)。從氧化偶合反應(yīng)結(jié)束 時(shí)的吸光度減去水解反應(yīng)結(jié)束時(shí)的吸光度。初始樣品中存在的乙酰氨基酚的化學(xué)計(jì)量的 量基本上與形成的染料的化學(xué)計(jì)量的量相等?？梢栽谝欢úㄩL(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)量所得染料的吸光度。該染料的最大吸收發(fā)生在約 610-615nm。典型地，用于在比色檢測(cè)中的測(cè)量而選擇的波長(zhǎng)是出現(xiàn)峰吸光時(shí)的波長(zhǎng)。 如果利用雙色分析儀，在可選擇的波長(zhǎng)(如約700nm至約850nm)處進(jìn)行雙色空白測(cè)量， 其從主測(cè)量中減去，以使檢測(cè)中的背景噪音最小化。也可以使用其他已知的減少檢測(cè)中 的背景噪音的方法。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，測(cè)量在非峰值波長(zhǎng)(即，在吸光度曲線的肩上而不是峰 上)處的吸光度明顯降低了檢測(cè)中的生物分子膽紅素和血紅蛋白的干擾。發(fā)現(xiàn)在約640nm 至約680nm、或約650nm至670nm、優(yōu)選約660nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度顯著提高了在膽 紅素或血紅蛋白存在下的乙酰氨基酚測(cè)量精確度。膽紅素和血紅蛋白干擾是和已知的乙 酰氨基酚檢測(cè)方法有關(guān)的常見缺點(diǎn)。因此，為了減少檢測(cè)中的干擾，可以在約660nm處 測(cè)量吸光度。在一個(gè)實(shí)施方案中，在約6IOnm和665nm之間測(cè)量吸光度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，可以不脫離本發(fā)明而改變?cè)噭┤芤旱某煞旨捌湎鄬?duì) 比例，避免獨(dú)立和組合溶液中的渾濁、沉淀和其他污染因素。當(dāng)檢測(cè)是液體穩(wěn)定的檢測(cè) 時(shí)，應(yīng)仔細(xì)評(píng)估可能對(duì)試劑或其成分的穩(wěn)定性(如，酶或發(fā)色團(tuán)穩(wěn)定性)造成負(fù)面影響的 任何改變。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，按照以下概述的步驟實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的兩部分的乙 酰氨基酚檢測(cè)。第一部分包括向比色皿中的患者血清或者血漿樣品中以一定的樣品與試劑的比 例添加酶試劑(Rl)。例如，在Hitachi 717上樣品體積是10 μ L、Rl體積是100 μ L，使 用100 μ L去離子水對(duì)Rl進(jìn)行原位稀釋，以形成水解溶液。將該溶液在自動(dòng)分析儀中在 37°C下溫育設(shè)置的持續(xù)時(shí)間(如，5分鐘)。在這段時(shí)間里，試劑中存在的芳基?；０?酶斷開樣品中的乙酰氨基酚分子的酰胺鍵，從而得到對(duì)氨基苯酚和醋酸鹽。在引入發(fā)色 團(tuán)試劑之前，在建立的波長(zhǎng)處、以某些時(shí)間間隔監(jiān)測(cè)吸光度讀數(shù)。在第二部分中，以設(shè)定的時(shí)間間隔和一定的體積向水解溶液(樣品+R1，稀釋過 的)加入隔發(fā)色團(tuán)試劑(R2)。例如，在Hitachi 717上加入200 μ L R2，以設(shè)定的時(shí)間間 隔監(jiān)測(cè)反應(yīng)直到測(cè)試的時(shí)間期間結(jié)束。R2中的二甲苯酚發(fā)色團(tuán)(優(yōu)選2，5- 二甲苯酚) 在催化劑存在和堿性pH下與第一部分中產(chǎn)生的對(duì)氨基苯酚氧化偶合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在錳陽離子存在下實(shí)施氧化偶合步驟。反應(yīng)產(chǎn)生有色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物的最 大吸收峰在約610nm。分析儀測(cè)量添加R2之前的吸光度和反應(yīng)結(jié)束時(shí)的吸光度之間的差，為了背景噪 音進(jìn)行校正。光密度差是樣品產(chǎn)生的吸光度的量?？梢詫⑽舛鹊淖兓c標(biāo)準(zhǔn)曲線相比 較，以計(jì)算初始樣品中的乙酰氨基酚濃度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在660nm處測(cè)量吸光度以使檢測(cè)中某些生物分子的 干擾最小化。雖然不希望受任何具體理論的約束，但據(jù)信根據(jù)朗伯-比耳的原理，乙酰氨基 酚的濃度與吸光度的強(qiáng)度直接成正比，A= ε Cl，其中A =吸光度(在給定波長(zhǎng)處)；ε =摩爾消光系數(shù)(對(duì)于每個(gè)化學(xué)物質(zhì)均為常數(shù))；1 =光路長(zhǎng)度(即，1厘米)；以及c =溶質(zhì)濃度。因此，在摩爾消光系數(shù)和光路長(zhǎng)度為常數(shù)的情況下，溶質(zhì)(在這種情況下為乙 酰氨基酚)濃度與吸光度直接成正比。在一個(gè)實(shí)施方案中，最終反應(yīng)混合物的濃度是1) 227.5U/L芳基酰基酰胺酶2)0.0128g/L MnCl23)3.66g/L2，5_ 二 甲苯酚4)0.244g/L 谷胱甘肽本發(fā)明的檢測(cè)方法可以以由各部分組成的試劑盒的形式生產(chǎn)和銷售。試劑盒中 的試劑可以是需要復(fù)原的粉狀或凍干試劑。制備這種粉狀或凍干試劑的方法是本領(lǐng)域已 知的。優(yōu)選的是，該試劑為液體穩(wěn)定試劑。液體穩(wěn)定試劑使用方便，并且不易于在復(fù)原 時(shí)引入錯(cuò)誤。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括含有酶試劑(Rl)的容器；含有發(fā)色團(tuán)試劑 (R2)的容器；以及可任選的實(shí)施該檢測(cè)的指導(dǎo)書。該試劑盒還可以包含乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn) 樣品和制備線性組(linear set)的標(biāo)準(zhǔn)樣品的指導(dǎo)書。
實(shí)施例實(shí)施例1示例性酶和發(fā)色團(tuán)試劑表1示例性酶試劑(Rl)的組成(以去離子水作為稀釋劑)
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定水性樣品中的乙酰氨基酚濃度的方法，該方法包括以下步驟 使乙酰氨基酚水解以形成對(duì)氨基苯酚；在合適的催化劑存在下，使所述對(duì)氨基苯酚與二甲苯酚發(fā)色團(tuán)氧化偶合，以形成有 色的產(chǎn)物；以及測(cè)定形成的所述有色的產(chǎn)物的量，形成的所述有色的產(chǎn)物的量與所述水性樣品中最 初存在的所述乙酰氨基酚的量成正比，其中，無論所述水性樣品中是否存在治療水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)，該方法均 是可靠的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使乙酰氨基酚水解為對(duì)氨基苯酚的步驟包括使所 述乙酰氨基酚與芳基?；０访附佑|。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述二甲苯酚發(fā)色團(tuán)選自由2，5-二甲苯 酚、2，6-二甲苯酚和2，3-二甲苯酚構(gòu)成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述催化劑為弱氧化劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述二甲苯酚發(fā)色團(tuán)為2，5-二甲 苯酚，并且所述催化劑為無水或水合的MnCl2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水性樣品為血清或者血漿。
7.一種用于測(cè)定水性樣品中的乙酰氨基酚濃度的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括以下步驟使所述水性樣品與第一試劑(Rl)接觸以形成水解溶液，所述第一試劑包含芳基酰基 酰胺酶和合適的稀釋劑，可任選地稀釋所述水解溶液；溫育所述水解溶液以允許發(fā)生水解反應(yīng)，其中所述乙酰氨基酚被轉(zhuǎn)化為所述對(duì)氨基 苯酚；使所述水解溶液與第二試劑(R2)接觸以形成氧化偶合溶液，所述第二試劑包含二甲 苯酚發(fā)色團(tuán)和合適的稀釋劑；溫育所述氧化偶合溶液以允許發(fā)生氧化偶合反應(yīng)，其中，在合適的催化劑存在下， 使所述二甲苯酚發(fā)色團(tuán)與所述對(duì)氨基苯酚偶合，以形成有色的產(chǎn)物；以及測(cè)定形成的所述有色的產(chǎn)物的量，形成的所述有色的產(chǎn)物的量與所述水性樣品中最 初存在的所述乙酰氨基酚的量成正比，其中，無論所述水性樣品中是否存在治療水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)，該方法均 是可靠的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其中Rl包含濃度為約10U/L至約5000U/L的芳基?；０访浮?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的檢測(cè)方法，其中所述二甲苯酚發(fā)色團(tuán)選自由2，5-二甲 苯酚、2，6-二甲苯酚和2，3-二甲苯酚構(gòu)成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中所述催化劑為弱氧化催化 劑，并且其中所述催化劑在Rl中存在的濃度為約0.0005g/L至約1.000g/L。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中R2包含濃度為約0.075g/L 至約115g/L的2，5-二甲苯酚，和/或其中所述催化劑為MnCl2 · 4H20并且在Rl中存在的濃度為約2.5g/L至約20g/L。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中R2還包含濃度為約0.005g/ L至約5.000g/L的還原型谷胱甘肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中Rl還包含蛋白質(zhì)增溶劑、 蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、酶穩(wěn)定劑、金屬螯合劑、緩沖劑、表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑、或 賦形劑中的一種或多種。
14.根據(jù)權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中所述酶穩(wěn)定劑選自由 PVP-40、BSA Fraction V、海藻糖、對(duì)羥基苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸、及其組合構(gòu)成的 組。
15.根據(jù)權(quán)利要求7至14中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中R2還包含緩沖劑、表面活 性劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑、抗氧化劑、或賦形劑中的一種或多種。
16.根據(jù)權(quán)利要求7至15中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中所述稀釋劑為去離子水，并 且在所述水解反應(yīng)之前使用所述稀釋劑將所述水解溶液按照約11的比例稀釋。
17.根據(jù)權(quán)利要求7至16中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中Rl包含約932.7U/L的芳基 ?；０访负图s0.0525g/L的MnCl2 · 4H20 ；并且其中R2包含約7.5g/L的2，5-二甲 苯酚和約0.500g/L的還原型谷胱甘肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求7至17中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中所述水解反應(yīng)和氧化偶合反 應(yīng)均在約37°C的溫度下進(jìn)行約3到10分鐘，并且其中所述水解反應(yīng)在pH約8.6下發(fā)生， 和所述氧化偶合反應(yīng)在pH約10.8下發(fā)生。
19.根據(jù)權(quán)利要求7至18中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，通過獲得所述水解反應(yīng)結(jié) 束時(shí)的吸光度與所述氧化偶合反應(yīng)結(jié)束時(shí)的吸光度的差、并將該差與標(biāo)準(zhǔn)或一組標(biāo)準(zhǔn)來 比較，從而確定所述乙酰氨基酚的濃度，其中所述吸光度是在約610nm和665nm之間的 波長(zhǎng)處測(cè)量的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的檢測(cè)方法，其中，所述吸光度是在約660nm的波長(zhǎng)處測(cè)量的。
21.根據(jù)權(quán)利要求7至20中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中所述水性樣品為血清或者血漿。
22.—種用于測(cè)定水性樣品中的乙酰氨基酚濃度的試劑盒，該試劑盒包含含有第一試劑(Rl)的第一容器，所述第一試劑包含用于使乙酰氨基酚水解為對(duì)氨基 苯酚的芳基酰基酰胺酶；含有第二試劑(R2)的第二容器，所述第二試劑包含用于與所述對(duì)氨基苯酚氧化偶合 的二甲苯酚發(fā)色團(tuán)，所述二甲苯酚發(fā)色團(tuán)選自由2，5-二甲苯酚、2，6-二甲苯酚和2， 3-二甲苯酚構(gòu)成的組；可任選的乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)樣品；以及根據(jù)權(quán)利要求7實(shí)施乙酰氨基酚測(cè)定檢測(cè)的說明書，其中Rl還包含用于對(duì)所述二甲苯酚發(fā)色團(tuán)和所述對(duì)氨基苯酚的氧化偶合進(jìn)行催化的 合適的催化劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述二甲苯酚發(fā)色團(tuán)為2，5-二甲苯酚，和 所述催化劑為弱氧化劑，并且其中所述試劑為液體穩(wěn)定的。
24.一種用于測(cè)定水性樣品中的對(duì)氨基苯酚濃度的方法，該方法包括以下步驟 在催化劑存在下，使對(duì)氨基苯酚與二甲苯酚發(fā)色團(tuán)氧化偶合，以形成有色的產(chǎn)物，所述二甲苯酚發(fā)色團(tuán)選自由2，5-二甲苯酚、2，6-二甲苯酚和2，3-二甲苯酚構(gòu)成的 組，所述催化劑為弱氧化劑；以及測(cè)定形成的所述有色的產(chǎn)物的量，形成的所述有色的產(chǎn)物的量與所述水性樣品中最 初存在的所述對(duì)氨基苯酚的量成正比。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述催化劑為水合MnC12，并且所述二甲苯酚 發(fā)色團(tuán)為2，5-二甲苯酚。
全文摘要
本發(fā)明總體上提供了一種對(duì)水性樣品中的對(duì)氨基苯酚進(jìn)行定量測(cè)定的可靠的檢測(cè)方法。更具體地說，本發(fā)明提供了一種對(duì)樣品中的乙酰氨基酚進(jìn)行定量測(cè)定的快速的基于酶的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法采用了二甲苯酚生色團(tuán)和催化劑，所述催化劑優(yōu)選是弱氧化劑。無論是否存在N-乙酰半胱氨酸(NAC)，該檢測(cè)方法均提供可靠的結(jié)果，因此可以被用來監(jiān)測(cè)在NAC治療過程中的對(duì)乙酰氨基酚的水平。本發(fā)明還提供了用于測(cè)定水性樣品中的乙酰氨基酚濃度的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102016569SQ200980115106
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者簡(jiǎn)·霍林斯基, 邁克爾·巴爾杰 申請(qǐng)人:建新公司