專利名稱：確定缺氧的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及確定缺氧的方法。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在生產(chǎn)過程中確定胎兒頭皮 血中缺氧，以指示胎兒器官功能障礙的方法。本發(fā)明另一方面涉及確定缺血的裝置。
背景技術(shù)：
急性圍產(chǎn)期窒息，即生產(chǎn)過程中或接近生產(chǎn)時(shí)缺氧(胎兒血氧飽和度不足)，是新 生兒中缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)形式的神經(jīng)系統(tǒng)損傷的 重要原因。1000個(gè)足月新生兒中有2-9例，嚴(yán)重的病例中隨后可能發(fā)生腦性癱瘓(CP)和 死亡。就全球來說，每年有大約4百萬新生兒死亡，其中約23%是由急性圍產(chǎn)期窒息造成 的。由于資源匱乏，不發(fā)達(dá)國家情況更差，但由這樣巨大的數(shù)量可以知道，在西方國家這也 是嚴(yán)重的問題。瑞典可以看作是西方國家的一個(gè)代表，這里的缺氧發(fā)生約為7/1000足月新 生兒，導(dǎo)致2/1000兒童先天HIE。為了防止新生兒周產(chǎn)期窒息造成的永久性損傷，很重要的 一點(diǎn)是盡早檢測(cè)到胎兒發(fā)生缺氧?？焖贆z測(cè)使得能夠在還未發(fā)生永久性損傷的階段決定是 否需要干預(yù)。干預(yù)基本包括通過器械協(xié)助性生產(chǎn)，特別是剖宮產(chǎn)將嬰兒盡快取出。目前檢測(cè)急性圍產(chǎn)期窒息是通過監(jiān)測(cè)胎兒心率進(jìn)行，如果觀察到不良的心率模 式，再測(cè)量經(jīng)陰道取樣的胎兒頭皮血的PH或乳酸。pH和乳酸表明供氧不足情況下轉(zhuǎn)為無氧代謝而造成的代謝性酸中毒。在缺少氧 氣的胎兒中，丙酮酸被代謝為乳酸和能量。目前，PH測(cè)量值是公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。但是快速確定pH 需要大約35 μ 1頭皮血，并不容易獲得。某些研究表明，第一次測(cè)量失敗非常常見(20%)。 測(cè)量乳酸更容易，因?yàn)橹恍枰? μ 1血液并且分析可以在床邊進(jìn)行。乳酸分析1分鐘內(nèi)即可 完成，因此足夠快。乳酸和pH也是急性窒息的指標(biāo)。因此乳酸和PH可以提供指示，表明完全健康的 胎兒在生產(chǎn)過程中突然發(fā)生急性缺氧缺血。發(fā)生缺氧缺血性腦病的全部嬰兒中很大部分在 進(jìn)入生產(chǎn)期之前就曾發(fā)生過缺氧缺血。他們對(duì)生產(chǎn)過程中的缺氧缺血更易感，與健康胎兒 的反應(yīng)方式不同，因此目前使用的方法對(duì)這一患者群體不夠。WO 2005/034762Α1中公開了監(jiān)測(cè)分娩的方法，包括測(cè)量液體(比如陰道液)中的 乳酸。最近瑞典的一項(xiàng)對(duì)產(chǎn)時(shí)胎兒血中PH和乳酸隨機(jī)化研究的初期結(jié)果表明，乳酸是和pH 一樣好的酸中毒指標(biāo)。乳酸和PH都不是中度/嚴(yán)重HIE的理想預(yù)示者靈敏度對(duì)乳酸僅有 67 %，對(duì)pH是50 % ；而特異性大體相同，乳酸的是76 %，pH是73%。乳酸和pH預(yù)測(cè)新生兒 酸中毒的靈敏度和特異性都低于70%。近來的瑞典報(bào)道結(jié)論是在胎兒監(jiān)測(cè)中即使組合使用 胎心宮縮監(jiān)護(hù)(CTG)和STAN(胎心宮縮監(jiān)護(hù)ST區(qū)段的分析)，仍有檢測(cè)不到某些可能導(dǎo)致 腦損傷的圍產(chǎn)期窒息的風(fēng)險(xiǎn)(SBU Alert-rapport nr2006_04)。
已知在缺氧新生兒中升高的酶有又稱為肝酶的LDH(乳酸脫氫酶)、ALT (丙氨酸轉(zhuǎn) 氨酶)和AST (天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)。LDH在身體的多數(shù)細(xì)胞中都存在，被認(rèn)為是非特異性 的酶。因此，不常用于臨床工作。以前，LDH被用作心肌損傷的標(biāo)記物，但現(xiàn)在已被特異性 更高的測(cè)試代替。AST以及特別是ALT是肝損傷特異性更高的。在關(guān)于分娩對(duì)一組低風(fēng)險(xiǎn) 中國婦女的新生兒中血漿肝酶的影響的研究中，確定了 LDH(乳酸脫氫酶)、ALT(丙氨酸轉(zhuǎn) 氨酶)、AST (天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、GGT ( γ -谷氨酰轉(zhuǎn)氨酶)，并建立了其與母體和新生兒特點(diǎn) 的相互關(guān)系(Mongrelli M et al.，J Obstet Gynaecol Res, 26(1) :61_63，2000)。如果胎兒在出生過程中或者接近出生時(shí)發(fā)生缺氧，其體內(nèi)的血流將從“不太重要 的器官”(腎、肝、脂肪和腸)重新分配向腦、心和腎上腺。這往往會(huì)損害非特權(quán)級(jí)器官的細(xì) 胞。細(xì)胞損傷導(dǎo)致酶泄漏，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。如果缺氧嚴(yán)重，細(xì)胞會(huì)死亡，血液中的酶濃度增 加更多。LDH、AST和ALT(在12-36小時(shí))下降速度使得可能檢測(cè)到由于分娩前開始的先 前缺氧導(dǎo)致分娩過程中對(duì)缺氧缺血更易感的病例。缺氧還影響胎兒體內(nèi)的電解質(zhì)平衡。一 個(gè)實(shí)例是缺氧時(shí)鈣由血液涌入細(xì)胞。已知新生兒動(dòng)物模型在缺氧時(shí)，血清離子鈣的濃度升 高。鈣也能預(yù)示人類嬰兒中的后果(是否發(fā)生腦損傷)。新生哺乳動(dòng)物在缺氧時(shí)發(fā)生改變 的其他酶和電解質(zhì)有鉀(K+)、鎂(Mg2+)、鈉(Na+)、葡萄糖、肌酸激酶(CK)和GGT。全球范圍內(nèi)每年有4百萬新生兒死亡，其中的大約23%是由急性圍產(chǎn)期窒息造成 的。導(dǎo)致腦神經(jīng)元損傷的缺氧缺血其病理機(jī)制分為兩個(gè)階段，其中初級(jí)階段在分娩后立刻 發(fā)生。如果嬰兒被成功復(fù)蘇，該初級(jí)階段之后是持續(xù)幾小時(shí)的無癥狀期。七分之二的窒息嬰 兒在該無癥狀期后會(huì)發(fā)生次級(jí)能量損耗導(dǎo)致嬰兒腦中遲發(fā)性細(xì)胞死亡和包含痙攣的臨床 圖像(又稱為HIE)。無癥狀期提供了一個(gè)機(jī)會(huì)來通過低溫處理(將嬰兒腦降溫至34. 5°C ) 使遲發(fā)性細(xì)胞死亡降至最低。但是目前沒有可靠的手段預(yù)測(cè)嬰兒是否會(huì)發(fā)生HIE，因此無法 利用低溫處理的好處。除了分娩過程中或接近分娩，缺氧在許多其他醫(yī)學(xué)情況中也是嚴(yán)重的問題。例如， 結(jié)腸直腸癌在兩性中都是最常見的腫瘤之一，其發(fā)生率逐年增加。目前的治療方法包括將 腫瘤與腸相當(dāng)一部分一起切除的手術(shù)過程。這些病例中很大一部分，之后要將腸的遠(yuǎn)端和 近端接在一起。這被稱為吻合術(shù)。該過程中，當(dāng)動(dòng)脈血管被切開時(shí)，對(duì)腫瘤所位于的腸部分 的動(dòng)脈血供應(yīng)被打斷。全部手術(shù)中7-10%預(yù)期會(huì)發(fā)生由吻合口漏造成的術(shù)后并發(fā)癥。這種 情況中，腸內(nèi)容物會(huì)泄漏到腹部，引起炎癥、腹膜炎、膿毒癥甚至可能死亡。這類并發(fā)癥的主 要原因是摘除血管而造成的進(jìn)行吻合術(shù)的區(qū)域供血不足(例如缺氧缺血)。目前的解決方 案僅是重新手術(shù)。目前還不可能在手術(shù)期間就預(yù)測(cè)到吻合口是否會(huì)發(fā)生泄漏。缺氧是重要問題的其他領(lǐng)域包括血管手術(shù)和肝移植手術(shù)。例如，決定患者肝臟移 植后致殘率和死亡率的重要因素是肝移植物的保存損傷(Leemaster 1997)。LDH、AST和 ALT泄漏到灌注液標(biāo)志著肝細(xì)胞膜完整性喪失(Kebis 2007)。先前用于確定缺氧的裝置和方法的一個(gè)主要缺點(diǎn)是LDH僅能在血漿或血清中進(jìn) 行分析。另外，這一測(cè)量需要最少150微升全血。很難由小動(dòng)物、特定組織或分娩時(shí)未出生 的嬰兒中獲取如此體積的血液。另一個(gè)問題是LDH也存在于紅細(xì)胞，溶血(紅細(xì)胞破裂) 會(huì)造成假的(超過檢測(cè)極限的)高值。因此，需要快速，僅需要少量血分析單獨(dú)LDH，或者LDH和電解質(zhì)以及肝酶來檢測(cè) 缺氧缺血的方法。此外，生產(chǎn)時(shí)胎兒供血狀態(tài)的確定需要提高。
發(fā)明概述通過提供裝置和方法，幾分鐘內(nèi)(或者替代的幾秒內(nèi))能在10微升全血中分析 LDH、以及任選的AST、ALT、Mg和乳酸，本發(fā)明滿足以上需要中的至少某些。這些分析可以與 游離血紅蛋白一起測(cè)量來保證沒有發(fā)生溶血使得LDH值假性提高。本發(fā)明的實(shí)施方案包括確定缺氧，特別是生產(chǎn)過程中取樣的胎兒頭皮血中缺氧的 方法。這些實(shí)施方案中，方法可以包括確定血漿中的LDH(乳酸脫氫酶)。優(yōu)選除了 LDH，還 確定所述胎兒頭皮血中選自K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸的一種或幾種標(biāo)記物。特別優(yōu)選的 是LDH與K、Mg、Ca、AST、ALT、乳酸之一的組合。同樣優(yōu)選的是LDH、乳酸、Mg和AST和/或 ALT的組合。應(yīng)當(dāng)理解文中使用的“LDH”和“乳酸脫氫酶”是指總的乳酸脫氫酶，而非其同工酶。在發(fā)明方法中，有限量(優(yōu)選大約5-25yL)的頭皮血是分娩時(shí)在鄰近患者的環(huán)境 中經(jīng)由陰道從胎兒采樣的。樣品進(jìn)行血漿(血清)與血細(xì)胞(特別是紅細(xì)胞)的分離，分 析血漿的LDH，以及任選的K、Mg、Ca、AST、ALT、乳酸中的一種或多種，在幾分鐘內(nèi)得出結(jié)果。 這樣醫(yī)療隊(duì)伍可以直接得出結(jié)論兒童是否遭受急性窒息，即表明是否需要剖宮產(chǎn)。本發(fā)明 可能免除與缺氧有關(guān)的大量痛苦，并且可能挽救大量生命。在發(fā)明人進(jìn)行的研究中，第一個(gè)M小時(shí)內(nèi)分析了兒童血樣中的LDH、AST和ALT。 發(fā)現(xiàn)193個(gè)接受測(cè)試的兒童中，19個(gè)兒童表現(xiàn)出窒息跡象，在5分鐘大時(shí)Apgar得分< 7。 借助ROC曲線(參見

圖1)，可以觀察到臨界值1000U/L的LDH靈敏度和特異性達(dá)到96%。 對(duì)于HIE，相同臨界值的靈敏度為100%，特異性為96%。換句話說，這意味著發(fā)明所述方 法的主要標(biāo)記物準(zhǔn)確地確定所有缺氧兒童中的95% (或更多)，同時(shí)將所有健康兒童中的 95 %確定為健康。AST和ALT分別在臨界值55U/L和18U/L給出靈敏度86 %和特異性90 %。 盡管這只是初步研究，它表明與現(xiàn)有方法相比有令人驚訝的提高。從成本角度考慮該結(jié)果是驚人的。已知使用目前的方法，大約要10例不必要的剖 宮產(chǎn)才會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)HIE兒童，即為了發(fā)現(xiàn)一個(gè)HIE兒童，共需進(jìn)行11例剖宮產(chǎn)，其中10例 是不必要的。本發(fā)明的靈敏度和特異性表明結(jié)果會(huì)是相反的，即10例剖宮產(chǎn)中僅有1例是 不必要的。相應(yīng)的，社會(huì)將節(jié)省上百萬，不僅是使更多兒童能夠以自然方式出生。以下表格 顯示本發(fā)明的方法與已知方法相比帶來的顯著提高。
權(quán)利要求
1.評(píng)價(jià)哺乳動(dòng)物組織部位缺氧的方法，所述方法包括a.由組織部位采集血樣，所述血樣包含血漿和血細(xì)胞；b.將血漿與血細(xì)胞分開；c.確定血漿中的LDH的量；和d.由血漿中的LDH的量評(píng)價(jià)該組織部位是否存在缺氧。
2.權(quán)利要求1的方法，另外包括確定血漿中選自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸構(gòu)成 的其他預(yù)后標(biāo)記物中至少一種的量。
3.權(quán)利要求1的方法，其中血樣的體積包含從5μ L到150 μ L0
4.權(quán)利要求1的方法，其中血樣的體積包含從5μ L到25 μ L0
5.權(quán)利要求1的方法，其中血樣的體積包含從大約5到15μ L。
6.權(quán)利要求1的方法，其中通過利用半透膜，使血漿通過膜，血細(xì)胞保留在膜上，而將 血漿與血細(xì)胞分開。
7.權(quán)利要求1的方法，其中血樣采集自哺乳動(dòng)物的腸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中血樣在醫(yī)療程序前采集，且另外包括a.在醫(yī)療程序后采集第二血樣，所述血樣包含血漿和血細(xì)胞；b.將第二血樣的血漿與血細(xì)胞分開；和c.確定第二血樣的血漿中的LDH總量。
9.權(quán)利要求8的方法，另外包括確定兩種血樣的血漿中選自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT 和乳酸構(gòu)成的其他預(yù)后標(biāo)記物中至少一種的量。
10.權(quán)利要求9的方法，另外包括比較血樣中預(yù)后標(biāo)記物的量。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述醫(yī)療程序包括胃腸道的吻合術(shù)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述血樣在手術(shù)過程中采集自一或多種特異器官、腦脊 液、尿或腹腔液。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述器官包含哺乳動(dòng)物的主動(dòng)脈。
14.權(quán)利要求12的方法，還包括確定血漿中選自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸構(gòu)成 的其他預(yù)后標(biāo)記物中的至少一種的量。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種預(yù)后標(biāo)記物包括乳酸。
16.權(quán)利要求1的方法，其中血樣從器官采集，該器官將要移植給需要所述器官的哺乳 動(dòng)物。
17.權(quán)利要求17的方法，其中血樣是在移植手術(shù)前采集的。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述器官包括肝。
19.權(quán)利要求17的方法，還包括確定血漿中選自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸構(gòu)成 的其他預(yù)后標(biāo)記物中的至少一種的量。
20.權(quán)利要求2的方法，還包括確定血漿中選自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸構(gòu)成 的其他預(yù)后標(biāo)記物中的至少一種的量。
21.權(quán)利要求20的方法，其中確定預(yù)后標(biāo)記物使個(gè)體能夠?qū)Σ溉閯?dòng)物的肝臟健康狀況 進(jìn)行評(píng)價(jià)。
22.權(quán)利要求1的方法，其中確定缺氧使得能夠預(yù)測(cè)產(chǎn)前窒息后的腦損傷。
23.權(quán)利要求22的方法，還包括確定血漿中選自基本由AST、ALT和乳酸構(gòu)成的其他預(yù)后標(biāo)記物中的至少一種的量。
24.權(quán)利要求22的方法，還包括確定血漿中ALT的量。
25.權(quán)利要求22的方法，還包括給有需要的哺乳動(dòng)物提供低溫治療，其中確定血漿中 的LDH表明哺乳動(dòng)物腦中延遲的細(xì)胞死亡。
26.權(quán)利要求1的方法，其中確定血漿中的LDH總量使得能夠?qū)︶t(yī)藥或手術(shù)治療之前、 過程中和之后，哺乳動(dòng)物肢體的血液循環(huán)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
27.確定胎兒頭皮血急性缺氧的方法，所述方法包括在生產(chǎn)過程中采集血樣、處理血樣 以尋找至少一種確定缺氧的指標(biāo)，該方法特征在于包括確定由樣品獲得的血漿中的總?cè)樗?脫氫酶(LDH)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述樣品是5μ L到60 μ L。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述樣品是5μ L到25 μ L。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述樣品是大約5到15μ L。
31.權(quán)利要求27的方法，其包括利用半透膜和/或?yàn)V器將血漿與血細(xì)胞分開。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述膜的面積為5mm2到1000mm2，優(yōu)選低于100mm2。
33.權(quán)利要求31的方法，其包括將樣品加到膜的一面，給膜的另一面施加負(fù)壓，并將血 漿收集到朝向所述另一面的小室內(nèi)。
34.權(quán)利要求33的方法，其包括將血漿從小室轉(zhuǎn)移到確定LDH的設(shè)備和/或裝置的步驟。
35.權(quán)利要求33的方法，其包括確定放置在小室內(nèi)的血漿中的LDH的步驟。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述的膜被放置在有孔基質(zhì)上或者與有孔基質(zhì)結(jié)合，血 漿被毛細(xì)管力吸引進(jìn)入所述基質(zhì)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中在一定時(shí)間后從基質(zhì)上取下所述膜來確定基質(zhì)中的LDH。
38.權(quán)利要求27的方法，其包括將樣品中的血漿與血細(xì)胞分離以及將上清血漿轉(zhuǎn)移到 設(shè)備中確定LDH的步驟。
39.權(quán)利要求27的方法，還包括比較如上確定的LDH和從胎兒頭皮血獲得的血漿中確 定的LDH，后者血漿是從分娩過程中非缺氧狀態(tài)的胎兒采集的。
40.權(quán)利要求39的方法，其中LDH水平有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著升高表明缺氧。
41.權(quán)利要求39的方法，其中LDH水平在統(tǒng)計(jì)意義上升高3倍或更多倍表明有缺氧缺 血性腦病的風(fēng)險(xiǎn)。
42.權(quán)利要求27的方法，還包括確定所述頭皮血和/或所述血漿中K、Mg、Ca、AST、ALT 和乳酸中的一或多種。
43.權(quán)利要求42的方法，其中K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸水平有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著升 高，結(jié)合LDH水平有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著升高，表明缺氧。
44.權(quán)利要求27的方法，其特征在于樣品被采集到一次性裝置上，所述裝置包括用于 分離血漿的部件和用于進(jìn)行LDH檢測(cè)的小室。
45.儀器在權(quán)利要求27的方法中分離血漿和血細(xì)胞的用途，所述儀器包含殼體、殼體 中的小室、殼體中被半透膜覆蓋的第一開口、殼體中經(jīng)由管道將小室與負(fù)壓部件或毛細(xì)管 力部件相通的第二開口，以及在負(fù)壓的情況下，用于控制所述相通的閥門部件。
46.權(quán)利要求45的用途，其中閥門部件安排在管道上，其中優(yōu)選小室還包含與其底部相通的第二管道，并帶有用于控制清空積累在小室底部的血漿的第二閥門部件。
47.權(quán)利要求45的用途，其中小室中有確定積聚在該殼體內(nèi)的血漿中的LDH的部件或 者與這種部件相通。
48.執(zhí)行權(quán)利要求27所述方法的測(cè)試系統(tǒng)，所述測(cè)試系統(tǒng)包含一次性裝置有血樣收集 部分、血漿分離裝置和能夠間接或直接確定血漿中總的乳酸脫氫酶(LDH)的室。
49.權(quán)利要求48的測(cè)試系統(tǒng)，其特征在于所述一次性裝置有平滑的殼體，其中所述接 收部分形成小室、并形成毛細(xì)采樣器的界面。
50.權(quán)利要求49的測(cè)試系統(tǒng)，其特征在于卡上排列有許多檢測(cè)室，其中優(yōu)選這些小室 中的每一個(gè)與含有試劑的上游小室相通。
51.權(quán)利要求48的測(cè)試系統(tǒng)，其特征在于所述界面和所述血漿分離裝置之間帶有樣品 分配器。
52.權(quán)利要求49的測(cè)試系統(tǒng)，其特征在于所述小室是光學(xué)檢測(cè)池的形式，形成的殼體 適合放入配有至少一個(gè)用于分光光度法的裝置的儀器中。
53.權(quán)利要求48的測(cè)試系統(tǒng)，其特征在于所述殼體被編排了獨(dú)特的代碼，優(yōu)選所述儀 器帶有閱讀器。
54.權(quán)利要求48的測(cè)試系統(tǒng)，其特征在于所述一次性裝置包括放置了目測(cè)用的干化學(xué) 部件的小室。
全文摘要
確定生產(chǎn)過程中取樣的胎兒頭皮血缺氧的方法，所述方法包括確定由所述樣品獲得的血漿中的總的乳酸脫氫酶(LDH)。方法可以包括另外確定血漿和/或血液中的K、Mg、Ca、AST、ALT、乳酸。LDH、Mg、Ca、AST、ALT、乳酸的數(shù)值有一或多個(gè)發(fā)生增加指示了胎兒缺氧。發(fā)明還公開了血漿分離裝置在所述方法中的用途。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102131938SQ200980112713
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者索菲亞·西奧特阿夫奧納斯, 馬賽厄斯·卡爾森 申請(qǐng)人:卡爾馬克瑞典股份公司