專利名稱：用于診斷或治療腦損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及用于診斷或治療損傷的方法。本發(fā)明方法可以同時(shí)診斷和治療 損傷同時(shí)診斷和治療。單獨(dú)診斷和治療個(gè)體中創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury), ^Ml 舌$zHIlT倉Il貞(multi-organ trauma)0
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)是工業(yè)化國家中45歲以下的人死 亡和殘疾的首要原因(McAllister，1992)。在美國每年估計(jì)發(fā)生的150萬例頭部創(chuàng)傷(head traumas)中，50萬可能需要住院，80，000導(dǎo)致某種形式的慢性殘疾(Langlois等，2006)。 疾病控制中心(The Center for Disease Control，CDC)估計(jì)目前至少有530萬美國人，或 約2%人口，由于TBI在每日生活活動(dòng)上需要長期協(xié)助(Langlois et al.，2006)。此外，每 年用于TBI的總健康費(fèi)用達(dá)到大約350億美元(Max et al.，1991)。盡管這種損傷形式流 行和嚴(yán)重，但是仍然沒有研發(fā)出有效的治療。醫(yī)生通常試圖區(qū)分輕度創(chuàng)傷性腦損傷(MTBI)和TBI。MTBI通常由臨床癥狀確 定，包括“任何時(shí)期觀察到的或自我報(bào)告的短暫混亂(transient confusion)、定向障礙 (disorientation)或意識(shí)障礙(impaired consciousness)；任何時(shí)期觀察到的或自我報(bào) 告的在損傷時(shí)間周圍的記憶障礙(失憶癥，amnesia)；觀察到的例如-頭部損傷后急性發(fā)作 的其它神經(jīng)或神經(jīng)心理功能障礙的跡象；在嬰幼兒中頭部損傷后易怒、嗜睡或嘔吐；當(dāng)損 傷后很快確定的、在較大的孩子和成人中的癥狀如頭痛、頭暈、煩躁、疲勞或注意力不集中 可以用來支持輕度TBI的診斷，但不能用來在意識(shí)喪失或意識(shí)改變不存在的情況下進(jìn)行診 斷。任何時(shí)期觀察到的或自我報(bào)告的意識(shí)喪失持續(xù)30分鐘或更短時(shí)間。"(National Center for Injury Prevention and Control. Report to Congress on Mild Traumatic Brain Injury in the United States: Steps to Prevent a Serious Public Health Problem. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention； 2003)。通常關(guān)于 TBI 白勺 癥狀包括無意識(shí)超過30分鐘；創(chuàng)傷后失憶癥持續(xù)時(shí)間超過24小時(shí)；和顱腦穿透損傷。同 上。認(rèn)識(shí)到只要最初的創(chuàng)傷可以迅速診斷或者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織上的壓力達(dá)到一 個(gè)預(yù)先選擇的閾值之前逐漸紊亂的情況下，可以減少對(duì)與最初的創(chuàng)傷的生理反應(yīng)有關(guān)的中 樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的二次傷害，臨床神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域仍然非常失望。創(chuàng)傷的、缺血的和毒害神經(jīng)的 化學(xué)創(chuàng)傷，與一般紊亂一起，都表示腦損害的可能。雖然對(duì)腦損害的這些原因的每一種的幾種形式的診斷都是簡單地通過臨床響應(yīng)測試和計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI) 測試，這些診斷有其局限性，因?yàn)楣庾V成像既費(fèi)錢又費(fèi)時(shí)，而無行為能力的個(gè)體的臨床反應(yīng) 測試是有限的數(shù)值，往往排除了細(xì)致入微的診斷。此外，由于現(xiàn)有診斷的局限性，當(dāng)對(duì)象經(jīng) 受導(dǎo)致他們神經(jīng)系統(tǒng)疾病的壓力的情況下，由于微妙的癥狀往往很快解決，對(duì)象往往沒有 意識(shí)到損害已經(jīng)發(fā)生或?qū)で笾委煛?duì)對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的這些輕度至中度激發(fā)的治療的 缺乏可以有一個(gè)累積效應(yīng)或接下來導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損害事件，其在每種情況中都具有較差的 臨床預(yù)后。為了克服與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的光譜和臨床反應(yīng)診斷有關(guān)的局限性，對(duì)于對(duì)象的分子 或細(xì)胞水平健康狀況，存在增加的注意力至作為變化的內(nèi)部指標(biāo)的生物標(biāo)志物的使用上。 因?yàn)樯飿?biāo)志物的檢測使用從對(duì)象取得的樣品，并檢測那個(gè)樣品中的生物標(biāo)志物，樣品通 常是腦脊髓液(cerebrospinal fluid)、血液或血漿，生物標(biāo)志物檢測擁有廉價(jià)、快速、客觀 測量神經(jīng)系統(tǒng)疾病的前景。隨著神經(jīng)系統(tǒng)疾病的迅速和客觀指標(biāo)的獲得，允許具有一定客 觀程度地規(guī)模化確定非正常腦部疾病的嚴(yán)重程度，預(yù)測結(jié)果，指導(dǎo)疾病的治療，以及監(jiān)測對(duì) 象反應(yīng)和恢復(fù)。此外，從許多對(duì)象獲得的這些信息允許獲得一定的對(duì)腦損傷機(jī)制的洞悉程 度。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)損傷的生物標(biāo)志物可以提供 給醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室研究可量化的神經(jīng)化學(xué)標(biāo)志物，以幫助不僅確定損傷的嚴(yán)重程度和細(xì) 胞病理學(xué)，而且提供了治療干預(yù)的替代標(biāo)志物。雖然已經(jīng)提出了許多用于創(chuàng)傷性腦損 傷的潛在生化標(biāo)志物(Pineda et al.，2007年)，數(shù)項(xiàng)研究都集中在將α II-血影蛋白 (α Il-spectrin)蛋白水解的降解產(chǎn)物作為嚙齒類(Pike et al. ,2004 ；Ringger et al.， 2004年)和人類(Pineda et al.，2007)CNS損傷的生物標(biāo)志物。許多生物標(biāo)志物已確定為 與經(jīng)常在車輛碰撞和沖突中受傷的對(duì)象中看到的嚴(yán)重的創(chuàng)傷性腦損傷相關(guān)。這些生物標(biāo)志 物包括血影蛋白降解產(chǎn)物例如SBDP150、SBDP150i, SBDP145 (鈣蛋白酶介導(dǎo)的急性神經(jīng)細(xì) 胞壞死)、SBDP120 (半胱天冬酶介導(dǎo)的遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡)、UCH-Ll (神經(jīng)細(xì)胞體損害標(biāo) 志物)和MAP - 2樹突狀細(xì)胞損傷相關(guān)標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物的性質(zhì)詳細(xì)描述在美國專 利US7, 291，710和US7, 396，654中，其內(nèi)容在此通過參考納入。如果對(duì)理論或模型沒有限制，提出的MTBI和TBI的劃界是損傷后在生物液體中 的分子標(biāo)志物的可識(shí)別的增加或減少。分子標(biāo)志物的說明性的例子包括Kobeissy冊(cè)，et al. , MoI Cell Proteomics, 2006; 5 1887-1898所描述的那些標(biāo)志物。提出的TBI的定 義是實(shí)驗(yàn)TBI (帶有在1. 6mm凹陷深度大腦皮層可控碰撞的大鼠大腦皮層可控碰撞，相當(dāng)于 人類嚴(yán)重TBI) 48小時(shí)后，在皮層組織中存在至少兩倍增加或減少水平的至少一種可識(shí)別 的分子標(biāo)志物。α II-血影蛋白(α Il-spectrin)的降解產(chǎn)物(SBDP)是TBI的潛在蛋白生物標(biāo)志 物。α II-血影蛋白主要富集在大腦中，位于神經(jīng)元內(nèi)而不是神經(jīng)膠質(zhì)中。此外，α II-血 影蛋白顯示位于神經(jīng)軸突中(Czogalla and Sikorski, 2005 ；Riederer et al.，1986)。 α II-血影蛋白由兩個(gè)半胱氨酸蛋白酶鈣蛋白酶(calpain)和半胱天冬酶(caspase)酶 切。鈣蛋白酶，在休眠細(xì)胞中靜態(tài)存在，響應(yīng)細(xì)胞外鈣的顯著升高而誘導(dǎo)至過度激活狀態(tài)， 伴隨TBI(Fineman et al.，1993)。這種酶將α II-血影蛋白切割為150和145 kDa片段。 鈣蛋白酶的蛋白水解主要與脹亡壞死有關(guān)(Kampfl et al. , 1997 ；Liu et al. ,2004 ；Wang,2002)。半胱天冬酶，其激活與細(xì)胞凋亡有關(guān)，將血影蛋白切割為不同的150和120 kDa片段 (Pike et al. ,2001 ；ffang,2000)o這種差別切割不僅允許血影蛋白切割酶響應(yīng)損傷的CNS 特異的過度激活的指示，而且允許作為損傷病理的促成因素的壞死和/或凋亡的相對(duì)重要 性的評(píng)估。因此，這些SBDPs可以考慮作為用于TBI的生物標(biāo)志物(Wang et al. , 2005)。研究TBI病理的興奮毒性機(jī)制的先前研究集中在神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸鹽上。然而， 相當(dāng)多的證據(jù)表明乙酰膽堿相關(guān)的毒性在CNS病理中也同樣非常重要。與腦創(chuàng)傷相關(guān)的 乙酰膽堿(ACh)水平的增加已經(jīng)在50年前在實(shí)驗(yàn)室及臨床環(huán)境進(jìn)行了記錄(Bornstein， 1946 ；Sachs, 1957)。注意到相對(duì)更高的神經(jīng)遞質(zhì)水平與損害的增加的嚴(yán)重性相關(guān)(Tower and McEachern，1949)。除了通過使用類膽堿(cholinomimetics)導(dǎo)致毒蕈堿膽堿能受體 (muscarinic cholinergic receptor) WSι^/Κ5FWiw^tiM(Olney et al. , 1983 ； Turski et al.，1983)外，最近的研究還證實(shí)實(shí)驗(yàn) TBI (Gorman et al.，1989; Lyeth et al. , 1993a)和缺血(Kumagae and Matsu，1991)后腦脊髓液(CSF)中升高的乙酰膽堿。幾 項(xiàng)研究還證實(shí)毒蕈堿拮抗劑的緊急施用改善實(shí)驗(yàn)TBI后的行為恢復(fù)(Lyeth et al. , 1988a ； Lyeth et al. ,1988b ；Lyeth and Hayes,1992 ；Lyeth et al.,1993b ；Robinson et al., 1990)。雖然已經(jīng)提出了幾個(gè)潛在的標(biāo)志物，沒有明確的標(biāo)志物或方法表明能夠診斷和區(qū) 分MTBI和TBI或證明治療施用的成功或治療優(yōu)勢。如果個(gè)體還受到多器官損傷，這個(gè)缺陷 更加明顯。此外，腦損傷通常難以有效治療，成功的結(jié)果通常取決于個(gè)體如何被迅速地診斷 出特定的損傷亞型。因此，存在需要用于TBI的具有評(píng)價(jià)沖擊后顱內(nèi)病理診斷能力的敏感 和特異的生化標(biāo)志物，以改善病人管理和促進(jìn)治療評(píng)價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
提供了一種用于診斷和治療對(duì)象中神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)明方法，包括分析對(duì)象的生 物樣品以檢測一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的存在；基于樣品中一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的比例診 斷神經(jīng)系統(tǒng)疾??；和對(duì)對(duì)象施用治療物以改變一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的比例。本發(fā)明診斷 許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如腦損傷或多器官損傷。優(yōu)選地，本發(fā)明方法在診斷沖擊腦損傷、缺血 性中風(fēng)和多器官損傷中是有用的。一個(gè)或更多生物標(biāo)志物用在本發(fā)明中，說明性地包括α-II血影蛋白；血影蛋白 降解產(chǎn)物；ΜΑΡ2 ；神經(jīng)元退化；泛素羧基末端酯酶；泛素羧基末端水解酶；位于神經(jīng)元的細(xì) 胞內(nèi)蛋白；MAP-taU;C-taU;聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP);腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)停蛋白；其降 解產(chǎn)物；其衍生物，和它們的組合。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，生物標(biāo)志物是泛素羧基末端水 解酶、血影蛋白降解產(chǎn)物或MAP2。本發(fā)明方法檢測生物標(biāo)志物相對(duì)于相同的蛋白標(biāo)志物或不同的蛋白標(biāo)志物的已 知或測定的基底水平的比例。嚴(yán)重?fù)p傷與輕度損傷區(qū)分開，因?yàn)閲?yán)重?fù)p傷顯示相相對(duì)于基 底水平2倍或更多生物標(biāo)志物的比例，而輕度損傷顯示相對(duì)于基底水平小于2倍生物標(biāo)志 物的比例?？蛇x地，如果生物標(biāo)志物與基底水平的比例小于0.5，區(qū)分出損傷的嚴(yán)重性。許多治療物在這里是可操作的。優(yōu)選地，治療物是毒蕈堿受體激動(dòng)劑(muscarinic receptor agonist)。治療物的說明性的例子包括雙環(huán)胺(dicyclomine)，東莨菪堿 (scoplamine)，米拉美林(milameline)，N -甲基-4 -哌啶二苯乙醇酸鹽或酯NMP(N_me
7thy 1-4-piperidinylbenzilate NMP)；匹魯卡品(pilocarpine),喊倉西平(pirenzepine)， 乙酰膽堿(acetylcholine),乙酰甲膽堿(methacholine)，卡巴膽堿(carbachol)，烏拉 II MCbethanechol), # M M (muscarine), M^itMMMM ^ (oxotremorine Μ), M^itM 顫素(oxotremorine)，毒胡蘿卜素(thapsigargin)，鈣通道阻滯劑或激動(dòng)劑(calcium channel blockers or agonists), M 古 丁，占 i若美 #(xanomeline), BuTAC, M M 5F (clozapine),奧氮平(olanzapine),西維美林(cevimeline),醋克立定(aceclidine),模 榔堿(arecoline)，托特羅定(tolterodine)，羥雙環(huán)凡林(rociverine)，IQNP，吲哚生物堿 (indole alkaloids),^ΕΦ(himbacine), cyclostellettamines,^tj^lJ^llif^MIJ 以及它們的組合。生物樣品優(yōu)選腦脊髓液(cerebrospinal fluid)或血清。還提供了用于區(qū)分對(duì)象中神經(jīng)損傷程度的組合物。一種發(fā)明組合物說明性地包括 從懷疑具有損害的神經(jīng)細(xì)胞的對(duì)象分離的生物樣品，生物樣品在從對(duì)象分離之前是一種與 對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)連通的液體；和至少兩個(gè)增加的抗體，其特異地、獨(dú)立地結(jié)合至選自α-II 血影蛋白、α -II血影蛋白降解產(chǎn)物(SBDP)、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2蛋白的至少兩個(gè) 生物標(biāo)志物。本發(fā)明組合物的對(duì)象可選的是哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，對(duì)象是人。本發(fā)明組合物可選地包括生物標(biāo)志物固定其上的基體。本發(fā)明組合物可選地包括 至少一個(gè)可檢測的標(biāo)記，其可選地偶聯(lián)至至少兩個(gè)抗體。標(biāo)記優(yōu)選地偶聯(lián)至特異結(jié)合至少 兩個(gè)抗體的物質(zhì)。還提供了用于分析對(duì)象中細(xì)胞損害的試劑盒。一種發(fā)明試劑盒說明性地包括用于 連接從懷疑具有損害的神經(jīng)細(xì)胞的對(duì)象分離的生物樣品中的生物標(biāo)志物的基體，生物樣品 在從對(duì)象分離之前是一種與對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)連通的液體；至少兩個(gè)抗體，其特異地、獨(dú)立地 結(jié)合至選自α-ΙΙ血影蛋白、α-ΙΙ血影蛋白降解產(chǎn)物(SBDP )、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2 蛋白的至少兩個(gè)生物標(biāo)志物；和用于將抗體與生物樣品或一部分生物樣品反應(yīng)以檢測生物 樣品中標(biāo)志物的存在或量的操作指南。本發(fā)明試劑盒的對(duì)象可選的是哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，對(duì)象是人。本發(fā)明試劑盒可選地包括至少一個(gè)可檢測的標(biāo)記，其可選地偶聯(lián)至至少兩個(gè)抗 體。標(biāo)記優(yōu)選地偶聯(lián)至特異結(jié)合至少兩個(gè)抗體的物質(zhì)。提供了一種用于診斷對(duì)象中神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。本發(fā)明方法包括第一次測量從 對(duì)象獲得的生物樣品中泛素羧基末端水解酶的量和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物 的量；和將泛素羧基末端水解酶的量和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的量與泛素羧 基末端水解酶和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的基底水平進(jìn)行比較從而診斷對(duì)象 的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本發(fā)明方法的測量優(yōu)選地通過免疫測定。優(yōu)選地，樣品是腦脊髓液或血清。一個(gè) 另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物優(yōu)選地是血影蛋白降解產(chǎn)物、MAP - 2、SBDP 150、SBDP 145或 SBDP 120，或神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白。本發(fā)明方法可選地包括第二次測量泛素羧基末端水解酶的第二量和至少一個(gè)另 外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的第二量，以產(chǎn)生泛素羧基末端水解酶和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活 性生物標(biāo)志物的動(dòng)力學(xué)曲線?？蛇x地，本發(fā)明過程還包括比較對(duì)象中和與對(duì)象相同性別的其它個(gè)體中正常水平之間泛素羧基末端水解酶的量和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志 物的量。還提供了一種用于診斷和治療對(duì)象中多器官損傷的方法。本發(fā)明方法包括分析來 自對(duì)象的生物樣品以檢測多個(gè)生物標(biāo)志物；基于所述生物樣品中所述多個(gè)生物標(biāo)志物的第 一比例確定第一器官損傷的第一亞型；基于所述生物樣品中所述多個(gè)生物標(biāo)志物的第二比 例確定第二器官損傷的第二亞型；施用至少一治療拮抗劑，其有效抑制響應(yīng)第一器官損傷 的所述第一亞型釋放的蛋白的活性，或者至少一治療激動(dòng)劑，其有效促進(jìn)響應(yīng)第一器官損 傷的所述第一亞型釋放的蛋白的活性；和施用至少一治療拮抗劑，其有效抑制響應(yīng)第二器 官損傷的所述第二亞型釋放的蛋白的活性，或者至少一治療激動(dòng)劑，其有效促進(jìn)響應(yīng)第二 器官損傷的所述第二亞型釋放的蛋白的活性。本發(fā)明方法的蛋白可選地是半胱天冬酶或鈣蛋白酶。優(yōu)選地，蛋白是半胱天冬 酶-3(CapaSe-3)。優(yōu)選地，多個(gè)生物標(biāo)志物是與所述第一和所述第二器官的至少之一的損 傷相關(guān)的細(xì)胞降解產(chǎn)物。本發(fā)明方法中的損傷優(yōu)選地是沖擊損傷或中風(fēng)。治療物優(yōu)選地是雙環(huán)胺。還提供了一種用于診斷和治療對(duì)象中創(chuàng)傷性腦損傷的方法，包括分析對(duì)象組織或 液體以檢測一個(gè)或更多血影蛋白降解產(chǎn)物和施用雙環(huán)胺。較佳地，創(chuàng)傷性腦損傷是中風(fēng)。更 佳地，損傷是缺血性中風(fēng)?？蛇x地，損傷是沖擊腦損傷。


圖1表示CCI后在大鼠CSF中UCHLl的定量western雜交； 圖2表示MCAO后在大鼠CSF中UCHLl的定量western雜交；
圖3表示在假損傷處理和CCI處理對(duì)象的CSF中UCHLl的水平；
圖4表示假損傷處理、輕度MACO激發(fā)和嚴(yán)重MACO激發(fā)后在CSF中UCHLl的水平；
圖5表示在假損傷處理或CCI后在不同時(shí)間點(diǎn)血清中UCHLl的水平；
圖6表示假損傷處理、輕度MACO激發(fā)和嚴(yán)重MACO激發(fā)后血清中UCHLl的水平；
圖7表示假損傷處理、輕度MACO激發(fā)和嚴(yán)重MACO激發(fā)后CSF和血清中SBDP 145的水
平；
圖8表示假損傷處理、輕度MACO激發(fā)和嚴(yán)重MACO激發(fā)后CSF和血清中SBDP 120的水
平；
圖9表示假損傷處理、輕度MACO激發(fā)和嚴(yán)重MACO激發(fā)后CSF和血清中MAP2的水平； 圖10表示CCI后雙環(huán)胺對(duì)CSF中SBDPs的效果；
圖11表示CCI后在雙環(huán)胺存在或不存在情況下在神經(jīng)元細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明在診斷和處理異常的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有用處。具體來說，該發(fā)明在使用 診斷程序?qū)膊』驌p傷亞型，特別是創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)亞型，單獨(dú)或與多器官損傷一起進(jìn) 行分類，并確定對(duì)于對(duì)象經(jīng)受的特定的創(chuàng)傷性腦損傷亞型有效的潛在治療物中具有用處。 本發(fā)明和在這里使用的定義為診斷治療TBI方法。本診斷治療方法涉及分析細(xì)胞蛋白酶或它們的組合的過度激活或激活不足，以確認(rèn)腦損傷說明性地包括MTBI和TBI的亞型。示例性的蛋白或蛋白的組合包括鈣蛋白酶；泛 素羧基末端酯酶例如Ll (UCHLl)；導(dǎo)致血影蛋白降解產(chǎn)物如SBDP150、SBDP145和SBDP120 的其它蛋白酶；位于神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)蛋白MAP-tau ；C-tau ；MAP2 ；聚(ADP-核糖)聚合酶 (PARP)；腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)停蛋白2 (CRMP-2)；和半胱天冬酶如半胱天冬酶_3等等。腦損傷發(fā)生經(jīng)歷損傷誘導(dǎo)、造成損害和臨床結(jié)果的嚴(yán)重變化。確定能夠區(qū)分損傷 嚴(yán)重性的分子標(biāo)志物對(duì)于確定選擇用于促進(jìn)最大恢復(fù)的治療物或治療的類型和迫切性是 必要的。幾個(gè)潛在的標(biāo)志物此前已提出包括乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)、膠質(zhì)纖 維酸性蛋白、烯醇酶(enolase)和S-100B。這些標(biāo)志物沒有一個(gè)單獨(dú)具有足夠特異性或魯 棒性從而在臨床上取得成功。通過闡明物理或化學(xué)應(yīng)力后響應(yīng)腦細(xì)胞的生化啟動(dòng)或抑制信號(hào)，可以闡明一系列 預(yù)期有效的化合物的一個(gè)或更多的有效性。通過實(shí)例的方式，鈣激活胞質(zhì)蛋白酶鈣蛋白酶 已知在細(xì)胞壞死損傷之前激活，而半胱天冬酶已知在細(xì)胞凋亡損傷前激活，并牽連到降解 腦細(xì)胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致作為TBI級(jí)聯(lián)的一部分的組織自身消化?？衫斫?，除了蛋白酶，通過蛋白酶在暴露于TBI的組織上的作用產(chǎn)生的降解產(chǎn)物 (breakdown products，BDP)在鑒定TBI的亞型中作為標(biāo)志物也是有效的。有了這個(gè)診斷 信息，然后可以施用響應(yīng)TBI而改變生化濃度的特定蛋白酶或其它化合物的激動(dòng)劑或拮抗 劑。在鈣蛋白酶和半胱天冬酶_3的TBI級(jí)聯(lián)的情況下，TBI后鈣蛋白酶和半胱天冬酶抑制 劑的施用對(duì)與TBI相關(guān)的急性和遲發(fā)性腦細(xì)胞損傷或死亡提供神經(jīng)保護(hù)。蛋白酶活性可選地通過利用調(diào)節(jié)發(fā)生在所期望的蛋白活動(dòng)上游的細(xì)胞活動(dòng)從而 控制、監(jiān)測或以其它方式改變蛋白的表達(dá)水平或活性來進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，Ml毒蕈堿受體激 活的調(diào)節(jié)被認(rèn)為具有許多的下游細(xì)胞影響。這些影響被認(rèn)為是來自受體配體結(jié)合后與β Y 亞基復(fù)合物分離的Ml毒蕈堿受體G蛋白的α Λι亞基。α亞基激活磷脂酶(Xphospholipase C, PLC),使得磷脂酰肌醇 4，5 二 磷酸(phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate， PIP2)水解成 1，4，5 三磷酸肌醇(inositol 1，4，5 trisphosphate, IP3)和甘油二酯 (diacylglycerol,DG)0 IP3刺激細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣離子的釋放。DAG激活磷酸化許多蛋白包括 離子通道和NMDA受體復(fù)合物的PKC。B y G蛋白亞基抑制蕈毒堿(Ikgo)和鈣調(diào)節(jié)(IK(Ca)) 的鉀流，其通過增大去極化增加細(xì)胞興奮性(Lyeth，2001)。幾項(xiàng)研究提供了令人信服的證 據(jù)表明PIP2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在TBI后激活。Wei和其同事(Wei et al.，1982)首次報(bào)道 在貓中液壓沖擊TBI后立即PLC激活。后來的在大鼠側(cè)向液壓沖擊模型中的研究發(fā)現(xiàn)在損 傷5分鐘后在同側(cè)海馬中IP3水平升高，在同側(cè)皮層長達(dá)20分鐘(Prasad et al.，1994)。 隨后的研究測量了在大鼠中液壓沖擊TBI后膜PIP2的磷酸二酯的降解，發(fā)現(xiàn)當(dāng)DG升高時(shí) 組織PIP2W濃度顯著減少(Dhillon et al.，1995)。后來的研究毒蕈堿受體與PLC信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路的TBI誘導(dǎo)激活之間的聯(lián)系的研究發(fā)現(xiàn)損傷時(shí)用東莨菪堿進(jìn)行毒蕈堿受體的藥理 阻斷顯著減弱PIP2S生脂肪酸的急劇減少(Lyeth et al.，1996)。因此，Ml受體的激活與 增強(qiáng)的興奮性調(diào)節(jié)相關(guān)，盡管細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高、NMDA受體敏感性擴(kuò)大和增加的神經(jīng)元的 興奮性。為了本主題發(fā)明的目的，腦損傷分為兩級(jí)，輕度創(chuàng)傷性腦損傷(mild traumatic brain injury, MTBI)和創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)。TBI 定義為與分 子標(biāo)志物水平或活性2倍增加或大于2倍減少或更大相關(guān)聯(lián)的損傷。MTBI定義為與分子標(biāo)
10志物水平或活性小于2倍增加或2倍減少相關(guān)聯(lián)的損傷。如在這里所使用的，損傷是在細(xì)胞或分子完整性、活性、水平、魯棒性、狀態(tài)的改 變，或其它可追溯至一個(gè)事件的改變。損傷說明性地包括物理的、機(jī)械的、化學(xué)的、生物的、 功能的、感染的或其它的細(xì)胞或分子特性的調(diào)節(jié)物。事件說明性的是，物理創(chuàng)傷例如碰撞 (沖擊)或生物異常例如血管閉塞或滲漏造成的中風(fēng)。事件可選的是由感染源導(dǎo)致的感染。 本領(lǐng)域技術(shù)人員知道由術(shù)語損傷或事件包含的許多相當(dāng)?shù)氖录p傷可選的是物理事件例如沖擊碰撞。碰撞是類似沖擊損傷，例如擊打頭部，從而 要么顱骨結(jié)構(gòu)完整，要么導(dǎo)致其破裂。實(shí)驗(yàn)上，使用的幾種碰撞方法說明性地包括在1.6mm 凹陷深度的可控的皮層碰撞(controlled cortical impact，CCI)，相當(dāng)于人類的嚴(yán)重TBI。 這種方法由 Cox, CD, et al. , J Neurotrauma, 2008; 25(11) 1355-65 所詳細(xì)描述?？?理解，其它產(chǎn)生碰撞創(chuàng)傷的實(shí)驗(yàn)方法同樣是可操作的。TBI也可以來自中風(fēng)。缺血性中風(fēng)可選地通過在嚙齒類動(dòng)物中大腦中動(dòng)脈閉塞 (middle cerebral artery occlusion，MCA0)進(jìn)行模型制作。UCHLl蛋白水平，例如，在輕度 MACO后增加了，其在嚴(yán)重MACO激發(fā)后進(jìn)一步增加。輕度MACO激發(fā)可以導(dǎo)致蛋白水平在兩 小時(shí)內(nèi)瞬時(shí)增加，在24小時(shí)內(nèi)回至對(duì)照水平。與此相反，嚴(yán)重MACO激發(fā)導(dǎo)致蛋白水平在損 傷后兩小時(shí)內(nèi)增加，可能是更加持久的，統(tǒng)計(jì)學(xué)上表明顯著水平達(dá)到72小時(shí)或更長時(shí)間。分子標(biāo)記物可選地稱為生物標(biāo)志物，在這里交替使用。生物標(biāo)志物是測量生物 活性或反應(yīng)有用的細(xì)胞、蛋白、核酸、類固醇、脂肪酸、代謝物或其它區(qū)分物。在這里可操 作以區(qū)分MTBI和TBI的生物標(biāo)志物說明性地包括泛素羧基末端酯酶，泛素羧基末端 水解酶，血影蛋白降解產(chǎn)物，位于神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)蛋白，MAP-tau, C-tau，MAP2，聚(ADP -核糖)聚合酶(PARP)，腦衰蛋白響應(yīng)調(diào)停蛋白，UCHL1，膜聯(lián)蛋白All (Annexin All), 酸脫氫酶家族 7 (Aldehyde dehydrogenase family 7)，絲切蛋白 1 (Cofilin 1)，前 纖維蛋白 1 (Profilin 1), http://www. mcponline. org/cgi/external_ref access_ num=XP_227366&link_type=GENa -烯醇酶(非神經(jīng)烯醇酶(non-neural enolase))，烯醇 酶1蛋白，三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),己糖激 酶 1 (Hexokinase 1)，順烏頭酸酶 2 (Aconitase 2)，線粒體(mitochondrial )，乙酰輔酶 A 合成酶 2 (Acetyl-CoA synthetase 2)，神經(jīng)元蛋白 22 (Neuronal protein 22)，磷酸甘 油酸酉旨激酶2 (Phosphoglycerate kinase 2)，磷酸甘油酸酉旨激酶1 (Phosphoglycerate kinase 1), Hsc70_psl,谷氨酸脫氧酶(Glutamate dehydrogenase),酸縮酶 A (Aldolase A)，醛縮酶 C (Aldolase C)，果糖 二磷酸(fructose-biphosphate)，二 甲基精氨酸二 甲氨水解酶 2 (Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1)，微管相關(guān)蛋白 2 (Microtubule-associated protein 2)，碳酸 ff (Carbonic anhydrase), ADP W ^ 化因子3 (ADP-ribosylation factor 3)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)，肝再生相關(guān)蛋白 (Liver regeneration-related protein)，血紅蛋白 α (Hemoglobin α—chain)，血紅 蛋白β鏈(Hemoglobin β chain)，肝再生相關(guān)蛋白，胎球蛋白β (Fetuin β)，3_含氧 酸輔酶 A 轉(zhuǎn)移酶(3-0xoacid-CoA transferase),蘋果酸脫氧酶(Malate dehydrogenase 1)，NAD (可溶的)，乳酸脫氫酶B (Lactate dehydrogenase B)，蘋果酸脫氫酶，線粒體，羧 酸酯酶El前體(Carboxylesterase El precursor)，絲氨酸蛋白酶抑制劑α 1 (Serine protease inhibitor α 1)，結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin)，泛素羧基末端水解酶Li，絲氨
11酸蛋白酶抑制劑2a，T型激肽原(T-kininogen)，α 1主要急性期蛋白(α 1 major acute phase protein), http://www.mcponline. orR/cRi/external ref access num=XP AAH85359&link type=GEN 白蛋白(Albumin), http://www. mcponl ine. org/cgi/external_ ref access_num=NP_001009628&link_type=GENa 1 主要急性期蛋白前肽(pr印印tide)， Murinoglobulin 1 類似物，特殊基團(tuán)成分蛋白(Group-specific component protein),鳥 苷二磷酸解離抑制因子 1 (Guanosine diphosphate dissociation inhibitor 1)，腦衰蛋 白響應(yīng)調(diào)停蛋白2，Murinoglobulin 1類似物，亞鐵氧化酶(Ferroxidase)，血漿銅藍(lán)蛋白 (Ceruloplasmin)，血影蛋白α鏈，腦，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein)，大腦肌酸激酶 (Brain creatine kinase),蛋白體亞基(Proteasome subunit), α type7，14—3—3 蛋白， 突觸結(jié)合蛋白(Synaptotagmin)，其亞型，其片段，其降解產(chǎn)物，或其組合。其它潛在的生物 標(biāo)志物說明性地包括 Kobeissy, FH, et al, Molecular & Cellular Proteomics, 2006; 5:1887-1898確定的那些標(biāo)志物，其內(nèi)容在這里通過參考并入，或其它現(xiàn)有技術(shù)中已知的生 物標(biāo)志物。優(yōu)選地，生物標(biāo)志物是有選擇性的用于檢測或診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如腦損傷等。 更優(yōu)選地，生物標(biāo)志物是既特異性的又有效的用于檢測和區(qū)分TBI級(jí)別。這種生物標(biāo)志物 可選地稱為神經(jīng)活性生物標(biāo)志物。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，在這里可操作的生物標(biāo)志物說 明性的是血影蛋白降解產(chǎn)物(SBDP) SBDP 150, SBDP 150i, SBDP 145 (鈣蛋白酶介導(dǎo)的急性 神經(jīng)細(xì)胞壞死)，SBDP120 (半胱天冬酶介導(dǎo)的遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡)，UCHLl (神經(jīng)元細(xì)胞體 損害標(biāo)志物)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和MAP - 2樹突狀細(xì)胞損傷相關(guān)標(biāo)志物?？衫斫?，生物標(biāo)志物存在或活性的時(shí)間性質(zhì)作為TBI亞型的指標(biāo)或區(qū)分物是可操 作的。在非限制性的實(shí)例中，實(shí)驗(yàn)的大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)的嚴(yán)重性與CSF中UCHLl的短 暫保持相關(guān)聯(lián)。30分鐘的MCAO產(chǎn)生短暫的UCHLl水平，6小時(shí)達(dá)到高峰，然后迅速下降，而 2小時(shí)的MCAO產(chǎn)生持續(xù)多達(dá)三天的UCHLl水平。同樣的，損傷后在不同時(shí)間點(diǎn)的其它生物 標(biāo)志物的流行去區(qū)分TBI亞型是可操作的。生物標(biāo)志物分析優(yōu)選使用生物樣品或液體進(jìn)行。在這里可操作的生物樣品說明性 地包括細(xì)胞、組織、腦脊髓液(CSF)、人工CSF、全血、血清、血漿、細(xì)胞內(nèi)液體、尿液、糞便、胃 液、消化液、唾液、鼻腔或其它呼吸道液體、陰道分泌物、精液、緩沖生理鹽水、生理鹽水、水 或本領(lǐng)域認(rèn)可的其它生物液體。除了增加的細(xì)胞表達(dá)，生物標(biāo)志物也出現(xiàn)在與受損細(xì)胞流通的生物液體中。從對(duì) 象獲得生物液體例如腦脊髓液(CSF)、血液、血漿、血清、唾液和尿液通常比獲得固體組織活 體檢視樣品具有更少的侵害性和痛苦。因此，是生物液體的樣品優(yōu)選用在本發(fā)明中。尤其， CSF優(yōu)選用于檢測對(duì)象中神經(jīng)損害，因?yàn)樗侵苯咏佑|神經(jīng)系統(tǒng)并且是很容易獲得的。可理 解，血清是優(yōu)選的生物樣品，因?yàn)樗歉菀椎玫降?，并顯示出對(duì)供體對(duì)象更少的進(jìn)一步損 傷或副作用的風(fēng)險(xiǎn)。生物樣品優(yōu)選從一個(gè)過更多對(duì)象獲得。生物樣品通過常規(guī)技術(shù)從對(duì)象獲得。例 如，CSF通過腰椎穿刺(lumbar puncture)獲得。血液通過靜脈穿刺(venipuncture)獲 得，而血漿及血清通過根據(jù)已知方法分離全血獲得。用于獲得固體組織樣品的外科手術(shù) 是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，用于獲得神經(jīng)系統(tǒng)組織樣品的方法由描述在標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng) 外科教科書例如神經(jīng)外科文集顱骨和血管程序的基本方法(Atlas of Neurosurgery:Basic Approaches to Cranial and Vascular Procedures, by F. Meyer, Churchill Livingstone, 1999)；腦腫瘤的立體定位與圖像定向外科手術(shù)第1版(Stereotactic and Image Directed Surgery of Brain Tumors, 1st ed. , by David G. T. Thomas, WB Saunders Co. , 1993)；和顱骨顯微外科手術(shù)方法與技巧(Cranial Microsurgery: Approaches and Techniques, by L. N. Sekhar and E. De Oliveira, 1st ed. , Thieme Medical Publishing, 1999)中。用于獲取和分析腦組織的方法還描述在Belay et al.， Arch. Neurol. 58: 1673-1678 (2001)；和 Sei jo et al. , J. Clin. Microbiol. 38: 3892-3895 (2000)中。創(chuàng)傷后，神經(jīng)細(xì)胞與沒有經(jīng)受創(chuàng)傷的這種細(xì)胞相比在體外培養(yǎng)基中或在對(duì)象中 在原位表達(dá)出改變的水平或活性。因此，含有神經(jīng)細(xì)胞的樣品，例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周 邊神經(jīng)系統(tǒng)組織的活檢是適合用在本發(fā)明中的生物樣品。但是，除了神經(jīng)細(xì)胞，其它細(xì)胞 表達(dá)說明性的例如α II-血影蛋白，包括，例如，心肌細(xì)胞(cardiomyocyte)、骨骼肌細(xì)胞 (myocytes in skeletal muscles)、肝細(xì)胞(hepatocytes)、腎細(xì)胞(kidney cells)禾口睪丸 細(xì)胞(cells in testis)。包括這些細(xì)胞或從這些細(xì)胞分泌的液體的生物樣品也可以用在 改用于確定和/或特征化對(duì)這些非神經(jīng)細(xì)胞的損傷的本發(fā)明方法中。在這里使用的對(duì)象說明性地包括狗、貓、馬、牛，豬、綿羊、山羊、雞、非人類的靈長 類動(dòng)物、人類、大鼠、豚鼠、倉鼠和老鼠。由于本發(fā)明優(yōu)選涉及人類對(duì)象，用于本發(fā)明的方法 的優(yōu)選對(duì)象是人類。從本發(fā)明獲益最多的對(duì)象是那些懷疑已經(jīng)患有或存在危險(xiǎn)將患有異常神經(jīng)系統(tǒng) 疾病或損傷的那些對(duì)象，其例如創(chuàng)傷損傷(如槍傷、車禍、運(yùn)動(dòng)意夕卜、搖晃嬰兒綜合癥、其它 沖擊損傷)、缺血性事件(如中風(fēng)、腦出血、心臟停搏)、神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默氏癥、 亨丁頓舞蹈癥和帕金森氏癥；朊病毒相關(guān)疾??；癡呆的其它形式)、癲癇癥、藥物濫用(例如， 來自安非他明、迷魂藥(Ecstasy)/搖頭丸(MDMA)，或乙醇)、和周邊神經(jīng)系統(tǒng)病變?nèi)缣悄虿?神經(jīng)病變、化療引起的神經(jīng)病變及神經(jīng)性疼痛導(dǎo)致的腦損傷的受害者。為了提供神經(jīng)系統(tǒng)疾病和測量的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的量之間的關(guān)聯(lián)性，CSF或 血清是優(yōu)選的生物液體。說明性地，CSF或血清樣品從帶有進(jìn)行神經(jīng)活性生物標(biāo)志物測量 的樣品的對(duì)象采集。對(duì)象具有不同的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然后一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的檢測到 的水平與除了 GCS計(jì)分外承認(rèn)或標(biāo)準(zhǔn)的基底水平或可選的CT掃描結(jié)果相關(guān)聯(lián)。根據(jù)這些 結(jié)果，一種發(fā)明分析方法可選地得到發(fā)展和驗(yàn)證(Lee et al.，Pharmacological Research 23 312-328，2006)?？衫斫?，神經(jīng)活性生物標(biāo)志物，除了從CSF和血清中獲得外，還很容易 從血液、血漿、唾液、尿液以及固體組織活檢中獲得。而CSF由于直接接觸神經(jīng)系統(tǒng)因而是 優(yōu)選的采樣液體，可理解，在被采集用于其它目的時(shí)，其它生物液體具有優(yōu)勢從而允許創(chuàng)造 性地確定神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并作為在單個(gè)樣品例如血液、血漿、血清、唾液或尿液上進(jìn)行的一 系列測試的一部分。幾種生物標(biāo)志物的基底水平是在沒有已知的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的期望對(duì)象的物種中 的目標(biāo)生物樣品中獲得的那些水平。這些水平不需要用硬濃度(hard concentrations)表 示，相反可以從平行對(duì)照試驗(yàn)知道，并用熒光單位、密度單位等等表示。通常，在沒有神經(jīng)系 統(tǒng)疾病時(shí)，SBDPs在生物樣品以可以忽略不計(jì)的量存在。然而，UCHLl在神經(jīng)元中是高度豐 富的蛋白。確定特定物種的神經(jīng)元中UCHLl的基底水平在本領(lǐng)域中是已知的。同樣，確定MAP2的基底水平的濃度在本領(lǐng)域中是已知的。如在這里所使用的，術(shù)語“診斷”是指識(shí)別神經(jīng)或其它疾病如損傷或疾病是否存 在。診斷可選地指的是分析的結(jié)果，其中生物標(biāo)志物的特定比例或水平被檢測到或不存在。如在這里所使用的，“比例”要么是正比例，其中目標(biāo)的水平大于目標(biāo)在第二樣品 中的水平或已知或公認(rèn)的相同目標(biāo)的基底水平。負(fù)比例描述了目標(biāo)的水平小于目標(biāo)在第二 樣品中的水平或已知或公認(rèn)的相同目標(biāo)的基底水平。中性比例描述了目標(biāo)生物標(biāo)志物沒有 可觀察到的變化。如在這里所使用的，術(shù)語“施用”是輸送治療物至對(duì)象。該治療物由本領(lǐng)域技術(shù)人 員確定的對(duì)于特定對(duì)象合適的路徑進(jìn)行施用。例如，治療物是口服、非腸道(例如，靜脈的)、 通過肌肉注射、通過腹腔注射、瘤內(nèi)注射、通過吸入或經(jīng)皮施用的。治療物所需的確切的量 根據(jù)對(duì)象的不同而不同，取決于對(duì)象的年齡、體重和一般狀況，治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嚴(yán)重 性，使用的特定的治療物，施用方式等等。合適的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn) 結(jié)合本文教導(dǎo)或利用本領(lǐng)域知識(shí)而無需過度實(shí)驗(yàn)(undue experimentation)進(jìn)行確定。一種用于檢測生物樣本中一個(gè)或更多神經(jīng)活性生物標(biāo)志物存在與否的示例性的 方法涉及從對(duì)象例如人獲得生物樣品，將生物樣品接觸能夠檢測要分析的生物標(biāo)志物的化 合物或試劑，說明性地包括抗體或適體，并分析沖洗后化合物或試劑與樣品的結(jié)合?？衫?解，其它檢測方法也同樣可操作的，說明性地與蛋白或核酸特異性染色有聯(lián)系。在抗體或適 體的情況下，特異結(jié)合化合物或試劑的那些樣品表達(dá)出要分析的標(biāo)志物。本發(fā)明可選地用UCHLl或SBDP進(jìn)行描述?？衫斫?，這些標(biāo)志物只是用于說明目的， 并不意味著明示或暗示本發(fā)明的范圍限于UCHLl或SBDPs。—種發(fā)明方法可用于體外以及體內(nèi)檢測生物樣品中UCHLl和一個(gè)或更多其它神 經(jīng)活性生物標(biāo)志物。樣品中UCHLl或一個(gè)或更多其它神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的表達(dá)量與合 適的對(duì)照例如已知表達(dá)了要分析的標(biāo)志物的可檢測到的水平的第一樣品(陽性對(duì)照)和已 知沒有表達(dá)要檢測的標(biāo)志物的可檢測到的水平的第二樣品(陰性對(duì)照)進(jìn)行比較。例如， 用于檢測標(biāo)志物的體外技術(shù)包括免疫吸附測定法(ELISAs)、放射免疫測定法、放射性分析 (radioassay)、western雜交、Southern雜交、Northern雜交、免疫沉淀、免疫熒光、質(zhì)譜測 定、RT - PCR、PCR、液相色譜法、高效液相色譜法、酶活性測定法、細(xì)胞分析、正電子發(fā)射斷 層掃描技術(shù)、質(zhì)譜分析、其組合、或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)。此外，用于檢測標(biāo)志物的體內(nèi)技 術(shù)包括往生物樣品或測試對(duì)象導(dǎo)入特異性結(jié)合標(biāo)志物的標(biāo)記的試劑。例如，試劑可以用放 射性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，該放射性標(biāo)記在生物樣品或測試對(duì)象中的存在和位置可以通過標(biāo)準(zhǔn)成 像技術(shù)進(jìn)行檢測?？商禺愋越Y(jié)合UCHLl或其它生物標(biāo)志物的任何合適的分子和特異性結(jié)合一個(gè)或 更多神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的任何合適的分子在本發(fā)明中是可操作的。用于檢測UCHLl或一 個(gè)或更多其它神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的優(yōu)選的試劑是能夠結(jié)合至要分析的生物標(biāo)志物的抗 體，優(yōu)選地，抗體與可檢測的標(biāo)記偶聯(lián)。這種抗體可以是多克隆的或單克隆的。完整的抗體， 其片段(例如，？油或？(油’)2)，或其工程變體(如評(píng)力也可以使用。這種抗體可以是任何 免疫球蛋白類包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亞類。在這里可操作的抗體可選的是 單克隆的或多克隆的。抗體可選地進(jìn)行標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到許多標(biāo)記在這里是可操作的。標(biāo)記和標(biāo)記試劑盒是市售可得的，可選地從Invitrogen Corp, Carlsbad, CA得到。標(biāo)記說明 性地包括熒光標(biāo)記、生物素、過氧化物酶、放射性核苷酸(radionucleotides)、或本領(lǐng)域已 知的其它標(biāo)記。 基于抗體的分析優(yōu)選地用于分析生物樣品以檢測UCHLl和一個(gè)或更多其它神經(jīng) 活性生物標(biāo)志物的存在。合適的western雜交方法描述在下面的實(shí)例部分。如需更加快速 分析(在緊急醫(yī)療情況下可能是重要的)，可以使用免疫吸附測定法(如ELISA和RIA)和免 疫沉淀分析法。作為一個(gè)例子，生物樣品或其一部分是固定在基體例如硝化纖維或PVDF制 成的膜；或由聚苯乙烯或其它塑料聚合物制成的剛性基體例如微量滴定板上，基體與抗體 接觸，抗體在允許抗體結(jié)合至要分析的生物標(biāo)志物的條件下特異性結(jié)合UCHL1，或其它神經(jīng) 活性生物標(biāo)志物之一。清洗后，抗體在基體上存在表明樣品含有要分析的標(biāo)志物。如果抗 體直接偶聯(lián)可檢測的標(biāo)記，如酶、熒光或放射性同位素，標(biāo)記的存在可選地通過檢測用于可 檢測的標(biāo)記的底物來進(jìn)行檢測?；蛘?，結(jié)合標(biāo)志物特異性抗體的可檢測的標(biāo)記了的二抗加 至基體。清洗后可檢測的標(biāo)記在基體上存在表明樣品含有標(biāo)志物。
這些基本免疫測定法的無數(shù)變換在本發(fā)明中也是可操作的。這些變換包括生物標(biāo) 志物特異性抗體，而不是樣品固定在基體上，基體與偶聯(lián)有可檢測的標(biāo)記的UCHLl或另一 神經(jīng)活性生物標(biāo)志物在使得抗體結(jié)合至標(biāo)記的生物標(biāo)志物的條件下接觸。然后基體與樣品 在允許要分析的標(biāo)志物結(jié)合至抗體的條件下接觸。清洗后在基體上的可檢測的標(biāo)記的量的 減少表明樣品含有標(biāo)志物。雖然抗體因?yàn)槠鋸V泛的特性優(yōu)選使用在本發(fā)明中，特異性結(jié)合UCHLl或另一神 經(jīng)活性生物標(biāo)志物的任何其它合適的試劑(例如，肽，適體(aptamer)，或有機(jī)小分子)可選 地使用在上述免疫分析中代替抗體。例如，可以使用特異性結(jié)合α II血影蛋白和/或它 的SBDPs的一個(gè)或更多的適體。適體是基于核酸的結(jié)合特異性配體的分子。用于制備具 有特定結(jié)合特異性的適體的方法已知詳細(xì)描述在美國專利US5，475，096 ；US5, 670，637 ； US5, 696，249 ；US5, 270，163 ；US5, 707，796 ；US5, 595，877 ；US5, 660，985 ；US5, 567，588 ； US5, 683，867 ；US5, 637，459 ；及 US6, 011，020 中。在用于生物標(biāo)志物表達(dá)的診斷分析中可操作的許多可檢測的標(biāo)記在本領(lǐng)域中是 已知的。使用在用于檢測UCHLl或另一神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的方法中的試劑偶聯(lián)至可檢測 的標(biāo)記，例如，酶比如辣根過氧化物酶。標(biāo)記有辣根過氧化物酶的試劑可以通過加入在辣根 過氧化物酶存在下發(fā)生顏色變化的合適的底物來進(jìn)行檢測?？梢允褂玫钠渌鼛追N可檢測的 標(biāo)記是已知的。這些標(biāo)記的常見的例子包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光化合物、發(fā) 光化合物、膠體金、磁性粒子、生物素、放射性同位素和其它酶?？衫斫?，一抗/ 二抗系統(tǒng)可 選地用于檢測一個(gè)或更多生物標(biāo)志物。特異性識(shí)別一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的一抗暴露于可 能含有感興趣的生物標(biāo)志物的生物樣品。然后，識(shí)別一抗的類型或同型的帶有合適標(biāo)記的 二抗與樣品接觸從而實(shí)現(xiàn)樣品中一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的檢測。本發(fā)明采用將生物樣品中UCHLl和一個(gè)或更多其它神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的存在 或量與神經(jīng)細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度和/或類型相關(guān)聯(lián)的步驟。對(duì)于在實(shí)例中詳細(xì)描述的創(chuàng)傷 性腦損傷來說，生物樣品中UCHLl和一個(gè)或更多其它神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的量與神經(jīng)系統(tǒng) 疾病有關(guān)。一種協(xié)同測量UCHLl和一個(gè)或更多其它神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的發(fā)明方法的結(jié)果 可以幫助醫(yī)生確定損傷的類型和嚴(yán)重程度，并牽涉已被破壞的細(xì)胞類型。這些結(jié)果與CT掃
15描和GCS結(jié)果一致，但是是定量的，獲得更加迅速，并且成本低得多。本發(fā)明提供了將UCHLl的量和可選地至少一個(gè)其它神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的量與 一個(gè)或每一個(gè)正常水平相比較以確定對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的步驟。可理解，在軸突損傷標(biāo) 志物即一種SBDP的情況下，其它生物標(biāo)志物的選擇允許確定異常神經(jīng)系統(tǒng)疾病牽涉的神 經(jīng)細(xì)胞的類型，以及細(xì)胞死亡的本質(zhì)。本發(fā)明方法的實(shí)踐提供了一種測試，其可以幫助醫(yī)生 為了對(duì)象的最佳利益而確定合適的施用的治療物。雖然在實(shí)例中發(fā)現(xiàn)的隨后提供的數(shù)據(jù)是 關(guān)于全方位的創(chuàng)傷性腦損傷的，可理解，這些結(jié)果適用于缺血事件、神經(jīng)退行性疾病、朊病 毒相關(guān)疾病、癲癇病、化學(xué)病因及周邊神經(jīng)系統(tǒng)病變。性別差異可能出現(xiàn)在異常的對(duì)象神經(jīng) 系統(tǒng)疾病中。還提供了一種用于分析對(duì)象中細(xì)胞損害的方法，該法包括(a)基體，用于固定從 懷疑具有損害的神經(jīng)細(xì)胞的對(duì)象分離的樣品，樣品在從對(duì)象分離之前是與對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng) 連通的液體；(b) UCHLl特異性結(jié)合試劑；(c)可選的用于另一神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的結(jié)合 試劑；及(d)印刷的操作指南，用于將UCHLl試劑與生物樣品或生物樣品的一部分反應(yīng)以檢 測生物樣品中至少一生物標(biāo)志物的存在或量。本發(fā)明方法可用于為財(cái)務(wù)酬勞檢測神經(jīng)系統(tǒng) 疾病。本方法可選地包括可檢測的標(biāo)記，例如與試劑偶聯(lián)的標(biāo)記；或者與特異性結(jié)合試 劑的物質(zhì)例如二抗偶聯(lián)的標(biāo)記。本發(fā)明的診斷治療方法可選地包括可以改變目標(biāo)生物標(biāo)志物的一個(gè)或更多特征 的一個(gè)或更多治療物的存在。治療物可選地是作為目標(biāo)生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物的上游效 應(yīng)子的激動(dòng)劑或拮抗劑。治療物可選地影響生物標(biāo)志物的下游功能。例如，乙酰膽堿(Ach) 在由疾病引起的神經(jīng)元興奮中起作用，TBI誘導(dǎo)的毒蕈堿膽堿能受體激活可能有助于興奮 毒性過程。因此，生物標(biāo)志物可選地包括Ach或毒蕈堿受體的水平或活性?？蛇x地，可操作 的生物標(biāo)志物是由毒蕈堿受體的活性影響的分子、蛋白、核酸或其它物質(zhì)。因此，在本目標(biāo) 發(fā)明中可操作的治療物說明性地包括調(diào)節(jié)毒蕈堿受體激活的各個(gè)方面的那些物質(zhì)。作為治療目標(biāo)或治療目標(biāo)調(diào)節(jié)物的可操作的具體毒蕈堿受體包括Ml、M2、M3、M4 和M5毒蕈堿受體。毒蕈堿膽堿能受體通路在檢測和治療TBI中的合適性產(chǎn)生于證明實(shí)驗(yàn)TBI (Gorman et al. , 1989; Lyeth et al. , 1993a)禾口缺血(Kumagae and Matsui, 1991)后在 大腦腦脊髓液(CSF)中ACh升高的研究，以及通過施用類膽堿(cholinomimetics)，毒蕈堿 膽堿能受體激活的高水平的損傷本質(zhì)(Olney et al.，1983; Turski et al.，1983)。此 外，實(shí)驗(yàn)TBI后毒蕈堿拮抗劑的緊急施用改善行為恢復(fù)(Lyeth et al. , 1988a; Lyeth et al. , 1988b; Lyeth and Hayes, 1992; Lyeth et al. , 1993b; Robinson et al. , 1990)。在本目標(biāo)發(fā)明中可操作的治療物說明性的是任何分子、化合物、家族、提取物、溶 液、藥物、藥物前體，或其它機(jī)制，其可操作的用于改變，優(yōu)選改善，處于神經(jīng)元損傷例如TBI 或MTBI危險(xiǎn)或是神經(jīng)元損傷例如TBI或MTBI的受害者的對(duì)象的治療結(jié)果。治療物可選地 是毒蕈堿膽堿能受體調(diào)節(jié)物，例如激動(dòng)劑或拮抗劑。激動(dòng)劑或拮抗劑可以是直接的或間接 的。間接激動(dòng)劑或拮抗劑可選的是降解或合成乙酰膽堿的分子，或其它毒蕈堿受體相關(guān)分 子，說明性的是目前用于治療阿爾茨海默病的分子。膽堿類似物(Cholinic mimetics)或 類似分子在這里是可操作的。在這里可操作的治療物的示例性的列表包括雙環(huán)胺，東莨菪
16堿，米拉美林，N -甲基-4-哌啶二苯乙醇酸鹽或酯NMP ；匹魯卡品，哌侖西平，乙酰膽堿，乙 酰甲膽堿，卡巴膽堿，烏拉膽堿，毒蕈堿，氧化震顫素M,氧化震顫素，毒胡蘿卜素，鈣通道阻 滯劑或激動(dòng)劑，尼古丁，占諾美林，BuTAC，氯氮平，奧氮平，西維美林，醋克立定，檳榔堿，托 特羅定，羥雙環(huán)凡林，IQNP,吲哚生物堿，喜巴辛，cyclostellettamines,其衍生物，其前體 藥物，以及它們的組合。治療物可選的是可操作的去改變鈣蛋白酶或半胱天冬酶的水平或 活性的分子。這種分子和它們的施用在本領(lǐng)域中是已知的?！N發(fā)明診斷治療方法說明性地包括用于診斷對(duì)象中神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，用于 治療具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的對(duì)象的方法，或兩者均包括。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，發(fā)明方法說 明性地包括從對(duì)象獲得生物樣品。生物樣品通過本領(lǐng)域已知的機(jī)制進(jìn)行分析以檢測或確定 生物樣品中一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的存在?；谏飿悠分猩飿?biāo)志物的量或存在，可選 地計(jì)算一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的比例。比例可選的是一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的水平相對(duì)于 相同或平行樣品中另一生物標(biāo)志物的水平，或要測量的生物標(biāo)志物的量與已知沒有神經(jīng)系 統(tǒng)疾病的對(duì)象中相同生物標(biāo)志物的測量的或先前建立的基底水平的比例。比例允許對(duì)象中 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷。發(fā)明方法還給對(duì)象施用將直接或間接改變一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的 比例的治療物。還提供了一種發(fā)明方法用于診斷和治療多器官損傷。多器官說明性地包括神經(jīng) 組織例如腦和脊髓等等的子集，或大腦的特定區(qū)域，例如皮層、海馬等等。多器官損傷說明 性地包括通過半胱天冬酶誘導(dǎo)的SBDPs的存在可檢測的細(xì)胞凋亡；和通過鈣蛋白酶誘導(dǎo)的 SBDPs的存在可檢測的細(xì)胞脹亡。本發(fā)明方法說明性地包括分析從對(duì)象獲得的生物樣品中 的許多生物標(biāo)志物，其中當(dāng)生物樣品從對(duì)象獲得時(shí)，生物樣品可選地與懷疑經(jīng)受損害的器 官或?qū)φ掌鞴僖后w接觸。本發(fā)明方法基于許多生物標(biāo)志物的第一比例確定器官損傷的第一 亞型。本發(fā)明方法還基于生物樣品中許多生物標(biāo)志物的第二比例確定第二器官損傷的第二 亞型。比例說明性地通過在這里描述的或本領(lǐng)域已知的方法確定。在本發(fā)明方法中的多器官損傷的治療說明性地通過對(duì)對(duì)象施用至少一種有效調(diào) 節(jié)因響應(yīng)第一器官損傷而活性改變的蛋白的活性的治療拮抗劑或激動(dòng)劑，和施用至少一種 有效調(diào)節(jié)因響應(yīng)第二器官損傷而活性改變的蛋白的活性的治療拮抗劑或激動(dòng)劑。本目標(biāo)發(fā)明說明性地包括用于區(qū)分對(duì)象中神經(jīng)系統(tǒng)疾病的程度的組合物。一種發(fā) 明組合物要么是一種試劑實(shí)體要么是多種試劑的混合物。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，組合物 是一種混合物。該混合物可選地包含源自對(duì)象的生物樣品。對(duì)象可選地懷疑具有神經(jīng)系統(tǒng) 疾病。生物樣品在從對(duì)象分離之前與對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)連通。本發(fā)明組合物還包含至少兩個(gè) 主要試劑，優(yōu)選抗體，其特異性地和獨(dú)立地結(jié)合至可能存在生物樣品中的至少兩個(gè)生物標(biāo) 志物。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，第一主要試劑是特異性結(jié)合泛素羧基末端水解酶優(yōu)選UCHLl 的抗體。第二主要試劑優(yōu)選特異性結(jié)合血影蛋白降解產(chǎn)物的抗體。本發(fā)明組合物的試劑可選地是可動(dòng)的，或以其它方式與基體接觸。本發(fā)明教導(dǎo)優(yōu) 選地用至少一種可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，在每種試劑上的標(biāo)記是 獨(dú)一無二的和可獨(dú)立檢測的。可選地，特異性用于檢測或結(jié)合至主要試劑的次要試劑用至 少一種可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在非限制實(shí)例中，主要試劑是兔源抗體。次要試劑可選的 是對(duì)兔源一抗具有特異性的抗體?？贵w結(jié)合至抗原的檢測的機(jī)理是本領(lǐng)域熟知的，本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員很容易想到適于檢測生物樣品中的抗原或生物標(biāo)志物的許多方法和試劑。
還提供了試劑盒，包括適于連接生物樣品中的目標(biāo)生物標(biāo)志物的基體。生物樣品 可選地與試劑盒一起提供或由使用本發(fā)明試劑盒的醫(yī)師獲取。一種發(fā)明試劑盒還包括特異 性地和獨(dú)立地結(jié)合至至少兩個(gè)生物標(biāo)志物的至少兩個(gè)抗體。抗體優(yōu)選地區(qū)分兩種生物標(biāo)志 物。優(yōu)選地，第一抗體是特異性的和獨(dú)立地用于結(jié)合和檢測第一生物標(biāo)志物。第二抗體是 是特異性的和獨(dú)立地用于結(jié)合和檢測第二生物標(biāo)志物。采用這種方式，可以確定或區(qū)分在 單一生物樣品中的多個(gè)生物標(biāo)志物的存在或缺乏。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，生物樣品中的 目標(biāo)生物標(biāo)志物說明性地包括α II血影蛋白、α II血影蛋白降解產(chǎn)物(SBDP)、泛素羧基末 端水解酶和ΜΑΡ2蛋白。一種發(fā)明試劑盒還包括用于將抗體與生物樣品或一部分生物樣品 反應(yīng)從而檢測生物樣品中生物標(biāo)志物的存在或量的操作指南。在試劑盒中，生物樣品可以是CSF或血液，試劑可以是特異性結(jié)合α II血影蛋白、 α II血影蛋白降解產(chǎn)物(SBDP)、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2蛋白的至少之一的抗體、適體 或其它分子。試劑盒還可以包括可探測的標(biāo)記，例如偶聯(lián)至試劑的標(biāo)記，或偶聯(lián)至特異性結(jié) 合試劑的物質(zhì)(例如，二抗)的標(biāo)記。本發(fā)明采用將生物樣品中生物標(biāo)志物的存在或量與神經(jīng)細(xì)胞(或其它表達(dá)生物標(biāo) 志物的細(xì)胞)損傷的嚴(yán)重程度和/或類型相關(guān)聯(lián)的步驟。在生物樣品中生物標(biāo)志物的量直 接與神經(jīng)組織損傷的嚴(yán)重性相關(guān)，因?yàn)楦訃?yán)重的損傷損害更多數(shù)目的神經(jīng)細(xì)胞，其反過 來導(dǎo)致更大量的生物標(biāo)志物積累在生物樣品(例如CSF ；血清)中。神經(jīng)細(xì)胞損傷是否觸發(fā) 細(xì)胞死亡的凋亡類型和/或壞死類型可以通過檢測生物樣品中SBDPs的存在來確定。細(xì)胞 壞死優(yōu)先激活鈣蛋白酶，而細(xì)胞凋亡優(yōu)先激活半胱天冬酶-3。因?yàn)榭梢詤^(qū)分鈣蛋白酶和半 胱天冬酶-3 SBDPs，這些標(biāo)志物的測量表明對(duì)象中細(xì)胞損害的類型。例如，壞死誘導(dǎo)的鈣蛋 白酶激活導(dǎo)致SBDP150和SBDP145的產(chǎn)生；凋亡誘導(dǎo)的半胱天冬酶_3激活導(dǎo)致SBDP150i 和SBDP120的產(chǎn)生，兩種通路都激活導(dǎo)致所有四種標(biāo)志物的產(chǎn)生。同樣，存在于生物樣品中 的UCHLl的水平或動(dòng)力學(xué)程度可以可選地區(qū)分輕度損傷和更嚴(yán)重的損傷。在說明性的實(shí)例 中，相對(duì)于輕度激發(fā)(30分鐘)，嚴(yán)重的MACO (2小時(shí))在CSF和血清中均產(chǎn)生增加的UCHL1， 然而兩者均產(chǎn)生超過未損傷對(duì)象的UCHLl水平。而且，生物樣品中標(biāo)志物的持久性或動(dòng)力 學(xué)程度指示損傷的嚴(yán)重程度，更大的損傷表示對(duì)象中UCHLl或SBDP的增加的持久性，其是 通過一種發(fā)明方法在損傷后在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)在生物樣品中測量的。這種測試的結(jié)果可以幫助醫(yī)生確定施用特定治療物例如鈣蛋白酶和/或半胱天 冬酶抑制劑或毒蕈堿膽堿能受體拮抗劑是否可能有益于病人。該應(yīng)用在檢測細(xì)胞死亡機(jī)制 中年齡和性別差異方面可能是尤其重要的。涉及常規(guī)生物技術(shù)的方法在這里進(jìn)行了描述。這些技術(shù)一般是本領(lǐng)域已知的， 并詳細(xì)描述在方法專題著作例如分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , vol. 1-3, ed. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989)；和分子生物學(xué)現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)方案(Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and WiIey-Interscience, New York, 1992)(定期更新)中。免疫學(xué)方法(如，抗原特異性抗體制 備，免疫沉淀和免疫印跡)描述在，例如，免疫學(xué)現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)方案(Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al. , John Wiley & Sons, New York, 1991)；禾口免疫學(xué)分 析方法(Methods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al. , John Wiley &Sons, New York, 1992)中。本發(fā)明的各個(gè)方面通過以下非限制的實(shí)例進(jìn)行闡述。這些例子只用于說明目的， 而不是限制本發(fā)明的任何實(shí)踐。將可以理解，可以作出變化和更改而不背離本發(fā)明的精神 和范圍。雖然實(shí)例一般是針對(duì)哺乳動(dòng)物組織，具體地說，分析大鼠組織，本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員認(rèn)識(shí)到本領(lǐng)域已知的相似的技術(shù)和其它技術(shù)容易將實(shí)例應(yīng)用到其它哺乳動(dòng)物例如人類 上。在這里說明的試劑均通常是在哺乳動(dòng)物物種間交叉反應(yīng)的，或具有類似性質(zhì)的替代試 劑是商業(yè)上可獲得的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易知道哪里可以得到這些試劑。實(shí)例1 用于生物標(biāo)志物分析的材料。碳酸氫鈉，(Sigma Cat# :C_3041 )，封閉緩沖 液(Startingblock T20-TBS) (Pierce Cat#: 37543)，含吐溫 20 的 Tris 鹽緩沖液(TBST ； Sigma Cat# :T-9039)。磷酸鹽緩沖液(PBS ;Sigma Cat#:P_3813)；吐溫 20 (Sigma Cat# P5927);超級(jí) TMB ELISA (Pierce Cat#: 34028)；和 Nunc maxisorp ELISA 板(Fisher)。單 克隆和多克隆UCH-Ll抗體是本實(shí)驗(yàn)自制或來自Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA。用于α-II血影蛋白和降解產(chǎn)物以及MAP2的抗體可以從Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA得到。用于許多亞型的抗體的標(biāo)記可以從Invitrogen，Corp. , Carlsbad, CA得到。生物樣品中蛋白濃度用標(biāo)準(zhǔn)白蛋白使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)微量 蛋白測定法(Pierce Inc., Rockford, IL, USA)測定。所有其它必須的試劑和材料對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的而且容易獲得的。實(shí)例2 =TBI損傷模型的體內(nèi)模型可控的皮層碰撞(CCI)裝置用于制備如前所 述的大鼠 TBI 模型(Pike et al, 1998)。成年雄性(280_300g) SD 大鼠(Sprague-Dawley ratsXHarlan: Indianapolis, IN)用在 1 :1 02/N20 載氣中的 4% 的異氟醚麻醉(4 分鐘)， 然后保持在相同載氣中的2. 5 %的異氟醚中。核心體溫用直腸熱敏電阻探針連續(xù)監(jiān)測，并通 過在大鼠下面放置可調(diào)節(jié)的溫度控制的加熱墊維持在37士 1°C。動(dòng)物以臥姿固定在立體定 位框架上并用耳朵和門牙固定桿栓牢。沿著顱中線切口和軟組織的反射區(qū)，實(shí)施單側(cè)(與碰 撞部位同側(cè))開顱手術(shù)(直徑7毫米)，臨近中縫，在前囪(bregma)和人字縫尖(lambda)之 間。硬腦膜(dura mater)在皮層上保持完整。腦損傷通過用直徑5mm的鋁碰撞頭(安裝在 氣缸中)以3. 5m/s的速度、1. 6mm壓縮沖程和150ms停留時(shí)間碰撞右側(cè)(同側(cè))皮層產(chǎn)生。 假損傷對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行同樣的外科手術(shù)，但不接受碰撞損傷。進(jìn)行適當(dāng)?shù)膿p傷前后的處理以 確保遵照由佛羅里達(dá)州實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用委員會(huì)制定的指南和詳細(xì)描述在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管 理及使用指南中的美國國立衛(wèi)生研究院指南。此外，研究的開展遵照動(dòng)物福利法和其它與 動(dòng)物和涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)的聯(lián)邦條例和法規(guī)，并遵循在“NRC出版，1996年版，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理 及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC Publication, 1996 edition)”中規(guī)定的原則。實(shí)例3 大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)損傷模型大鼠在異氟醚麻醉(5%異氟醚經(jīng)由吸 氣室，然后2%異氟醚經(jīng)由鼻錐)下培養(yǎng)，大鼠的右頸總動(dòng)脈(CCA)在頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi) 動(dòng)脈(EIA)分叉處通過頸部中線切割而暴露出。ICA朝喙側(cè)地位于翼腭分支之后，ECA在其 舌和上頌骨分叉處結(jié)扎并割斷。然后通過在ECA殘部上的切口，將3-0尼龍縫線引入ECA (縫線的路徑通過血管壁視覺監(jiān)測)，并前進(jìn)通過頸動(dòng)脈管至離頸動(dòng)脈分叉約20mm直到它停 留在大腦前動(dòng)脈的狹窄處阻斷大腦中動(dòng)脈的源頭。然后閉合皮膚切口，血管內(nèi)縫線留在位 置上30分鐘或2小時(shí)。然后大鼠再次短暫麻醉，取回縫線細(xì)絲，以允許再灌注。對(duì)于假M(fèi)ACO手術(shù)，遵循同樣的程序，但絲線前進(jìn)僅超過內(nèi)-外頸動(dòng)脈分叉10mm，留在位置上直到大鼠死 亡。在所有外科手術(shù)期間，動(dòng)物通過恒溫加熱毯維持在37 士 1°C (Harvard Apparatus, Holliston, ΜΑ, U. S. Α.)。重要的是要注意，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)論中，如果驗(yàn)尸時(shí)大鼠大腦顯 示蛛網(wǎng)膜下出血的病理證據(jù)，將它們從研究中排除。進(jìn)行適當(dāng)?shù)膿p傷前和損傷后處理，以確 保遵循所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南。實(shí)例4 組織和樣品制備在損傷后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)(2、6、24小時(shí)和2、3、5天)，對(duì) 動(dòng)物進(jìn)行麻醉并立即斬首處死?？焖偃〕龃竽X，用冰冷PBS沖洗后分成兩份。迅速解剖右 半球大腦(碰撞區(qū)域周圍的大腦皮層和海馬)，用冰冷PBS淋洗后在液氮中速凍，然后保存 在-80°C待用。對(duì)于免疫組化，大腦迅速在干冰漿中冷凍，用冷凍切片機(jī)(20微米)切片到 SUPERFROST PLUS GOLDrp (Fisher Scientific)載玻片上，然后保存在 _80°C待用。對(duì)于 左半球大腦，收集和右側(cè)相同的組織。對(duì)于Western雜交分析，大腦樣品用置于干冰上的 小的研缽和杵粉碎成細(xì)粉末。然后粉碎好的腦組織粉末在含50mM Tris CpH 7. 4)、5 mM EDTA、1% (v/v) Triton X-100U mM DTT和Ix蛋白酶抑制劑混合物的緩沖液中(Roche Biochemicals)于4°C裂解90分鐘。然后將腦組織裂解液在4°C，15000xg離心5分鐘去掉 和移除不溶物，速凍，然后保存在-80°C待用。對(duì)于凝膠電泳和電印跡，澄清的CSF樣品(7μ 1)加2x的蒸餾水中含0.25 M Tris (pH 6. 8)、0. 2M DTT,8% SDS、0. 02%溴酚藍(lán)和20%甘油的上樣緩沖液，進(jìn)行十二烷基 硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)電泳。每個(gè)泳道20微克(20 yg)蛋白按常規(guī) 在 10-20%的 Tris/ 甘氨酸凝膠(Invitrogen, Cat #EC61352)上采用 SDS-PAGE 以 130 伏 電泳2小時(shí)。電泳之后，分離的蛋白在半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad)中在含有39mM氨基乙酸、 48mM Tris-HCl (pH8. 3)和5%甲醇的轉(zhuǎn)印緩沖液中在恒定電壓20V室溫轉(zhuǎn)印2小時(shí)從而 橫向轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。電轉(zhuǎn)印之后，膜在含5%脫脂奶粉的TBS和0. 05% Tween-2 (TBST)中室溫封閉1小時(shí)，然后在含5%脫脂奶粉的TBST中與按照廠商建議以 1 2000稀釋的多克隆UCHLl —抗在4°C孵育過夜。然后用TBST洗滌三次，和生物素標(biāo)記的 二抗(Amersham，Cat # RPmi77vl)在室溫孵育2小時(shí)，與鏈霉親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酶 (BCIP/NBT reagent: KPL, Cat# 50-81-08)孵育30分鐘。完整UCHLl蛋白的分子量用彩 虹顏色的標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記(Amersham，Cat # RPN800V)進(jìn)行估算。完整UCHLl蛋白水平的 半定量評(píng)估通過計(jì)算機(jī)輔助光密度掃描(Epson XL3500 scanner)和用ImageJ軟件(NIH) 進(jìn)行成像分析來完成。實(shí)例5 =UCHLl表達(dá)對(duì)神經(jīng)組織是特異的。UCHLl的組織特異性通過例如在實(shí)例4 中那樣進(jìn)行分析，以確定組織特異性表達(dá)。UCHLl主要表達(dá)在大腦(圖1A)，在睪丸中低水平 表達(dá)。UCHLl存在于所有大腦區(qū)域，在小腦和橋腦水平降低(圖1B)。
實(shí)例6 :MAC0激發(fā)后UCHLl在CSF中增加。如在實(shí)施例3中描述的，對(duì)象進(jìn) 行MACO激發(fā)處理，CAF樣品通過定量免疫印跡法分析。損傷后，UCHLl蛋白是容易檢測的， 在超出假損傷處理樣品中的UCHLl的量以上的統(tǒng)計(jì)上顯著水平(圖2A，B)。輕度缺血(30分 鐘MCA0)后再灌注以后，這些UCHLl水平短暫升高(在6小時(shí))，而更嚴(yán)重(2小時(shí)MAC0)缺 血后水平從6保持至72小時(shí)(圖2A，B)。實(shí)例7 =ELISA法很容易確定CSF和血清中的UCHLl水平。ELISA法用于更快、更 容易地檢測和定量生物樣品中的UCHLl。對(duì)于UCHLl夾心ELISA (swELISA),96孔板用在PH9. 2.的IM碳酸氫鈉中的100 μ 1/每孔的捕捉抗體(實(shí)驗(yàn)室自制的500 ng/每孔純化的 兔UCHLl抗體)進(jìn)行包被。96孔板4°C孵育過夜，吸干，然后加入300 μ 1/每孔的封閉緩沖 液(Startingblock T20-TBS)，室溫輕輕搖動(dòng)孵育30分鐘。接下來要么添加用于標(biāo)準(zhǔn)曲線 (0. 05-50ng/每孔)的標(biāo)準(zhǔn)抗原(重組UCHLl)要么添加在樣品稀釋液(總體積100 μ 1/每孔) 中的樣品(3-10μ 1 CSF)。板在室溫孵育2小時(shí)后，用自動(dòng)洗板機(jī)洗板(用洗滌緩沖液TBST， 5 χ 300 μΙ/每孔)。然后在封閉緩沖液中的檢測抗體HRP偶聯(lián)的鼠抗UCH-Ll (實(shí)驗(yàn)室自 制，50yg/ml)以100 μ 1/每孔加到孔中，室溫孵育1. 5小時(shí)，然后洗滌。如果需要放大信 號(hào)，加入生物素化的酪胺(biotinyl-tyramide)溶液(Perkin Elmer Elast Amplification Kit),室溫孵育15分鐘，洗滌，然后100 μ 1/每孔的在含0. 02% Tween-20和1 % BSA的PBS 溶液中的鏈霉親和素標(biāo)記的HRP (1 :500)，孵育30分鐘，洗滌。最后，孔中加入100 μ 1/每 孔的TMB底物溶液(Ultra-TMB ELISA, Pierce# 34028)，孵育5_30分鐘。在96孔分光光度 計(jì)(Molecular Device Spectramax 190)上在 652nm 處讀出信號(hào)。通過swELISA測量，TBI組(沖擊損傷)的UCH-Ll水平顯著高于假損傷對(duì)照組 (p<0. 01，ANOVA分析)和空白對(duì)照組，證明損傷后UCHLl在CSF中早期升高(損傷后2小時(shí))， 然后在損傷后48小時(shí)再次升高之前，在約24小時(shí)下降(圖3)。
在MACO激發(fā)之后，相對(duì)于采用更輕激發(fā)(30分鐘)，采用嚴(yán)重激發(fā)(2小時(shí)) 在CSF中UCHLl的量顯著增加(圖4)。更嚴(yán)重的2h MACO組，UCHLl蛋白水平比30min MACO 高2-5倍(ρ < 0.01，ANOVA分析)。對(duì)于假損傷組，UCHLl蛋白水平事實(shí)上幾乎難以與空白 對(duì)照組區(qū)分開。對(duì)于血清中UCHL1，得到了類似的結(jié)果。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)階段最后，用配有21規(guī)格針頭 的注射器直接從心臟采集血液(3-4ml )，置于聚丙烯管內(nèi)，室溫放置45分鐘到1小時(shí)形成血 塊。管用3000 xg離心20分鐘，取血清進(jìn)行ELISA分析(圖5，6)。
TBI組的UCHLl水平顯著高于假損傷組(ρ <0. 01，ANOVA分析)，對(duì)于從2 小時(shí)至24小時(shí)測量的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各自對(duì)應(yīng)相同的假損傷時(shí)間點(diǎn)(ρ< 0. 005, Student's T 檢驗(yàn))。損傷后在血清中最早2小時(shí)UCH-Ll顯著增加。嚴(yán)重MACO激發(fā)相對(duì)于輕度激發(fā)產(chǎn) 生增加的血清UCHL1。輕度和嚴(yán)重激發(fā)都統(tǒng)計(jì)上高于假損傷處理的動(dòng)物，表明UCHLl的血清 檢測是穩(wěn)健的診斷物，其水平能夠充分區(qū)分輕度和嚴(yán)重?fù)p傷。實(shí)例8 大鼠MACO激發(fā)后，通過與那些描述在其內(nèi)容在這里通過參考納入的美國 專利US7，291，710中的程序類似的程序?qū)ρ暗鞍捉到猱a(chǎn)物進(jìn)行了分析。圖7表明相對(duì)于 輕度(30分鐘)激發(fā)，嚴(yán)重(2小時(shí))MACO激發(fā)后在血清和CSF中的SBDP145的水平在研究 的所有時(shí)間點(diǎn)是顯著增加的。同樣，SBDP120表明嚴(yán)重MACO激發(fā)后，在損傷后24至72小 時(shí)之間在CSF中顯著升高。然而，相對(duì)于輕度激發(fā)，嚴(yán)重激發(fā)后在血清中的SBDP120的水平 在2至120小時(shí)之間的所有時(shí)間點(diǎn)是增加的。相對(duì)于假損傷處理的對(duì)象，輕度和嚴(yán)重MACO 激發(fā)在CSF和血清中均產(chǎn)生增加的SPBP 120和140。實(shí)例9 微管相關(guān)蛋白2 (MAP2)作為輕度(30分鐘)及嚴(yán)重(2小時(shí))MCAO激發(fā)后 在對(duì)象CSF和血清中的生物標(biāo)志物用基本上描述在實(shí)例4和7中的ELISA或western雜交 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。抗 MAP2 抗體(MAP-2(E-12))從 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA獲得。這些抗體既適用于ELISA又適用于western雜交實(shí)驗(yàn)，并且對(duì)鼠和人MAP2有交叉 反應(yīng)。相對(duì)于空白對(duì)照動(dòng)物，在輕度MCAO激發(fā)后在對(duì)象的CSF和血清中MAP2的水平均顯
21著增加(P<0.05)(圖9)。與UCHLl和SBDPs類似，嚴(yán)重激發(fā)(2小時(shí))在兩個(gè)樣品中均比輕 度激發(fā)(30分鐘)產(chǎn)生高得多的MAP2水平。實(shí)例10 雙環(huán)胺抑制TBI后CSF中SBDPs的產(chǎn)生，但對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的活力沒有影 響。對(duì)于其改變激發(fā)后生物樣品中生物標(biāo)志物水平的能力，基本上如其內(nèi)容在這里通過參 考納入的Cox, CD, et al. , JNeurotrauma, 2008; 25(11) 1355-65所描述的對(duì)該治療 物雙環(huán)胺進(jìn)行分析。沒有經(jīng)過藥物處理的8個(gè)TBI對(duì)象用在時(shí)間曲線研究中進(jìn)行SPDP免疫組織化學(xué) (在TBI后3、12、24和48 h，n=2/時(shí)間點(diǎn))。24個(gè)對(duì)象被分配到3個(gè)處理組之一(每個(gè)組η =8)損傷組施用鹽水溶媒(與藥物注射相等體積)；損傷組施用雙環(huán)胺；及第三假損傷組作 為沒有受傷的基準(zhǔn)，以其比較在SBDP水平上TBI誘導(dǎo)的變化。所有程序均按照加州大學(xué)戴 維斯分校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行?；旧先鐚?shí)例2中所描述的對(duì)對(duì)象施用CCI，CSF如實(shí)例4所述的進(jìn)行制備。雙環(huán) 胺溶解在等滲鹽水(isotonic saline)中，在TBI誘導(dǎo)之前5分鐘以5mg/kg劑量(體積1. O ml/kg)進(jìn)行腹腔注射(i. p.)。溶媒處理組接受等體積i. p.注射的等滲鹽水。兩組均在相 對(duì)于損傷的同一時(shí)間點(diǎn)接受注射，對(duì)研究者隱瞞藥物或溶媒的身份。對(duì)于TBI程度、初始體重(手術(shù)時(shí))或手術(shù)時(shí)的溫度，組之間沒有顯著差異(表1)。 與鹽水處理組相比，雙環(huán)胺處理組中體重下降百分比顯著降低(表1)。
權(quán)利要求
一種用于診斷和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能性的方法，其特征在于，包括分析對(duì)象的生物樣品以檢測一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的存在；基于樣品中一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的比例診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾??；和對(duì)對(duì)象施用治療物以改變所述的一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的比例。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自包括腦損傷、或多 器官損傷、或它們的組合的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物標(biāo)志物選自包括血影蛋白；血 影蛋白降解產(chǎn)物；MAP2 ；神經(jīng)元退化；泛素羧基末端酯酶；泛素羧基末端水解酶；位于神經(jīng) 元的細(xì)胞內(nèi)蛋白；MAP-tau ；C-tau ；聚(ADP-糖)聚合酶(PARP)；腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)停蛋白； 其降解產(chǎn)物；其衍生物，和它們的組合的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物標(biāo)志物是泛素羧基末端水解酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物標(biāo)志物比例大于2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物標(biāo)志物比例小于0.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療物是直接治療物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療物是間距治療物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療物選自包括雙環(huán)胺，東莨菪堿， 米拉美林，N -甲基-4-哌啶二苯乙醇酸鹽或酯NMP ；匹魯卡品，哌侖西平，乙酰膽堿，乙酰甲 膽堿，卡巴膽堿，烏拉膽堿，毒蕈堿，氧化震顫素M,氧化震顫素，毒胡蘿卜素，鈣通道阻滯劑 或激動(dòng)劑，尼古丁，占諾美林，BuTAC，氯氮平，奧氮平，西維美林，醋克立定，檳榔堿，托特羅 定，羥雙環(huán)凡林，IQNP,吲哚生物堿，喜巴辛，cyclostellettamines，其衍生物，其前體藥物， 以及它們的組合的組。
10.一種用于診斷和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能性的方法，其特征在于， 包括分析對(duì)象的腦脊髓液或血清以檢測選自包括泛素羧基末端水解酶；血影蛋白降解產(chǎn) 物；和MAP2的組的一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的存在；算所述生物標(biāo)志物水平與基底水平的比 例；基于所述比例診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾??；和對(duì)對(duì)象施用毒蕈堿受體拮抗劑以改變所述的一個(gè) 或更多生物標(biāo)志物的比例。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述毒蕈堿受體拮抗劑是雙環(huán)胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自包括沖擊腦損 傷；缺血性中風(fēng)；和多器官損傷的組。
13.一種用于區(qū)分神經(jīng)損傷程度的組合物，其特征在于，包括從懷疑具有損害的神經(jīng) 細(xì)胞的對(duì)象分離的生物樣品，生物樣品在從對(duì)象分離之前是一種與對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)連通的 液體；和至少兩個(gè)增加的抗體，其特異地、獨(dú)立地結(jié)合至選自α II血影蛋白、α II血影蛋白 降解產(chǎn)物(SBDP)、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2蛋白的至少兩個(gè)生物標(biāo)志物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的混合物，其特征在于，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的混合物，其特征在于，所述對(duì)象是人。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的混合物，其特征在于，所述生物標(biāo)志物固定在基體上。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的混合物，其特征在于，還包括至少一可檢測的標(biāo)記。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的混合物，其特征在于，所述可檢測的標(biāo)記偶聯(lián)至所述至少兩個(gè)抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的混合物，其特征在于，所述可檢測的標(biāo)記偶聯(lián)至特異結(jié)合 所述至少兩個(gè)抗體的物質(zhì)。
20.一種用于分析對(duì)象中細(xì)胞損害的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括用于連接從 懷疑具有損害的神經(jīng)細(xì)胞的對(duì)象分離的生物樣品中的生物標(biāo)志物的基體，生物樣品在從對(duì) 象分離之前是一種與生物神經(jīng)系統(tǒng)連通的液體；至少兩個(gè)抗體，其特異地、獨(dú)立地結(jié)合至選 自α II血影蛋白、α II血影蛋白降解產(chǎn)物(SBDP)、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2蛋白的至 少兩個(gè)生物標(biāo)志物；和用于將抗體與生物樣品或一部分生物樣品反應(yīng)以檢測生物樣品中標(biāo) 志物的存在或量的操作指南。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的混合物，其特征在于，所述對(duì)象是人。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的混合物，其特征在于，還包括至少一可檢測的標(biāo)記。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的混合物，其特征在于，所述可檢測的標(biāo)記偶聯(lián)至所述至少 兩個(gè)抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的混合物，其特征在于，所述可檢測的標(biāo)記偶聯(lián)至特異結(jié)合 所述至少兩個(gè)抗體的物質(zhì)。
25.一種用于診斷對(duì)象神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其特征在于，包括第一次測量從對(duì)象獲 得的生物樣品中泛素羧基末端水解酶的量和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的量；和 將泛素羧基末端水解酶的量和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的量與泛素羧基末端 水解酶和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的基底水平進(jìn)行比較從而診斷對(duì)象的神經(jīng) 系統(tǒng)疾病。
26.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述測量是免疫測定。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述樣品是腦脊髓液或血清。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo) 志物包括血影蛋白降解產(chǎn)物、MAP - 2、SBDP 150、SBDP 145或SBDP 120，或神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，還包括第二次測量泛素羧基末端水解 酶的第二量和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的第二量，以產(chǎn)生泛素羧基末端水解酶 和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo)志物的動(dòng)力學(xué)曲線。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，還包括比較對(duì)象中和與對(duì)象相同性別 的其它個(gè)體中正常水平之間泛素羧基末端水解酶的量和至少一個(gè)另外的神經(jīng)活性生物標(biāo) 志物的量。
31.一種用于診斷和治療對(duì)象中多器官損傷的方法，其特征在于，包括分析來自對(duì)象 的生物樣品以檢測多個(gè)生物標(biāo)志物；基于所述生物樣品中所述多個(gè)生物標(biāo)志物的第一比例 確定第一器官損傷的第一亞型；基于所述生物樣品中所述多個(gè)生物標(biāo)志物的第二比例確定 第二器官損傷的第二亞型；施用至少一治療拮抗劑，其有效抑制響應(yīng)第一器官損傷的所述 第一亞型釋放的蛋白的活性，或者至少一治療激動(dòng)劑，其有效促進(jìn)響應(yīng)第一器官損傷的所 述第一亞型釋放的蛋白的活性；和施用至少一治療拮抗劑，其有效抑制響應(yīng)第二器官損傷 的所述第二亞型釋放的蛋白的活性，或者至少一治療激動(dòng)劑，其有效促進(jìn)響應(yīng)第二器官損 傷的所述第二亞型釋放的蛋白的活性。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述蛋白是鈣蛋白酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述蛋白是半胱天冬酶-3。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)生物標(biāo)志物是與所述第一和 所述第二器官的至少之一的損傷相關(guān)的細(xì)胞降解產(chǎn)物。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述損傷是沖擊損傷或中風(fēng)。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述治療拮抗劑是雙環(huán)胺。
37.一種用于診斷和治療對(duì)象中創(chuàng)傷性腦損傷的方法，其特征在于，包括分析對(duì)象組 織或液體以檢測一個(gè)或更多血影蛋白降解產(chǎn)物；施用雙環(huán)胺。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述創(chuàng)傷性腦損傷是中風(fēng)。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述創(chuàng)傷性腦損傷是缺血性中風(fēng)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述創(chuàng)傷性腦損傷是沖擊腦損傷。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于診斷和治療對(duì)象中神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，包括分析對(duì)象的生物樣品以檢測一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的存在；基于樣品中一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的比例診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾??；和對(duì)對(duì)象施用治療物以改變一個(gè)或更多生物標(biāo)志物的比例。提供了診斷許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如腦損傷或多器官損傷。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101983337SQ200980111586
公開日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日
發(fā)明者王凱文, 羅納德·L·海斯 申請(qǐng)人:班揚(yáng)生物標(biāo)記公司