專利名稱：Mpo奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種奶牛乳房炎檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎是由病原微生物感染而引起乳房組織及乳頭發(fā)炎的一種疾病，它是世 界奶牛養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)病率最高、流行廣泛、造成損失最大的疾病之一。乳房炎分為臨床乳房炎 (Clinicalmastitis)、隱性乳房炎(mastitis)及慢性乳房炎(chronic mastitis)，其中 隱性乳房炎乳汁無(wú)肉眼可見(jiàn)變化，臨床癥狀不明顯，常不易被發(fā)現(xiàn)和重視。據(jù)報(bào)道，全世界 約有22億頭奶牛，其中有1/3的奶?；加腥榉垦?，臨床型乳房炎發(fā)病率僅為10% 20%， 而絕大部分是更為普遍的隱性乳房炎，在我國(guó)隱性乳房炎的發(fā)病率更高[3_4]。隱性乳房炎 使泌乳奶牛每年的產(chǎn)奶量下降10% 11% [5]，且降低牛奶的品質(zhì)，增加奶牛淘汰和后備奶 牛的成本、藥物開(kāi)支、獸醫(yī)服務(wù)費(fèi)用和額外勞力費(fèi)用，還延長(zhǎng)產(chǎn)后發(fā)情和妊娠時(shí)間，給奶牛 產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。可見(jiàn)，隱性乳房炎的早期診斷對(duì)減少奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要意 義。對(duì)于奶牛隱性乳房炎的診斷方法國(guó)內(nèi)外都做了長(zhǎng)期、大量的研究，但是我國(guó)目前 尚缺乏用于臨床上奶牛隱性乳房炎檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高而又適于廣泛應(yīng)用的早期 診斷方法，目前，國(guó)內(nèi)外奶牛隱性乳房炎的檢測(cè)方法有體細(xì)胞計(jì)數(shù)(SCC)檢測(cè)法、手握式導(dǎo) 電儀檢測(cè)法、凝固酶試驗(yàn)(TCT)、單克隆抗體的免疫方法、DNA指紋圖技術(shù)檢測(cè)法、PCR檢測(cè) 法等，這些方法要求專業(yè)化程度高、設(shè)備昂貴，在我國(guó)小型養(yǎng)殖場(chǎng)均很難得到廣泛的應(yīng)用， 且許多方法需在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室才能完成，不利于推廣，有些方法在臨床應(yīng)用時(shí)不能夠快速、簡(jiǎn) 便地做出診斷。

發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于公開(kāi)一種以髓過(guò)氧化物酶(MPO)為檢測(cè)指標(biāo)，運(yùn)用雙抗體 夾心BA-ELISA法為檢測(cè)方法，更符合快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度、高特異性的現(xiàn)代診斷方法要 求，適合工業(yè)化生產(chǎn)，保存期更長(zhǎng)的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒。本實(shí)用新型的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的ΜΡ0奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒由酶標(biāo)包被 板，A號(hào)液1瓶，B號(hào)液1瓶，C號(hào)液1組，D號(hào)液1瓶，E號(hào)液1瓶，F(xiàn)號(hào)液1瓶，兩片封板膜 組成。本實(shí)用新型還有這樣一些技術(shù)特征1、所述的酶標(biāo)包被板為兔抗MPO多抗包被并封閉的8X12孔酶標(biāo)板，分為標(biāo)準(zhǔn)品 孔、樣品孔及空白對(duì)照孔，是將兔抗MPO多抗包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，在4°C過(guò)夜后用封閉液 封閉，在37°C溫育Ih JnMPO懸液，37°C溫育Ih而成；2、所述的A號(hào)液為生物素標(biāo)記的鼠抗MPO單抗，即二抗，在檢測(cè)操作過(guò)程中添加本 液體后需在37°C溫育Ih ；3、所述的B號(hào)液為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素，在檢測(cè)操作過(guò)程中添加本液體后需在37°C溫育Ih ；4、所述的C號(hào)液為MPO標(biāo)準(zhǔn)品，分為含量為Ong/ml的Cl號(hào)液，含量為2. 5ng/ml 的C2號(hào)液，含量為5. Ong/ml的C3號(hào)液，含量為lOng/ml的C4號(hào)液，含量為25ng/ml的C5 號(hào)液，含量為50ng/ml的C6號(hào)液6瓶；5、所述的D號(hào)液為底物溶液TMB，在檢測(cè)操作過(guò)程中添加本液體后需在37°C溫育 30min ；6、所述的E號(hào)液為2mol/L的H2SO4終止液；7、所述的F號(hào)液為濃縮洗滌液PBST，用于洗滌溫浴后的酶標(biāo)板，每次需三次重復(fù) 洗滌；8、所述的封板膜為96孔，用于酶標(biāo)板加樣和加酶的溫育，以及顯色。本實(shí)用新型為一種專用于奶牛隱性乳房炎診斷的試劑盒，研發(fā)人員在比較 了多種奶牛乳房炎檢測(cè)方法后，設(shè)計(jì)了本檢測(cè)試劑盒。其原理是牛髓過(guò)氧化物酶 (myeloperoxidase,MPO)是多形核粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放的嗜天青顆粒的主要成 份，并在炎癥過(guò)程中扮演了吞噬和溶菌的重要角色。研究報(bào)道奶牛發(fā)生乳腺炎時(shí)乳汁中MPO 作為指示物含量增高，奶樣中的體細(xì)胞數(shù)(SCC)和MPO濃度的相關(guān)系數(shù)值為0.91，奶樣中 隨著SCC的增高，MPO的水平也增高達(dá)到2000ng/mL，同時(shí)也可分離到大量細(xì)菌。免疫學(xué)分 析MPO單克隆抗體與奶液中成分乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、牛血清白蛋白、ΜΡ0、淋巴細(xì)胞、 少量體細(xì)胞的乳樣之間ELISA反應(yīng)沒(méi)有交叉性，表明MPO分子在乳房炎中具有很高的特異 性。通過(guò)對(duì)牛奶中MPO的檢測(cè)來(lái)判斷乳房?jī)?nèi)中性粒細(xì)胞(PMN)的活性狀態(tài)，可對(duì)奶牛隱性乳 房炎做出早期診斷。本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中MPO水平。通過(guò) ELISA方法，制備的MPO抗體同MPO的特異性反映，從而能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)到標(biāo)本中的MPO含 量。通過(guò)MPO含量和體細(xì)胞數(shù)SCC之間的換算，達(dá)到檢測(cè)奶牛隱性乳房炎的目的。用純化 的抗體包被酶標(biāo)板，制成固相抗體，往包被多抗的酶標(biāo)板中依次加入待檢奶樣、生物素標(biāo)記 的鼠抗MPO單抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在終止液2M H2SO4的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏 色的深淺和樣品中的MPO呈正相關(guān)。在終止反應(yīng)后30min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè) 定吸光度(0D值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

圖1為實(shí)施例酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型做進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例結(jié)合圖1，本實(shí)施例包括兔抗MPO多抗包被并封閉的8 X 12孔酶標(biāo)板1 一塊，生物 素標(biāo)記的鼠抗MPO單抗A號(hào)液一瓶，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素B號(hào)液一瓶，標(biāo)準(zhǔn)品含 量為Ong/ml的Cl號(hào)液，含量為2. 5ng/ml的C2號(hào)液，含量為5. Ong/ml的C3號(hào)液，含量為 10ng/ml的C4號(hào)液，含量為25ng/ml的C5號(hào)液，含量為50ng/ml的C6號(hào)液各一瓶共六瓶，D 號(hào)液底物溶液TMB —瓶，2mol/L的H2SO4終止液E號(hào)液一瓶，F(xiàn)號(hào)液濃縮洗滌液PBST —瓶，
496孔封板膜兩片。各試劑在使用前平衡至室溫，操作步驟如下(1)根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量取出所需酶標(biāo)板并標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔及空白對(duì)照孔，標(biāo) 準(zhǔn)品孔按照標(biāo)準(zhǔn)品次序C1-C6加入，各50ul ；樣品孔加入50ul待測(cè)樣品；空白對(duì)照孔加入 50ul蒸餾水，室溫孵育lh，洗滌3次，甩干。(2)除空白對(duì)照孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔均加入A號(hào)液100yL，37°C孵育，洗滌3 次，甩干；(3)除空白對(duì)照孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔，均加入B號(hào)液100μ L，37°C孵育，lh，洗滌 3-5次，甩干；(4)除空白對(duì)照孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔均加入D號(hào)液，37°C孵育，15min ；(5)各孔均加入E號(hào)液，各50 μ L，終止反應(yīng)；(6) 30min內(nèi)，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)下各孔的OD值；(7)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為不同濃度MPO標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)的0D450nm 值，橫坐標(biāo)為MPO標(biāo)準(zhǔn)品濃度，連接各點(diǎn)，繪制曲線；然后作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立回歸方 程；(8)結(jié)果判斷根據(jù)各樣品的0D450nm值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其對(duì)應(yīng)的濃度范圍。
權(quán)利要求MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于它是由酶標(biāo)包被板，A號(hào)液1瓶，B號(hào)液1瓶，C號(hào)液1組，D號(hào)液1瓶，E號(hào)液1瓶，F(xiàn)號(hào)液1瓶，兩片封板膜組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)包 被板為兔抗MPO多抗包被并封閉的8X12孔酶標(biāo)板，分為標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔及空白對(duì)照孔， 是將兔抗MPO多抗包被聚苯乙烯酶標(biāo)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的A號(hào)液 為生物素標(biāo)記的鼠抗MPO單抗，即二抗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的B號(hào)液 為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的C號(hào)液 為MPO標(biāo)準(zhǔn)品，分為含量為Ong/ml的Cl號(hào)液，含量為2. 5ng/ml的C2號(hào)液，含量為5. Ong/ ml的C3號(hào)液，含量為lOng/ml的C4號(hào)液，含量為25ng/ml的C5號(hào)液，含量為50ng/ml的 C6號(hào)液6瓶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的D號(hào)液 為底物溶液TMB。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的E號(hào)液 為2mol/L的H2SO4終止液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的F號(hào)液 為濃縮洗滌液PBST。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的封板膜 為96孔。專利摘要本實(shí)用新型的目的在于公開(kāi)一種以髓過(guò)氧化物酶MPO為檢測(cè)指標(biāo)，運(yùn)用雙抗體夾心BA-ELISA法為檢測(cè)方法，更符合快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度、高特異性的現(xiàn)代診斷方法要求，適合工業(yè)化生產(chǎn)，保存期更長(zhǎng)的MPO奶牛隱性乳房炎檢測(cè)試劑盒。用純化的抗體包被酶標(biāo)板，制成固相抗體，往包被多抗的酶標(biāo)板中依次加入待測(cè)奶樣、生物素標(biāo)記的鼠抗MPO單抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。
文檔編號(hào)G01N33/535GK201654036SQ20092024439
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者呂英, 李慶章, 楊宇, 石晶, 邊艷杰, 高學(xué)軍 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)