專利名稱：一種檢測(cè)去甲氯胺酮的elisa測(cè)試盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及違禁藥品的檢測(cè)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種去甲氯胺酮(NKET)的酶聯(lián)免疫分析用測(cè)試盒及制備方法。
背景技術(shù)：
氯胺酮(Ketamine)，在我國(guó)俗稱“K粉”，化學(xué)名為2-鄰氯苯基-2-甲胺基-環(huán)己酮。試圖以其替代苯環(huán)己哌啶(PCP)，消除PCP作為麻醉劑所產(chǎn)生的精神性副作用，而成為一種新型麻醉劑。氯胺酮是PCP的衍生物，于1962年首次人工合成，屬非麻醉性鎮(zhèn)痛藥類。該藥物在亞麻醉劑量時(shí)就能深度鎮(zhèn)痛，而且沒(méi)有大多數(shù)其它常規(guī)麻醉劑相關(guān)的抑制心臟、呼吸功能的副作用，已經(jīng)在臨床試用多年。
自1971年美國(guó)舊金山和洛杉磯市首先報(bào)告的氯胺酮濫用病例以來(lái)，氯胺酮濫用迅速蔓延至周邊國(guó)家。上個(gè)世紀(jì)90年代末，氯胺酮濫用流入日本，泰國(guó)等亞洲國(guó)家，并迅速蔓延到我國(guó)。近二十年來(lái)，我國(guó)濫用氯胺酮的比例連續(xù)攀升，香港特別行政區(qū)尤為嚴(yán)重。鑒于氯胺酮濫用全球化的嚴(yán)重性，建立準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法十分必要。
氯胺酮代謝較快，最初分布在腦和其他高灌流組織，然后分布到低灌流區(qū)。氯胺酮代謝的半衰期為3～4h，借助于細(xì)胞色素酶P450經(jīng)N去甲基作用形成能產(chǎn)生與氯胺酮相同效果的去甲氯胺酮(norketamine)，去甲氯胺酮再進(jìn)一步脫氫產(chǎn)生可能同樣有活性的脫氫去甲氯胺酮(Dehydronorketamine)，見(jiàn)圖1。氯胺酮和2種主要的代謝物又可進(jìn)一步羥基化，形成葡萄糖酸結(jié)合物。氯胺酮及其代謝物90％經(jīng)腎臟排泄，5％隨糞便排除，4％以原形或去甲氯胺酮隨尿排除。
圖1氯胺酮及其代謝產(chǎn)物 在生物檢材(如血液、尿液、毛發(fā)等)中代謝物的含量比較高，因此作為檢測(cè)指標(biāo)，氯胺酮代謝物(主要是去甲基氯胺酮)的檢測(cè)比氯胺酮的檢測(cè)更加重要，對(duì)是否吸食氯胺酮的確認(rèn)也更加有效。目前主流的檢測(cè)方法有氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS/GC-MS-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/LC-MS-MS)、毛細(xì)管電泳(CE)和薄層層析(TLC)等理化分析方法，同時(shí)亦建立了膠體金免疫層析(GICA)等免疫學(xué)檢測(cè)方法。理化分析方法具有很好的靈敏度和特異性，但操作繁瑣，需要昂貴的儀器設(shè)備，且耗時(shí)長(zhǎng)。而膠體金免疫層析法使用的試紙條雖然克服了傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法檢測(cè)速度慢和不能進(jìn)行高通量檢測(cè)的弱點(diǎn)，而且無(wú)須專業(yè)人員操作，但檢測(cè)限偏高。因此，本領(lǐng)域迫切需要一種能夠更加快速、簡(jiǎn)易、靈敏地檢測(cè)去甲氯胺酮的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測(cè)試盒，其檢測(cè)快速、靈敏、準(zhǔn)確、可定量、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需貴重儀器設(shè)備，且對(duì)樣品純度要求不高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)化了樣品預(yù)處理和純化過(guò)程，特別適用于大批量樣品的檢測(cè)，為此本發(fā)明還提供了測(cè)試盒的制備及檢測(cè)方法。
一種檢測(cè)去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測(cè)試盒，其包括洗滌液、顯色液A、顯色液B和終止液，其特征在于其還包括包被板、去甲氯胺酮(NKET)標(biāo)準(zhǔn)品、抗NKET單克隆抗體和酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品。
一種檢測(cè)去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測(cè)試盒的制備其特征在于其包括以下步驟，包被板的制備、去甲氯胺酮(NKET)標(biāo)準(zhǔn)品的制備、抗NKET單克隆抗體的制備、酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品的制備。
其進(jìn)一步特征在于所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用10～100mmol/L pH9～10Na2CO3-NaHCO3的緩沖液作為包被液，去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-OVA)稀釋至0.1μg/mL～1.0μg/mL，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2～8℃放置過(guò)夜，棄去包被液，洗滌2～5次，按加入含1～5％牛血清白蛋白，pH 7～8的磷酸鹽緩沖液，2～8℃封閉過(guò)夜，棄去封閉液，吹干，板條密封后置-20～-40℃冷凍保存； 所述去甲氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品從去甲氯胺酮純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水，NKET濃度為0ng/mL～100ng/mL； 所述抗NKET單克隆抗體的制備50μg NKET-BSA偶聯(lián)抗原用50μl生理鹽水配成1μg/μl抗原溶液，與等體積完全福氏佐劑(液體石蠟∶羊毛脂∶卡介苗＝12g∶20ml∶0.105g)混勻，充分乳化，供首次免疫用。加強(qiáng)免疫時(shí)用同量的不完全福氏佐劑(液體石蠟∶羊毛脂＝12g∶20ml)代替完全福氏佐劑。首次免疫采用小鼠腹腔內(nèi)直接注射，免疫劑量為50μg/只小鼠。以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量10μg/只。最后一次免疫采用脾內(nèi)注射，4天后取脾融合。將分離的免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP-2/o以10∶1比例混合。離心，去除上清。在50～90S內(nèi)將1ml50％聚乙二醇(分子量為1500)加至細(xì)胞中，充分混勻，使其融合，1min后加入20ml DEM培養(yǎng)液，終止融合。水浴靜止10min后離心，去除上清。將融合細(xì)胞用含20％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，以最后濃度為1×104飼養(yǎng)細(xì)胞/0.1ml接種于以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)，8d后，每培養(yǎng)孔更換2/3HT培養(yǎng)液。10d～20d后，開始對(duì)鏡檢有雜交瘤克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆。雜交瘤篩選采用固相抗原間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行。以NKET-OVA為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽(yáng)性對(duì)照，以SP-2/o骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞孔的判定標(biāo)準(zhǔn)為(A試驗(yàn)-A空白)/(A對(duì)照-A空白)＞2.1。對(duì)分泌陽(yáng)性抗體的細(xì)胞進(jìn)行克隆。采用有限稀釋法，將陽(yáng)性克隆細(xì)胞吹勻，取一微滴至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，倒置顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，稀釋為70個(gè)/ml再取1ml稀釋20倍，接種入96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行亞克隆。直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清均呈陽(yáng)性為止。對(duì)10～13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3～0.5ml/只，8～10d后，腹腔注射培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞，5×105細(xì)胞/只。5d后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀，加甘油于-20℃保存。
所述酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品為辣根過(guò)氧化物酶-羊抗鼠抗體凍干品；所述洗滌液為含有吐溫和NaN3的磷酸鹽緩沖溶液；所述顯色液A為含有過(guò)氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述顯色液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為硫酸溶液。
去甲氯胺酮的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，其特征在于取包被有NKET-OVA的微孔包被板，加入50～100μL的NKET標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，加50～100μL抗NKET抗體，35～45℃孵育0.5～1h，洗滌液洗3～5次，加50～100μl辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗體，35～45℃孵育0.5～1h，用洗滌液洗3～5次，加50～100μL顯色液A和50～100μL顯色液B，暗處?kù)o置10～20min后加終止液，在450nm處測(cè)其吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的NKET含量。
本發(fā)明的去甲氯胺酮的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、靈敏、準(zhǔn)確，專用測(cè)試盒使用方便、價(jià)格低，適用于大批量樣品的檢測(cè)。
圖2為去甲氯胺酮NKET標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式 一種檢測(cè)去甲氯胺酮的ELISA測(cè)試盒，其包括洗滌液1、顯色液A、顯色液B和終止液10，其還包括包被板12、去甲氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品11、去甲氯胺酮單抗5和酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品6。
測(cè)試盒的制備其包括以下步驟，包被板的制備、去甲氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品的制備、抗去甲氯胺酮單克隆抗體的制備、酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品的制備。
包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用10mmol/LpH9.5Na2CO3-NaHCO3的緩沖液作為包被液，將去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-OVA)稀釋至1.0μg/mL，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，5℃放置過(guò)夜，棄去包被液，洗滌2次，按加入含5％牛血清白蛋白，pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，8℃封閉過(guò)夜，棄去封閉液，吹干，板條密封后置-20℃冷凍保存； 去甲氯胺酮從去甲氯胺酮純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水，NKET濃度為25ng/mL； 本發(fā)明實(shí)施中，有關(guān)抗體的產(chǎn)生采用如下方法 半抗原 去甲氯胺酮(Norketamine)分子量很小(223.6道爾頓)，是半抗原物質(zhì)，只具備免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能直接用于免疫動(dòng)物而獲得抗體。因此，為了制備本發(fā)明的完全抗原，對(duì)去甲氯胺酮進(jìn)行了活化并制得了本發(fā)明的半抗原。
如本文所用，本發(fā)明的“半抗原″或“去甲氯胺酮活化衍生物”是指經(jīng)本發(fā)明的衍生反應(yīng)得到的具有結(jié)構(gòu)式1的物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如式1所示
完全抗原 通常，半抗原需要和大分子如KLH(血藍(lán)蛋白)或BSA(牛血清白蛋白)以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)，成為既具有免疫反應(yīng)性，又具有免疫原性的完全抗原。
如本文所用，本發(fā)明的“完全抗原”是指本發(fā)明的半抗原與適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)載體結(jié)合后的產(chǎn)物。
如本文所用，本發(fā)明中的“蛋白質(zhì)載體”是指任何在免疫學(xué)上可接受的用于形成完全抗原的蛋白質(zhì)，其可為例如，血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或γ球蛋白等。
本發(fā)明用于去甲氯胺酮檢測(cè)及抗體制備的完全抗原的結(jié)構(gòu)如式2所示
其中，X為蛋白質(zhì)載體，本發(fā)明中優(yōu)選卵清蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)；與X載體共價(jià)交聯(lián)的部分為去甲氯胺酮的衍生物1-羧甲氧基氨-去甲氯胺酮 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中，X為卵清蛋白，完全抗原為去甲氯胺酮-OVA，作為免疫用抗原，用于制備去甲氯胺酮-OVA偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方案中，X為牛血清白蛋白，完全抗原為去甲氯胺酮-BSA，作為檢測(cè)用抗原，用于制備檢測(cè)去甲氯胺酮的單克隆抗體。
本發(fā)明的完全抗原的制備方法如下 首先將去甲氯胺酮活化，得到其衍生物1-羧甲氧基氨-去甲氯胺酮，再將其與適合的蛋白質(zhì)載體(例如，OVA、BSA)進(jìn)行連接，得到完全抗原。其中X為蛋白質(zhì)載體，本發(fā)明中優(yōu)選卵清蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)；與X載體共價(jià)交聯(lián)的部分為去甲氯胺酮的衍生物1-羧甲氧基氨-去甲氯胺酮。
1-羧甲氧基氨-去甲氯胺酮的制備取260mg NKET+400mg Omixe，溶于40ml反應(yīng)溶劑[反應(yīng)溶劑為吡啶+甲醇+水＝1∶4∶1]中，磁力攪拌渾勻，加熱回流3hr，室溫過(guò)夜。40℃水浴，減壓蒸干。用30mL水溶解固體，并用1NNaHCO3溶液調(diào)pH為8.5，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用80mL CHCl3提取3次，棄去CHCl3層。再用1.2N HCl溶液調(diào)pH為3，用100mL CHCl3提取4次，收集CHCl3層。加入20mL水洗滌CHCl3層，收集CHCl3層。加入無(wú)水Na2SO4溶脫水10min，過(guò)濾，CHCl3液至蒸餾瓶中，減壓濃縮至干。
本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域已知的任何連接方式。例如但不限于碳二亞胺法(EDC)、戊二醛法等。
本發(fā)明制備的完全抗原，去甲氯胺酮-OVA具有很好的免疫原性，能刺激小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)1次基礎(chǔ)免疫、3次加強(qiáng)免疫，抗血清效價(jià)可達(dá)1∶6400；完全抗原去甲氯胺酮-BSA很好的保留了去甲氯胺酮的免疫反應(yīng)性。
抗NKET單克隆抗體的制備 本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即，組成該群體的抗體個(gè)體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語(yǔ)“單克隆的”是指該抗體的性質(zhì)不是離散抗體的混合物。
50μg NKET-BSA偶聯(lián)抗原用50μl生理鹽水配成1μg/μl抗原溶液，與等體積完全福氏佐劑(液體石蠟∶羊毛脂∶卡介苗＝12g∶20ml∶0.105g)混勻，充分乳化，供首次免疫用。加強(qiáng)免疫時(shí)用同量的不完全福氏佐劑(液體石蠟∶羊毛脂＝12g∶20ml)代替完全福氏佐劑。首次免疫采用小鼠腹腔內(nèi)直接注射，免疫劑量為50μg/只小鼠。以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量10μg/只。最后一次免疫采用脾內(nèi)注射，4天后取脾融合。將分離的免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP-2/o以10∶1比例混合。離心，去除上清。在50～90S內(nèi)將1ml 50％聚乙二醇(分子量為1500)加至細(xì)胞中，充分混勻，使其融合，1min后加入20ml DEM培養(yǎng)液，終止融合。水浴靜止10min后離心，去除上清。將融合細(xì)胞用含20％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，以最后濃度為1×104飼養(yǎng)細(xì)胞/0.1ml接種于以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)，8d后，每培養(yǎng)孔更換2/3HT培養(yǎng)液。10d～20d后，開始對(duì)鏡檢有雜交瘤克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆。雜交瘤篩選采用固相抗原間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行。以NKET-OVA為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽(yáng)性對(duì)照，以SP-2/o骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞孔的判定標(biāo)準(zhǔn)為(A試驗(yàn)-A空白)/(A對(duì)照-A空白)＞2.1。對(duì)分泌陽(yáng)性抗體的細(xì)胞進(jìn)行克隆。采用有限稀釋法，將陽(yáng)性克隆細(xì)胞吹勻，取一微滴至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，倒置顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，稀釋為70個(gè)/ml再取1ml稀釋20倍，接種入96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行亞克隆。直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清均呈陽(yáng)性為止。對(duì)10～13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3～0.5ml/只，8～10d后，腹腔注射培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞，5×105細(xì)胞/只。5d后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀，加甘油于-20℃保存。
酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品為辣根過(guò)氧化物酶-羊抗鼠抗體凍干品；所述洗滌液為含有吐溫和NaN3的磷酸鹽緩沖溶液；所述顯色液A為含有過(guò)氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述顯色液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為硫酸溶液。
去甲氯胺酮的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法取包被有NKET-OVA的微孔包被板，加入100μL的NKET標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，加50μL抗NKET抗體，40℃孵育0.75h，洗滌液洗5次，加50～100μl辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗體，35～45℃孵育0.5～1h，用洗滌液洗3～5次，加50μL顯色液A和75μL顯色液B，暗處?kù)o置20min后加終止液，在450nm處測(cè)其吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的NKET含量。
權(quán)利要求
1、一種檢測(cè)去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測(cè)試盒，其包括洗滌液、顯色液A、顯色液B和終止液，其特征在于其還包括包被板、去甲氯胺酮(NKET)標(biāo)準(zhǔn)品、抗NKET單克隆抗體和酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品。
2、一種檢測(cè)去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測(cè)試盒的制備其特征在于其包括以下步驟，包被板的制備、去甲氯胺酮(NKET)標(biāo)準(zhǔn)品的制備、抗NKET單克隆抗體的制備和酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品的制備。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述一種檢測(cè)去甲氯胺酮的ELISA測(cè)試盒的制備其特征在于所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用10～100mmol/L pH9～10Na2CO3-NaHCO3的緩沖液作為包被液，去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-OVA)稀釋至0.1μg/m L～1.0μg/m L，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2～8℃放置過(guò)夜，棄去包被液，洗滌2～5次，按加入含1～5％牛血清白蛋白，pH 7～8的磷酸鹽緩沖液，2～8℃封閉過(guò)夜，棄去封閉液，吹干，板條密封后置-20～-40℃冷凍保存；
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述一種檢測(cè)去甲氯胺酮的ELISA測(cè)試盒的制備其特征在于所述去甲氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品從去甲氯胺酮純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水，NKET濃度為0ng/mL～100ng/mL。
5、根據(jù)權(quán)利要求2所述一種檢測(cè)去甲氯胺酮的ELISA測(cè)試盒的制備其特征在于，所述抗NKET單克隆抗體的制備50μgNKET-BSA偶聯(lián)抗原用50μl生理鹽水配成1μg/μl抗原溶液，與等體積完全福氏佐劑(液體石蠟∶羊毛脂∶卡介苗＝12g∶20ml∶0.105g)混勻，充分乳化，供首次免疫用。加強(qiáng)免疫時(shí)用同量的不完全福氏佐劑(液體石蠟∶羊毛脂＝12g∶20m1)代替完全福氏佐劑。首次免疫采用小鼠腹腔內(nèi)直接注射，免疫劑量為50μg/只小鼠。以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量10μg/只。最后一次免疫采用脾內(nèi)注射，4天后取脾融合。將分離的免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP-2/o以10∶1比例混合。離心，去除上清。在50～90S內(nèi)將1ml 50％聚乙二醇(分子量為1500)加至細(xì)胞中，充分混勻，使其融合，1min后加入20ml DEM培養(yǎng)液，終止融合。水浴靜止10min后離心，去除上清。將融合細(xì)胞用含20％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，以最后濃度為1×104飼養(yǎng)細(xì)胞/0.1ml接種于以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)，8d后，每培養(yǎng)孔更換2/3HT培養(yǎng)液。10d～20d后，開始對(duì)鏡檢有雜交瘤克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆。雜交瘤篩選采用固相抗原間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行。以NKET-OVA為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽(yáng)性對(duì)照，以SP-2/o骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞孔的判定標(biāo)準(zhǔn)為(A試驗(yàn)-A空白)/(A對(duì)照-A空白)＞2.1。對(duì)分泌陽(yáng)性抗體的細(xì)胞進(jìn)行克隆。采用有限稀釋法，將陽(yáng)性克隆細(xì)胞吹勻，取一微滴至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，倒置顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，稀釋為70個(gè)/ml再取1ml稀釋20倍，接種入96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行亞克隆。直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清均呈陽(yáng)性為止。對(duì)10～13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3～0.5ml/只，8～10d后，腹腔注射培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞，5×105細(xì)胞/只。5d后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀，加甘油于-20℃保存。
6、根據(jù)權(quán)利要求2所述一種檢測(cè)去甲氯胺酮的ELISA測(cè)試盒的制備其特征在于，去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-OVA)偶聯(lián)物和去甲氯胺酮-BSA完全抗原的制備本發(fā)明實(shí)施中，有關(guān)抗體的產(chǎn)生采用如下方法
半抗原
去甲氯胺酮(Norketamine)分子量很小(223.6道爾頓)，是半抗原物質(zhì)，只具備免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能直接用于免疫動(dòng)物而獲得抗體。因此，為了制備本發(fā)明的完全抗原，對(duì)去甲氯胺酮進(jìn)行了活化并制得了本發(fā)明的半抗原。
如本文所用，本發(fā)明的“半抗原″或“去甲氯胺酮活化衍生物”是指經(jīng)本發(fā)明的衍生反應(yīng)得到的具有結(jié)構(gòu)式1的物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如式1所示
通常，半抗原需要和大分子如KLH(血藍(lán)蛋白)或BSA(牛血清白蛋白)以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)，成為既具有免疫反應(yīng)性，又具有免疫原性的完全抗原。
如本文所用，本發(fā)明的“完全抗原”是指本發(fā)明的半抗原與適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)載體結(jié)合后的產(chǎn)物。
如本文所用，本發(fā)明中的“蛋白質(zhì)載體”是指任何在免疫學(xué)上可接受的用于形成完全抗原的蛋白質(zhì)，其可為例如，血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或γ球蛋白等。
本發(fā)明用于去甲氯胺酮檢測(cè)及抗體制備的完全抗原的結(jié)構(gòu)如式2所示
其中，X為蛋白質(zhì)載體，本發(fā)明中優(yōu)選卵清蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)；與X載體共價(jià)交聯(lián)的部分為去甲氯胺酮的衍生物1-羧甲氧基氨去甲氯胺酮
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中，X為卵清蛋白，完全抗原為去甲氯胺酮-OVA，作為免疫用抗原，用于制備去甲氯胺酮-OVA偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方案中，X為牛血清白蛋白，完全抗原為去甲氯胺酮-BSA，作為檢測(cè)用抗原，用于制備檢測(cè)去甲氯胺酮的單克隆抗體。
本發(fā)明的完全抗原的制備方法如下
首先將去甲氯胺酮活化，得到其衍生物1-羧甲氧基氨去甲氯胺酮，再將其與適合的蛋白質(zhì)載體(例如，OVA、BSA)進(jìn)行連接，得到完全抗原。其中X為蛋白質(zhì)載體，本發(fā)明中優(yōu)選卵清蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)；與X載體共價(jià)交聯(lián)的部分為去甲氯胺酮的衍生物1-羧甲氧基氨-去甲氯胺酮。
1-羧甲氧基氨-去甲氯胺酮的制備取260mg NKET+400mg Omixe，溶于40ml反應(yīng)溶劑[反應(yīng)溶劑為吡啶+甲醇+水＝1∶4∶1]中，磁力攪拌渾勻，加熱回流3hr，室溫過(guò)夜。40℃水浴，減壓蒸干。用30mL水溶解固體，并用1N NaHCO3溶液調(diào)pH為8.5，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用80mL CHCl3提取3次，棄去CHCl3層。再用1.2N HCl溶液調(diào)pH為3，用100mLCHCl3提取4次，收集CHCl3層。加入20mL水洗滌CHCl3層，收集CHCl3層。加入無(wú)水Na2SO4溶脫水10min，過(guò)濾，CHCl3液至蒸餾瓶中，減壓濃縮至干。
本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域已知的任何連接方式。例如但不限于碳二亞胺法(EDC)、戊二醛法等。
7、根據(jù)權(quán)利要求2所述一種檢測(cè)去甲氯胺酮的ELISA測(cè)試盒的制備其特征在于，所述酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品為辣根過(guò)氧化物酶-羊抗鼠抗體凍干品；所述洗滌液為含有吐溫和NaN3的磷酸鹽緩沖溶液；所述顯色液A為含有過(guò)氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述顯色液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為硫酸溶液。
8、去甲氯胺酮的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，其特征在于取包被有NKET-OVA的微孔包被板，加入50～100μL的NKET標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，加50～100μL抗NKET抗體，35～45℃孵育0.5～1h，洗滌液洗3～5次，加50～100μl辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗體，35～45℃孵育0.5～1h，用洗滌液洗3～5次，加50～100μL顯色液A和50～100μL顯色液B，暗處?kù)o置10～20min后加終止液，在450nm處測(cè)其吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的NKET含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測(cè)試盒及制備方法。測(cè)試盒包括洗滌液、顯色液A、顯色液B和終止液、包被板、去甲氯胺酮(NKET)標(biāo)準(zhǔn)品、抗NKET單克隆抗體和酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品。包被板包被固相抗原，去甲氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品從去甲氯胺酮純品中稀釋得到，抗NKET單克隆抗體通過(guò)先制備去甲氯胺酮的完全抗原，利用小鼠免疫制得。本發(fā)明提供的去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測(cè)試盒采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，通過(guò)測(cè)定去甲氯胺酮的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的NKET含量。操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、靈敏、準(zhǔn)確，專用測(cè)試盒使用方便、價(jià)格低，適用于大批量樣品的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101620231SQ20091018403
公開日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者趙曉聯(lián), 趙春城, 楊婷婷, 沈笑平, 魏萬(wàn)里, 何金海, 蔡建榮, 燕 龔, 蔡正森, 杰 吳, 沈雯琰, 王文靜, 張海濤 申請(qǐng)人:江蘇省蘇微微生物研究有限公司