專利名稱：基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明專利涉及一種結合可逆固定化酶技術的量熱式生物傳感器，能夠應用在食品、醫(yī)藥、生化、環(huán) 境和化工等領域的現(xiàn)場及在線多試樣和組合測試與分析。
背景技術：
目前，分析設備向著準確化、集成化與自動化的方向發(fā)展。要求能夠用更低的消耗、更簡便的方法和 設備、更快的分析速度提供實時、準確、全面的信息。
量熱式生物傳感器是通過測量生化反應過程產(chǎn)生的熱量變化來進行分析的生物傳感器。量熱式生物傳 感器通用性強，適用于絕大多數(shù)的生化樣品。另外其不受顏色、渾濁和電化學等樣品屬性的影響，尤其適 合于檢測未經(jīng)處理的實際樣品和現(xiàn)場、在線組合分析檢測。量熱方法簡便、可靠、快速、靈敏度高，并有 利于微型系統(tǒng)的開發(fā)。但量熱式生物傳感器的缺點是基線穩(wěn)定時間長、易受干擾。
基于穩(wěn)定性及重復利用的考慮，傳統(tǒng)的量熱式生物傳感器往往結合固定化酶，并采用交聯(lián)、包埋等方 法預制備，其步驟煩瑣、增加成本，并且保證固定化酶在長時間的制備、貯藏、運輸和檢測過程中維持均 一、穩(wěn)定的活性，即固定化酶的標準化，是一個復雜的問題。尤其重要的是，對于進行不可逆抑制劑(像 農藥、重金屬等有毒物質)檢測時，不能重復使用，額外增加了成本。另外，現(xiàn)場及在線多試樣和組合分 析測試要求頻繁更換試劑和酶種類，將人為引入干擾，這大大影響了量熱式生物傳感器在現(xiàn)場及在線測試 中的高效、穩(wěn)定使用。
可逆固定化酶技術是利用官能團、pH、溫度等特征條件，控制酶固定在載體上的可逆過程。結合可逆 固定化酶技術的量熱式生物傳感器十分方便地在載體上在線裝載酶，即固定化，也可在線卸載酶，即逆固 定化。無需更換載體便可切換測試物和固定化酶的種類，操作靈活方便，還可降低干擾。同時，省略了預 制備固定化酶的過程，節(jié)省時間和經(jīng)濟成本，并能回收酶，對昂貴的酶種，尤為重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是通過提供一種能通過交互反應、pH、溫度等方式控制酶的可逆固定化過程的量熱式生 物傳感器，其靈活方便、適用性強，尤其適用于現(xiàn)場、在線多試樣和組合測試。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是 一種基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，包括
恒流泵、注入閥、恒溫器、微反應器、檢測器和循環(huán)流路等。其特點是恒流泵提供載流、酶液和試劑的定
流量輸送的動力；注入閥實現(xiàn)樣液、載流和試劑等的組合和控制。并可切換工作模式，即開路模式和循環(huán) 模式，前者將微反應器的流出液排出系統(tǒng)，作為廢液或回收利用，后者將微反應器的流出液重新通過恒溫 器循環(huán)進入微反應器，進行酶的固定化；恒溫器使樣液、載流和試劑等的組合在進入微反應器前恒定達到 設定溫度，并能通過調節(jié)設定溫度來改變反應溫度；微反應器內部填充酶可逆固定化的功能載體(吸附材 料、高分子材料、凝膠等)；用于檢測器的熱傳感器檢測微反應器中熱量的變化，其輸出端分別與處理、 顯示單元和計算機相連接，進行信號處理，并顯示；恒溫器、微反應器及連接管路和熱傳感器均放置在絕 熱環(huán)境中?；诳赡婀潭ɑ傅牧繜崾缴飩鞲衅鞑捎萌缦聶z測流程第一步，準備和穩(wěn)定過程，在微反 應器中自然堆積填充功能載體，整個系統(tǒng)通入載流并至系統(tǒng)穩(wěn)定，獲得穩(wěn)定基線；第二步，酶裝載(固定 化)過程，切換注入閥門，工作在循環(huán)模式，此時載流、酶液和試劑混合物定流量循環(huán)流過微反應器，過 程持續(xù)設定時間作為固定時間，酶被固定到功能載體上；第三步，反應及檢測過程，切換注入閥門，工作 在開路模式，底物被引入系統(tǒng)，在微反應器中的功能載體上進行酶反應。熱傳感器全程監(jiān)測反應器中各種 反應放出的熱量變化，其信號變化反映了酶反應程度；第四步，卸載過程，是逆固定化過程，改變酶固定 化的控制條件，酶從載體上脫離，微反應器的流出液可以作為廢液，也可以用于回收酶；第五步，通入載 流，排除微反應器及流路中的殘液，進行下一測試。所述的系統(tǒng)流程，每步分別對應相應的程序和控制， 實現(xiàn)流速和切換等操作。本發(fā)明的有益效果是基于可逆固定化的量熱式生物傳感器省去預制固定化酶的環(huán)節(jié)，節(jié)省了時間和經(jīng) 濟成本，能夠靈活、方便、快速地更換測試物或酶種類，簡化步驟、降低干擾。提高了檢測的自動化和集 成化程度，擴展并優(yōu)化了傳統(tǒng)量熱式生物傳感器的功能和反應模式。


圖1為基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)
圖2為基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器多試樣組合分析示意圖
具體實施例方式
本發(fā)明結合附圖作一說明，如圖1所示基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)。其中C為載流；
E為酶液；S為底物；R為試劑；P為恒流泵；V為注入閥；T為恒溫器；M為微反應器；D為檢測器；
C&D為信號處理及顯示單元PC為計算機；W為廢液。恒流泵P實現(xiàn)載流C、酶液E、底物S和試劑R等 的設定流量的傳輸，恒流保證了系統(tǒng)的重現(xiàn)性和精度；通過注入閥V實現(xiàn)載流C、酶液E、、底物S試劑R 間的切換和自由組合，完成定時、定量注入，實現(xiàn)程序控制和自動進樣等操作。并可實現(xiàn)開路模式和循環(huán) 模式的切換，開路模式使流出微反應器M的流出液排出系統(tǒng)，作為廢液或回收利用，循環(huán)模式就是流出液 重新通過恒溫器T循環(huán)通過微反應器M;恒溫器T對進入微反應器的載流C、酶液E、底物S或試劑R的混 合物進行恒溫，能保證反應在最適溫度條件下的重現(xiàn)性；微反應器M內部填充固定化載體(吸附材料、高 分子材料、凝膠等)，用于酶的可逆固定化；作為檢測器的熱傳感器D得到微反應器M中的反應熱信號， 并經(jīng)信號處理及顯示單元C&D，或與計算機PC連接，進行信號處理并顯示；恒溫器T、微反應器M及相連 管路和檢測器D外部的絕熱環(huán)境，能有效消除熱損失，提高精度。使用上述基于可逆固定化酶的生物傳感 器系統(tǒng)的具體實施檢測流程為第一步，準備和穩(wěn)定過程，在微反應器M中自然堆積填充富集載體，開啟 恒流泵P和恒溫器T。通入載流C至系統(tǒng)穩(wěn)定，獲得穩(wěn)定基線。第二步，切換注入閥V，酶液E、試劑R與 載流C的混合物定流量流過微反應器M，為固定過程，持續(xù)設定時間作為固定時間。此時，酶被固定到固 定化載體上第三步，反應及檢測過程，切換注入閥V,引入底物S、試劑R和載流C的混合物定流量流 過微反應器M，并在其中的固定化載體上進行酶反應。熱傳感器D-全程監(jiān)測微反應器中各種反應放出的熱 量變化，其信號變化被信號處理及顯示單元C&D或計算機PC處理后顯示；第四步，卸載過程，即逆固定 化過程，改變酶固定化的控制條件，酶從固定載體上脫離，微反應器M的流出液不循環(huán)使用，可以作為廢 液，也BI以用于酶的回收；第五步，切換注入閥V，載流C沖刷系統(tǒng)流路，排除微反應器M及流路中的殘 液，并穩(wěn)定基線，進行下一測試。
圖2給出了上述基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器實施多試樣組合分析的示意圖。箭頭標記的含 義分別為a、開始控制逆固定化條件(引入逆固定化試劑、調節(jié)溫度等)，進行酶的卸載過程；b、引入載 流，穩(wěn)定系統(tǒng)基線；C、引入酶液、試劑和載流組合，進行酶的固定化；Sl、引入酶El對應的底物Sl進 行反應；S2、引入酶E2對應的底物S2進行反應。以兩種酶E1和E2的相關測試為例說明。首先引入載流 C進行系統(tǒng)的穩(wěn)定過程，在獲得穩(wěn)定基線后，進行酶E1的測試，通過引入酶液E1、試劑R和載流C的混 合物，進行酶的固定化。測試時，引入底物Sl,進行酶反應，重復引入底物Sl，可以連續(xù)多試樣測試。 測試完畢后系統(tǒng)通入載流C，穩(wěn)定基線。轉換控制逆固定化酶的條件，通過引入逆固定化試劑、調節(jié)pH和 溫度等，進行酶E1的逆固定化過程。然后引入載流C清除系統(tǒng)內殘液，并穩(wěn)定基線。隨后進行的是酶E2 的測試，引入酶液E2、試劑R和載流C的混合物，進行酶的固定化，引入底物S2，進行酶反應，測試完 畢后引入載流C，穩(wěn)定基線，進入下一測試循環(huán)。
根據(jù)控制方式的不同，提供基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器檢測過氧化氫的兩個測試例。過氧 化氫在過氧化氫酶的作用下進行如下反應，利用基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器測試過程的反應 焓，來反映過氧化氫的量。
測試例1:
依靠抗原-抗體交互反應控制可逆固定化過程。固定化載體為瓊脂糖凝膠，功能團為兔抗人血清白蛋白(anti-HSA),底物為過氧化氫。載流為0. 1M、 pH7. 0磷酸鉀的緩沖液。流速設定為1 ml/min,反應溫 度為30'C。使用20U/邁l的過氧化氫酶和人血清白蛋白(HSA)混合液進行固定，固定時間為2min。 0.2M、 pH2.2的甘氨酸-鹽酸和緩沖液混合液沖刷固定化酶，進行卸載，時間為2 min。
測試例2:
依靠PH控制可逆園定化過程。固定化載體為陶瓷羥基磷灰石，底物為過氧化氫。流速設定為0. lml/min， 反應溫度為30。C。 5mM、 p朋.5磷酸鹽緩沖液，p恥.5、 20U/ml的過氧化氫酶液混合物進行固定，固定時間 20分鐘。引入緩沖液，改變緩沖液的pH和離子強度，進行卸載，時間為IO inin。
權利要求
1.一種基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于，它是由恒流泵P、注入閥V、恒溫器T、微反應器M、檢測器D和循環(huán)流路等組成的流動注射分析系統(tǒng)。
2. 根據(jù)權利要求1所述的基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于可以是利用MEMS或 蝕刻等技術在PDMA、 PMMA和硅等基片上制成的微分析系統(tǒng)。
3. 根據(jù)權利要求l， 2所述的基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于設置了循環(huán)回路， 并由注入閥V進行切換，使微反應器M的流出液循環(huán)通過微反應器M,進行酶的固定化。
4. 根據(jù)權利要求l, 2所述的基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于微反應器M中填充 的是吸附材料、高分子材料、凝膠等具有吸附和交互反應等功能的酶固定化的載體。
5. 根據(jù)權利要求l， 2所述的基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于恒溫器T是基于帕 爾貼效應，溫度可調節(jié)和控制的半導體制冷/加熱器。
6. 根據(jù)權利要求l， 2所述的基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于檢測器D可以是熱 電堆、熱電阻等珠狀、柱狀或片狀的熱傳感器，并放置在微反應器M的出口。
7. 根據(jù)權利要求l， 2， 6所述的基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于恒溫器T、微反 應器M及中間流路和檢測器D均處于在絕熱環(huán)境中。
8. 根據(jù)權利要求l, 2所述的基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器系統(tǒng)，其特征在于檢測流程的控制和 操作由單片機或計算機程序完成。
9. 一種基于可逆固定化酶的量熱式生物傳感器，其特征在于其流出液通過切換可以形成回路，循環(huán)流過微 反應器M，進行酶的固定化。并通過調節(jié)溫度、pH、官能團等方法控制酶在載體上的可逆固定化。檢測流 程按下述步驟進行a. 準備和穩(wěn)定過程，在微反應器M中自然堆積填充富集載體，開啟恒流泵P和恒溫器T。通入載流C 至系統(tǒng)穩(wěn)定，獲得穩(wěn)定基線。b. 切換注入閥V，酶液E、試劑R與載流C的混合物定流量流過微反應器M，為固定過程，持續(xù)設定 時間作為固定時間。此時，酶被固定到固定化載體上。3)反應及檢測過程。切換注入閥V，引入底物S、 試劑R和載流C的混合物定流量流過微反應器M，并在其中的固定化載體上進行反應。熱傳感器D全 程監(jiān)測微反應器M中的熱量變化，其信號變化被信號處理及顯示單元C&D或計算機PC處理后顯示。c. 逆固定化過程。改變酶固定化的控制條件，酶從固定載體上卸載，微反應器M的流出液不進行循環(huán) 使用，可以作為廢液，也可以用于酶的回收。d. 切換注入閥V，載流C沖刷系統(tǒng)流路，排除微反應器M及流路中的殘液，進行下一測試。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結合可逆固定化酶的量熱式生物傳感器，系統(tǒng)由恒流泵、注入閥、恒溫器、微反應器、檢測器和循環(huán)流路等組成。其特征是注入閥除對酶液、底物、載流和試劑等進行組合和控制，并能實現(xiàn)循環(huán)模式，就是微反應器流出液重新進入恒溫器循環(huán)通過微反應器，實現(xiàn)可逆固定化。結合可逆固定化酶技術的量熱式生物傳感器可實現(xiàn)酶的反應器裝載(固定化)和反應器卸載(逆固定化)，無需更換載體便可在線切換測試物和酶種類。其省略預制固定化酶步驟，節(jié)省了時間和經(jīng)濟成本，并能降低干擾，應用在多試樣和組合測試時尤其靈活方便。本發(fā)明提高了系統(tǒng)的集成化和自動化程度，同時加強和擴展了傳統(tǒng)量熱式生物傳感器的功能和反應模式。
文檔編號G01N27/327GK101526490SQ20091012667
公開日2009年9月9日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權日2009年3月6日
發(fā)明者君 劉, 鄭藝華, 馬永志 申請人:青島大學