專利名稱：：一種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及活菌疫苗質(zhì)量監(jiān)測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種定量的快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法。
背景技術(shù)：
：肺結(jié)核病是一種慢性傳染疾病，其傳染途徑主要是通過(guò)呼吸道傳染，目前已成為傳染病的首要?dú)⑹?，近年?lái)發(fā)病率有上升的趨勢(shì)，給我國(guó)的國(guó)民經(jīng)濟(jì)生活、人民生命健康造成了極大的危害。因此，對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和早期診治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)前，對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和控制所采取的主要措施是接種預(yù)防性疫苗——卡介苗。卡介苗是一種減毒的活性牛型結(jié)核桿菌疫苗，它注入人體后，能使人體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)結(jié)核桿菌的免疫力，防止感染和發(fā)生結(jié)核病，尤其在減少和控制兒童重癥結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎的發(fā)病及死亡方面的作用更為顯著?，F(xiàn)在世界上多數(shù)國(guó)家都已將卡介苗列為計(jì)劃免疫必須接種的疫苗之一。在卡介苗藥物的生產(chǎn)和保存過(guò)程中，需要對(duì)卡介苗質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，即活菌數(shù)是否達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)(活菌數(shù)>1X106個(gè)/mg)，即將lmg卡介苗樣品配制為lmL溶液，則合格標(biāo)準(zhǔn)為活菌數(shù)>1X106個(gè)/mL。常規(guī)的檢測(cè)方法是取一定量的試樣在試管中進(jìn)行活菌斜面培養(yǎng)計(jì)數(shù)，但培養(yǎng)時(shí)間通常需要1個(gè)月，導(dǎo)致疫苗在庫(kù)內(nèi)存放期延長(zhǎng)，縮短了疫苗的有效期，且這種方法操作復(fù)雜，檢測(cè)效率較低，國(guó)家檢定部門(mén)及防疫系統(tǒng)在監(jiān)測(cè)疫苗質(zhì)量時(shí)亦不能及時(shí)獲得結(jié)果，影響了質(zhì)量管理。因此，急需要建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的卡介苗活性檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，公開(kāi)一種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，無(wú)需培養(yǎng)，檢測(cè)快速，解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)，效率低等問(wèn)題，為活菌疫苗質(zhì)量監(jiān)控提供了關(guān)鍵技術(shù)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是—種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，包括四個(gè)步驟A)制作標(biāo)準(zhǔn)ATP曲線檢測(cè)ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光強(qiáng)度，作出ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與其發(fā)光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程；B)樣品前處理，提取活菌ATP:將凍干卡介苗用緩沖液稀釋為合適濃度的樣品溶液，對(duì)樣品溶液進(jìn)行裂解處理，提取卡介苗活菌中的ATP;C)卡介苗樣品生物發(fā)光測(cè)定將處理過(guò)的卡介苗樣品溶液進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，獲得樣品溶液的發(fā)光強(qiáng)度；D)卡介苗ATP濃度及活菌數(shù)計(jì)算由于各生長(zhǎng)時(shí)期的活菌中ATP含量大致相同，研究證明平均每個(gè)卡介苗活菌中的ATP含量為2.032.63fg。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程推算出卡介苗的ATP含量，即可推算出活菌數(shù)量。所述的快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，其所述B)步中對(duì)卡介苗樣品中ATP的提取，是通過(guò)加熱方法來(lái)裂解卡介苗活菌，實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌內(nèi)ATP的提取。所述的快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，其所述B)步中對(duì)卡介苗樣品中ATP的提取，是將預(yù)熱到80°C100°C的ATP提取劑與樣品溶液混合后，再在80°C100°C內(nèi)繼續(xù)加熱220min。所述的快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，其所述ATP提取劑，含有15150mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)(pH7.8)，0.18mM乙二胺四乙酸(EDTA);0.130mg/mL十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，曲拉通(TritonX-100)，二甲基亞砜(DMSO)中至少一種。本發(fā)明提供的快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，無(wú)需對(duì)活菌進(jìn)行培養(yǎng)，具有快速，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方法不局限于卡介苗活性的檢測(cè)，也適用于其他活菌疫苗質(zhì)量的監(jiān)控和真菌等其他微生物標(biāo)準(zhǔn)品的計(jì)數(shù)。圖1是本發(fā)明方法的卡介苗活菌數(shù)的檢測(cè)流程圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，所使用的生物發(fā)光試劑的制備方法，請(qǐng)參照申請(qǐng)?zhí)枮?200610112410.0的已申請(qǐng)專利。本發(fā)明的一種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，是通過(guò)對(duì)卡介苗樣品進(jìn)行前處理，檢測(cè)卡介苗活菌中ATP含量，從而推算其活菌數(shù)目。本發(fā)明的一種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，所用的ATP提取劑，是由15150mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)(pH7.8)，0.18mM乙二胺四乙酸(EDTA);0.130mg/mL十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，曲拉通(TritonX-100)，二甲基亞砜(DMSO)中至少一種組成。其制備過(guò)程是取O.130mg的DTAB或TritonX-100或DMSO中至少一禾中，0.18iimol的EDTA溶于15150mM的Tris緩沖液(pH7.8)中，使溶液終體積為lmL。所用試劑均為分析純。M為一種濃度單位，即摩爾/升。本發(fā)明的一種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，以皮內(nèi)注射卡介苗為具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)一步描述。本發(fā)明的具體實(shí)施例皮內(nèi)注射卡介苗中活菌含量的檢測(cè)。具體操作過(guò)程如下(見(jiàn)圖1)l)制作標(biāo)準(zhǔn)ATP曲線配制濃度為0.0625nM20nM的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液；取30yL的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液與180yL的生物發(fā)光試劑(請(qǐng)參照申請(qǐng)?zhí)枮?00610112410.0的已申請(qǐng)專利)進(jìn)行反應(yīng)，記錄相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，根據(jù)ATP濃度與發(fā)光強(qiáng)度的響應(yīng)關(guān)系，得到線性回歸方程。2)樣品前處理，提取活菌ATP4優(yōu)選了一套ATP提取劑，其組成及濃度如下DMSO5mg/mLTris25mMEDTA0.5mM按上述濃度配制ATP提取劑，然后按照下述過(guò)程對(duì)卡介苗樣品進(jìn)行裂解處理將皮內(nèi)注射卡介苗按照相關(guān)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)配制為合適濃度的樣品溶液；將500L的上述ATP提取劑在水浴鍋中預(yù)熱到IO(TC，再加入lOOiiL樣品溶液與其混合，在IO(TC下加熱5分鐘(min)后，恢復(fù)至室溫。3)卡介苗樣品生物發(fā)光測(cè)定取30L裂解后的樣品溶液與180yL的生物發(fā)光試劑進(jìn)行反應(yīng)，記錄相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。4)計(jì)算卡介苗ATP含量及活菌數(shù)量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，推算卡介苗中的ATP含量及活菌數(shù)量。表1皮內(nèi)注射卡介苗樣品中ATP含量及活菌數(shù)量<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>權(quán)利要求一種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，其特征在于，包括步驟A)首先進(jìn)行ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光檢測(cè)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程；B)再將凍干卡介苗配制為合適濃度的樣品溶液，對(duì)樣品溶液進(jìn)行ATP提取，得到樣品ATP提取液；C)然后加入生物發(fā)光試劑進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)；D)最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和樣品發(fā)光強(qiáng)度推算出卡介苗樣品中的ATP含量及活菌數(shù)。2.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，其特征在于，所述B)步中對(duì)卡介苗樣品中ATP的提取，是通過(guò)加熱方法來(lái)裂解卡介苗活菌，實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌內(nèi)ATP的提取。3.如權(quán)利要求1或2所述的快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，其特征在于，所述B)步中對(duì)卡介苗樣品中ATP的提取，是將預(yù)熱到80°C100°C的ATP提取劑與樣品溶液混合后，再在80°CIO(TC內(nèi)繼續(xù)加熱220min。4.如權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，其特征在于，所述ATP提取劑，含有15150mM三羥甲基氨基甲烷，pH7.8，0.18mM乙二胺四乙酸；0.130mg/mL十二烷基三甲基溴化銨，曲拉通，二甲基亞砜中至少一種。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)卡介苗活菌含量的方法，涉及活菌疫苗質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)，首先檢測(cè)三磷酸腺苷(ATP)標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光強(qiáng)度獲得ATP濃度與其發(fā)光強(qiáng)度的響應(yīng)關(guān)系，作出線性回歸方程；再將凍干卡介苗用緩沖液稀釋為合適濃度的樣品溶液，對(duì)樣品溶液進(jìn)行ATP提取，得到樣品ATP提取液；然后加入生物發(fā)光試劑進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)；最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和樣品發(fā)光強(qiáng)度推算出卡介苗樣品中的ATP及活菌含量。本發(fā)明方法檢測(cè)快速，無(wú)需培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單，適用于活菌疫苗質(zhì)量監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，和真菌等其他微生物標(biāo)準(zhǔn)品的計(jì)數(shù)。文檔編號(hào)G01N21/76GK101793832SQ200910077949公開(kāi)日2010年8月4日申請(qǐng)日期2009年2月4日優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日發(fā)明者劉春秀,劉曉紅,田青,羅金平,蔡新霞申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所