專利名稱：：降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法，屬于藥物質(zhì)量檢測體系。
背景技術(shù)：
：糖尿病己成為當(dāng)前世界性衛(wèi)生問題，我國糖尿病患病率也逐年增加，'新增的患者主要為2型糖尿病，口服降糖藥在這類患者的治療中占有重要的地位。近年來，臨床常用的降糖藥物有雙胍類和a-葡萄糖苷酶抑制劑等，民間也出現(xiàn)一些中藥降糖制劑，其中有些中藥制劑擅自添加西藥成分，隨意夸大療效，有的病人誤認(rèn)為這些民間中藥制劑是純中藥制劑，副作用小，可以大量服用，臨床出現(xiàn)服用這些中藥降糖藥中毒的病人。因此，有必要建立靈敏、可靠的分析方法對(duì)中藥降糖制劑中非法摻入的降糖藥進(jìn)行鑒定。降糖化學(xué)藥物一般可以分為磺酰脲類藥物、雙胍類藥物、a-糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類藥物、非磺酰脲類的胰島素促進(jìn)分泌劑等幾大類，其中磺酰脲類藥物、非磺酰脲類的胰島素促進(jìn)分泌劑和噻唑烷二酮類藥物有較低的水溶性，極性較低，為低極性降糖化學(xué)藥物，與其它幾大類的極性有明顯差異。磺酰脲類藥物的典型代表為格列本脲、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲和格列喹酮；非磺酰脲類的胰島素促進(jìn)分泌劑的典型代表為瑞格列奈、那格列奈；噻唑烷二酮類藥物的典型代表為羅格列酮、鹽酸吡格列酮。目前，已有采用高效液相色譜技術(shù)檢測降糖中藥類產(chǎn)品中摻雜的降糖化學(xué)藥物，如申請(qǐng)?zhí)枮?00610016419.l的中國專利，用高效液相色譜方法測定鹽酸甲基丙炔芐胺的含量，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為用十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀(10y。磷酸調(diào)pI^3)15:85為流動(dòng)相；檢測波長為217nm;柱溫4(TC，理論塔板數(shù)按鹽酸甲基丙炔芐胺鋒計(jì)算，應(yīng)不低于5000。但是該專利方法適用范圍狹窄，僅能檢測鹽酸甲基丙炔芐胺一種降糖化學(xué)藥物?！?種口服降糖藥的液相色譜一質(zhì)譜分析》(分析測試學(xué)報(bào)，第19巻第6期，2000年11月，Page5—8)—文中采用以下高效液相色譜條件對(duì)二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍進(jìn)行檢測流動(dòng)相為體積比為65:35的甲醇一5mmol/L醋酸銨緩沖液(pH3.5)，流速0.5ml/rain;柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20uL;《RP—HPLC檢測中藥保健品中的西藥降糖成分》(中國藥學(xué)雜志第40巻第4期，Page316—317)—文中采用RP—HPLC法對(duì)雙胍類藥物進(jìn)行檢測；色譜條件為C18色譜柱(伊立特4.6mmX250mm，5pm;流動(dòng)相甲醇一離子對(duì)試液(庚烷磺酸鈉O.5056g,加三乙胺1.4mL，加水至IOOOmL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5±0.05)(30:70);流速1.0mLmin—1;進(jìn)樣量為10uL，40ugmL—'，二極管陣列檢測器及UV檢測波長233nm:柱溫為室溫;理論板數(shù)按兩個(gè)對(duì)照品峰計(jì)算應(yīng)均不低于2000;《反相液相色譜法同時(shí)測定六種降糖藥西藥成分》(現(xiàn)代科學(xué)儀器2006，6，Page89—91)一文中采用反相液相色譜法同時(shí)測定降糖樣品中的鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、格列美脲等六種降血糖西藥成分。色譜柱為AgilentC18柱，流動(dòng)相為乙腈-0.02%磷酸溶液，梯度洗脫，波長229nm，流速1.0mL/rnin。17分鐘可實(shí)現(xiàn)六組分的完全分離，各組分在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；《液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定中藥降糖制劑中非法摻入苯乙雙胍和格列齊特的研究》(藥物分析雜志200525，Page1453—1455)提供了一種檢測非法摻入的苯乙雙胍和格列奇特的專屬性方法，HPLC條件為色譜柱0DSC18(250mmX4.6mm，5um);流動(dòng)相甲醇一醋酸鹽緩沖液(pH4.2)(50:50);流速l.OmLmin—1;柱溫30。C;進(jìn)樣量20uL;檢測波長240nm;《液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法測定中藥制劑中雙胍類化學(xué)藥物》(藥物鑒定第16巻第17期，Page15—16)用液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法測定純中藥降糖制劑中非法摻入的雙胍類化學(xué)藥物，色譜條件為色譜柱AgelentC18柱a50mmX4.6mm，5um);流動(dòng)相0.02mol/L醋酸銨溶液(將醋酸pH調(diào)至3.5)_甲醇(70:30);流速O.3ml/min;柱溫30'C;進(jìn)樣量10uL;檢測波長235nm;《反相高效液相色譜法一二極管陣列檢測器測定降糖中藥制劑中的化學(xué)藥品》(中國藥師，2005年第8巻第10期，Page827_829)應(yīng)用反相高效液相色譜法一二極管陣列檢測(RP—HPLC——DAD)測定中藥降糖制劑中可能存在的3種化學(xué)藥品一苯乙雙胍、阿卡波糖、格列本脲，色譜條件為AgilentZORB—AXODSC18(250mmX4.6國，5um);流動(dòng)相醋酸鹽緩沖液(10mmol/L醋酸銨，20mmol/L三乙胺，用醋酸調(diào)節(jié)pH5.5)與乙腈，梯度洗脫，流速0.6mLmin—';檢測波長230nm。但是該工藝需要梯度洗脫，略顯復(fù)雜，而且分離時(shí)間較長，不利于快速鑒定。但是上述方法僅能檢測降糖化學(xué)藥物中的一類或兩類，檢測藥物的品種參差不齊，沒有根據(jù)藥物本身的性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)分類研究。有鑒于此，本發(fā)明從降糖化學(xué)藥物的極性高低著手，針對(duì)磺酰脲類藥物、非磺酰脲類的胰島素促進(jìn)分泌劑和噻唑烷二酮類藥物極性低的特點(diǎn)，提出了一種降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法，格列本脲、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、那格列奈、羅格列酮、鹽酸吡格列酮可實(shí)現(xiàn)完全分離，具有快速、簡便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法。簡單的說，本發(fā)明提供的降糖中藥類產(chǎn)品中非法慘入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法，包括(1)方法高效液相色譜(2)流動(dòng)相醋酸銨一三乙胺一乙腈流動(dòng)相體系，由A和B組成；A:為0.01mol/L醋酸銨和0.02mol/L三乙胺的混合溶液，并用醋酸調(diào)pH到5.5，B為乙腈；A:B的體積比為61:39;流速為O.8—1.2ml/min;(3)色譜柱色譜柱為C18色譜柱；柱溫20—45'C;。(4)紫外檢測波長紫外檢測波長為210nm。(5)將多種低極性降糖化學(xué)藥物混合，制成對(duì)照品溶液，然后進(jìn)行色譜分析，得到各種低極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間；(6)將待分析的降糖中藥類產(chǎn)品制成供試品溶液，然后進(jìn)行色譜分析；當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品中色譜峰的保留時(shí)間和所述低極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間一致時(shí)，且有明顯吸收時(shí)，說明待測樣品中含有該種降糖化學(xué)藥物；否則則無。其中，所述的流動(dòng)相流速優(yōu)選為1.0ml/min，所述的色譜柱柱溫優(yōu)選為30。C，色譜柱規(guī)格為5ym，4.6mmX150mm。所述的低極性降糖化學(xué)藥物為格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈和格列喹酮。所述的對(duì)照品溶液和供試品溶液溶劑為甲醇。所述對(duì)照品溶液含格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈和格列喹酮的一種或多種，優(yōu)選含全部九種，其中，格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮濃度為20ug/ml，瑞格列奈、格列喹酮的濃度為30ug/ml。所述供試品溶液制備過程為膠囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過濾，濾液過0.45Wn濾膜，即得供試品溶液。色譜分析時(shí)進(jìn)樣量為20ri。本發(fā)明的詳細(xì)描述如下-鑒于目前檢測降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入降糖化學(xué)藥物的方法復(fù)雜，分離時(shí)間較長，不利于快速檢測等缺點(diǎn)，申請(qǐng)人經(jīng)過長期實(shí)踐，從降糖化學(xué)藥物的極性高低著手，對(duì)色譜柱和流動(dòng)相等條件進(jìn)行了改進(jìn)，提供了一種快速、簡便、靈敏度高的檢測降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法。本發(fā)明采用高效液相色譜法作為檢測降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法，流動(dòng)相為醋酸銨一三乙胺一乙腈流動(dòng)相體系，A:為0.01mol/L醋酸銨和0.02mol/L三乙胺的混合溶液，并用醋酸調(diào)pH到5.5，B為乙腈；A:B的體積比為61:39;流速為0.8—1.2ml/min;優(yōu)選1.0ml/min。色譜柱采用C18色譜柱，柱溫20—45'C，優(yōu)選3(TC?？筛鶕?jù)實(shí)際需要選擇C18色譜柱的規(guī)格，如粒徑5um，4.6腿X150mm。紫外檢測波長為210nm。進(jìn)樣量為2(M。操作時(shí)，首先需要將各種低極性降糖化學(xué)藥物混合，以得到對(duì)照品溶液，然后進(jìn)行色譜分析，得到各種低極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間；所謂的低極性降糖化學(xué)藥物，這里主要是指格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈和格列喹酮。為了方便一次性的檢測出降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入的所有低極性降糖化學(xué)藥物，也為了保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性，避免其它因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，通常將所有低極性降糖化學(xué)藥物混合，以得到對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液溶劑為甲醇。如將上述糖化學(xué)藥物溶解在甲醇中，格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮濃度為20ug/ml，瑞格列奈、格列喹酮的濃度為30yg/ml。當(dāng)然也可根據(jù)實(shí)際情況選擇低極性降糖化學(xué)藥物中的一種或多種。將對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜分析，得到色譜圖，得到各種低極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間。保留時(shí)間視所用儀器不同會(huì)略有差異，如表1所示，但只要對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜條件完全一致，并不會(huì)影響最終結(jié)果的靈敏度。表1低極性混合樣品由不同高效液相色譜儀分析的保留時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>然后將待分析的降糖中藥類產(chǎn)品制成供試品溶液，以供色譜分析。供試品溶液的溶劑同樣為甲醇，其制備過程為囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過濾，濾液過0.45m濾膜，即得供試品溶液。比對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖，當(dāng)當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品色譜峰的保留時(shí)間和低極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間一致時(shí)，而且有明顯的吸收，說明待測樣品中含有該種降糖化藥；否則則無。本發(fā)明降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法，可檢測出降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入的低極性降糖化學(xué)藥物，酰脲類藥物、非磺酰脲類的胰島素促進(jìn)分泌劑和噻唑烷二酮類藥物低極性藥物鑒定靈敏度高；格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈和格列喹酮可實(shí)現(xiàn)完全分離，具有快速、簡便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)。圖1低極性降糖化藥對(duì)照品溶液分析色譜圖1、格列吡嗪2、那格列奈3、格列齊特4、羅格列酮5、鹽酸吡格列酮6、格列本脲7、格列美脲8、瑞格列奈9、格列喹酮圖2低極性降糖化學(xué)藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2—1格列本脲溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2--2格列喹酮溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2--3瑞格列奈溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2--4格列美脲溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2--5羅格列酮溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2_-6鹽酸吡格列酮溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2--7格列齊特溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2--8格列吡嗪溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2—-9那格列奈溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、高效液相色譜條件流動(dòng)相為醋酸銨—三乙胺一乙腈流動(dòng)相體系，由A和B組成；A:為0.01mol/L醋酸銨和0.02mol/L三乙胺的混合溶液，并用醋酸調(diào)pH到5.5，B為乙腈；A:B的體積比為61:39;流速為0.8—1.2ml/min;流動(dòng)相的流速為1.0ml/min。色譜柱采用C18色譜柱，柱溫30。C,規(guī)格為5ym，4.6ramX150mm。紫外檢測波長為210nm。進(jìn)樣量為20Ml。2、對(duì)照品溶液的分析。將低極性降糖藥物混合在一起，格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮濃度為20yg/ml，瑞格列奈、格列喹酮的濃度為30ug/ml，在優(yōu)化后的低極性降糖藥物分析條件下進(jìn)行分析，分析對(duì)照品溶液的分析圖譜見圖1。3、待分析的降糖中藥類產(chǎn)品分析將待分析的降糖中藥類產(chǎn)品制成供試品甲醇溶液，制備過程為囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過濾，濾液過0.45Pm濾膜，即得供試品溶液。然后將供試品溶液進(jìn)行色譜分析。4、比對(duì)比對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液的色譜圖，當(dāng)當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品色譜峰的保留時(shí)間和低極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間一致時(shí)，而且有明顯的吸收，說明待測樣品中含有該種降糖化藥；否則則無。實(shí)施例2高效液相色譜條件中流動(dòng)相流速為0.8ml/min,柱溫20'C，其余同實(shí)施例1。實(shí)施例3高效液相色譜條件中流動(dòng)相流速為1.2ml/min，柱溫45'C，其余同實(shí)施例1。實(shí)施例4高效液相色譜條件中流動(dòng)相流速為0.9ml/min，柱溫25'C，其余同實(shí)施例l。實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例是對(duì)本發(fā)明方法靈敏度、線性范圍、精密度、回收率等的考察。1、溶液的配制對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品，置于一定刻度的容量瓶中，用甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，配成指定濃度的貯備液。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液使用微量取樣器，分別向容量瓶中加入所需體積的貯備液，用甲醇稀釋至刻度，配成所需的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。供試品溶液的制備膠囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過濾，將濾液過0.45Pm濾膜后，轉(zhuǎn)入高效液相樣品瓶中，由高效液相色譜儀進(jìn)行分析。流動(dòng)相的制備稱取所需藥品的質(zhì)量，溶于一定量的純水中，用指定的酸或堿調(diào)節(jié)pH(需要時(shí)),定容，過0.45Wn濾膜抽濾，超聲脫氣。2、積分條件色譜圖譜分析軟件為Class-VPversion6.1。積分參數(shù)width為5，slope為200，drift為1000。3、檢測限測定使用微量取樣器，按1的操作將精確制備的對(duì)照品溶液進(jìn)行稀釋，配成濃度不同的系列溶液，由高效液相色譜儀分別按實(shí)施例1的色譜測定條件進(jìn)行測定，確定不同樣品的檢測限。檢測限測定結(jié)果見表2。表2降糖藥物的檢測限測定結(jié)果~"藥品名稱進(jìn)樣體積"""檢出濃度~檢測限(信躁比3:1)(jxl)(Hg/ml)(ng)格列吡嗪200,36瑞格列奈200.918格列喹酮200.918格列本脲200.36羅格列酮200.36格列美脲200.510那格列奈200.48格列齊特200,48鹽酸吡格列酮200.244、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按1的操作精確制備對(duì)照品溶液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，制備的樣品溶液由高效液相色譜儀在色譜測定條件下進(jìn)行，測定結(jié)果按2項(xiàng)積分。以測試物濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同降糖藥物的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)(r2)見表3。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。表3降糖化藥溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程藥品名稱線性范圍(Hg)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)(r2)格列本脲50-—600Y=96563,6738X+133822.46150,9998格列喹酮50、'2000Y-45445.3864X+682979.38400.9996瑞格列奈50-1000Y=94335.3844X+9574.63410.9992格列美脲10-IOOOY=47712.7129X+118597,13840.9999羅格列酮50-、800Y=3W43.1648X+367886.50000.9997鹽酸吡格列酮50--^600Y=56887.0887X+452783.66350.9996格列齊特10-600Y-32315.5923X+233350.58550.9988格列吡嗪400Y=51031.7004X-32328.80120.9994那格列奈10-、400Y=31139.0340X+72008.03630.99885、精密度測定按1的操作精確制備對(duì)照品低、中、高三個(gè)濃度的溶液，制備的對(duì)照品溶液由高效液相色譜儀色譜測定條件下進(jìn)行，測定結(jié)果按2項(xiàng)積分。以各樣品測定的峰面積代入相應(yīng)線性回歸方程，計(jì)算濃度。5.1、日內(nèi)精密度在1日內(nèi)分別進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度。處理結(jié)果見表4。表4日內(nèi)精密度(n=5)(—)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4日內(nèi)精密度(n=5)(二)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表4日內(nèi)精密度(n=5)(三)5.2、日間精密度在1日內(nèi)每一樣品分析1次，連續(xù)測定5天，計(jì)算日間精密度。處理結(jié)果見表5。表5日間精密度(n=5)(—)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表5日間精密度(n=5)(二)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>6、回收率測定將降糖中成藥及其它中成藥分別按供試品溶液的制備進(jìn)行處理，在降糖藥物高效液相色譜條件下進(jìn)行分析，選擇對(duì)測定降糖藥物沒有干擾的中成藥作為供試品樣品，供試品膠囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，供試品被研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入一定量的甲醇，精確加入降糖對(duì)照品貯備液或?qū)φ掌?，配成終濃度和精密度測定濃度一致的低、中、高三個(gè)濃度的加樣樣品，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過濾，將濾液過0.45Pm濾膜后，轉(zhuǎn)入高效液相樣品瓶中，由高效液相色譜儀進(jìn)行分析。每份樣品測定1次，測定結(jié)果按2積分條件積分，將所測定的峰面積代入線性回歸方程，通過計(jì)算濃度，考察回收率。測定結(jié)果見表6。除個(gè)別化藥在低濃度時(shí)加樣回收率偏低和相對(duì)偏差較大外，不同的降糖化藥在不同的樣品中加樣回收率均保持了一個(gè)較高的水平，而且在不同中成藥中的回收率的相對(duì)偏差也較小。表6(—)格列本脲回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表6(三)格列奇特回收率加入量(jjg/ml)藥品名稱測定量(jag/ml)回收率平均值(jug/ml)RSD(%)降糖寧44.5889.1650(低)益氣生津降糖膠囊43.5087.0187.07+1.491.71樂脈顆粒43.1886.36降糖舒膠囊42.8785.74降糖寧199.6599.82200(中)益氣生津降糖膠囊203.66101.83100.62+0.860.853樂脈顆粒200.59100.29降糖舒膠囊201.06100.53降糖寧609.47101.58600(高)益氣生津降糖膠囊616.32102.72101.97+0.800.782樂脈顆粒615.24102.54降糖舒膠囊606.23101.04表6(四)瑞格列奈回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表6(五)格列美脲回收率16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表6(七)鹽酸吡格列酮回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>7、實(shí)際樣品的分析將市場上購買到的降糖中成藥和保健品及部分非降糖中成藥按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，將對(duì)照品溶液按對(duì)照品溶液的制備方法制成混合溶液，低極性降糖化藥對(duì)照品混合溶液的濃度如下格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮濃度為20嗎/ml，瑞格列奈、格列喹酮的濃度為30pg/ml。將供試品溶液在低極性降糖藥物分析條件下進(jìn)行分析，每分析5個(gè)低極性供試品溶液分析一次低極性對(duì)照品混合溶液，分析結(jié)束后，比較供試品溶液和對(duì)照品溶液的色譜峰的保留時(shí)間，色譜峰保留時(shí)間一致，而且有明顯的吸收，就可以基本判定該供試品中含有相應(yīng)的對(duì)照品化學(xué)添加物。分析結(jié)果見表7。表7實(shí)際樣品分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>8.2、不同藥檢所對(duì)實(shí)際樣品的比對(duì)分析將樣品標(biāo)號(hào)以盲樣的形式分發(fā)給不同的藥檢所，不同的藥檢所使用高效液相色譜儀，按7的處理?xiàng)l件處理后按低極性分析條件分析實(shí)際樣品，分析結(jié)果見表9。表十二不同藥檢所對(duì)實(shí)際樣品的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>9、分析結(jié)果的驗(yàn)證使用液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC/MS)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行測定。9.1、液質(zhì)聯(lián)用條件使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，梯度洗脫，流動(dòng)相A為0.1。/。甲酸溶液,氨水調(diào)pH至3.5，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫表見表IO。表IO液一質(zhì)聯(lián)用液相梯度洗脫表<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>檢測波長230nm，流速0.2ml/min。質(zhì)譜條件ESI源，源電壓4.5KV，毛細(xì)管溫度27(TC，毛細(xì)管電壓20V，鞘氣流速50arb，正離子檢測，掃描方式采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、全掃描二級(jí)質(zhì)譜(MS2)，質(zhì)量數(shù)范圍1001000。對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品10mg，置于100tnl的容量瓶中，加甲醇適量溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置于50ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(每lm沖含對(duì)照品10ug)。供試品溶液的制備丸劑和片劑均取5粒或5片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法分別精密吸取上述兩種溶液各10ul注入液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，記錄液相色譜圖及一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜圖，通過與對(duì)照品液相色譜圖保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜圖的對(duì)比，確定供試品中是否含有對(duì)照品物質(zhì)。分析結(jié)果見表十四。10、高效液相色譜分析結(jié)果的判定將不同儀器、不同藥檢所的分析結(jié)果和液一質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，無論使用何種型號(hào)的高效液相色譜儀，也不管由那個(gè)藥檢所進(jìn)行分析，凡是液一質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢出有摻入化學(xué)降糖藥的樣品，其它的液相分析結(jié)果都顯示有該物質(zhì)明顯的吸收。由于液一質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在檢測摻雜使假方面是公認(rèn)的最有說服力的技術(shù)，也是國家承認(rèn)的分析檢測結(jié)果，通過和液一質(zhì)聯(lián)用技術(shù)比較，可驗(yàn)證所建立的方法的準(zhǔn)確性。通過比較發(fā)現(xiàn)，如果降糖中成藥或降糖保健品樣品中，有和化學(xué)降糖對(duì)照品保留時(shí)間一致的吸收峰，而且吸收峰明顯，就可以確定該樣品中含有摻入的降糖化藥。表十四液一質(zhì)聯(lián)用法對(duì)實(shí)際樣品的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>11、結(jié)論使用所建立的高效液相法可用于降糖中成藥中的降糖化藥的定性分析。用于定性分析可很好的確定中成藥中摻入的降糖化藥的種類。實(shí)際樣品也確實(shí)在一些降糖中成藥及降糖保健品中檢出了格列本脲、羅格列酮、瑞格列奈、格列美脲和格列齊特，而且含量很高，使用這些藥物將極大的損害糖尿病患者的身體健康。本項(xiàng)目所建立的方法考察了所建立的方法靈敏度、線性范圍、精密度、回收率，結(jié)果顯示該方法有良好的重現(xiàn)性，靈敏度、回收率能夠滿足分析檢測的要求，這些因素可使該類方法很好地用于研究降糖中成藥及降糖保健品中摻入的低極性降糖化藥。權(quán)利要求1、降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法，其特征在于，包括(1)方法高效液相色譜；(2)流動(dòng)相醋酸銨-三乙胺-乙腈流動(dòng)相體系，由A和B組成；A為0.01mol/L醋酸銨和0.02mol/L三乙胺的混合溶液，并用醋酸調(diào)pH到5.5，B為乙腈；A∶B的體積比為61∶39；流速為0.8-1.2ml/min；(3)色譜柱色譜柱為C18色譜柱；柱溫20-45℃；(4)紫外檢測波長紫外檢測波長為210nm；(5)將多種低極性降糖化學(xué)藥物混合，制成對(duì)照品溶液，然后進(jìn)行色譜分析，得到各種低極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間；(6)將待分析的降糖中藥類產(chǎn)品制成供試品溶液，然后進(jìn)行色譜分析；當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品中色譜峰的保留時(shí)間和所述低極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間一致時(shí)，且有明顯吸收時(shí)，說明待測樣品中含有該種降糖化學(xué)藥物；否則則無。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定性分析檢測方法，其特征在于，所述的流動(dòng)相流速為1.0ml/min，所述的色譜柱柱溫為30°C。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定性分析檢測方法，其特征在于，所述的C18色譜柱規(guī)格為5ym，4.6mmX150mm。4、權(quán)利要求l所述的定性分析檢測方法，其特征在于，所述的低極性降糖化學(xué)藥物為格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈和格列喹酮。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定性分析檢測方法，其特征在于，所述的對(duì)照品溶液和供試品溶液溶劑為甲醇。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定性分析檢測方法，其特征在于，所述對(duì)照品溶液含格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列喹酮的一種或多種，優(yōu)選含全部九種，其中，格列吡嗪、格列本脲、羅格列酮、格列美脲、那格列奈、格列齊特、鹽酸吡格列酮濃度為20嗎/ml，瑞格列奈、格列喹酮的濃度為30嗎/ml。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定性分析檢測方法，其特征在于，所述供試品溶液制備過程為膠囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過濾，濾液過0.45Wn濾膜，即得供試品溶液。8、權(quán)利要求1所述的定性分析檢測方法，其特征在于，色譜分析時(shí)進(jìn)樣量為20W。全文摘要本發(fā)明公開了檢測降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法。本發(fā)明所提供的檢測降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入低極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測方法，包括如下步驟1)高效液相色譜條件使用醋酸胺-三乙胺-乙腈流動(dòng)相體系，一定規(guī)格的C18色譜柱，紫外檢測波長，流速為1.0ml/min。2)分析結(jié)果格列本脲、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、那格列奈、羅格列酮、鹽酸吡格列酮可實(shí)現(xiàn)完全分離。3)結(jié)果判斷當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品中色譜峰的保留時(shí)間和2)中降糖化藥的保留時(shí)間一致且有明顯吸收時(shí)，說明待測樣品中含有該種降糖化藥。本發(fā)明具有快速、簡便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/15GK101285803SQ200810085068公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年3月17日優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日發(fā)明者揚(yáng)侯,劉亞琴,萌葉,孫建慧,尤立華,朝克圖,楊秉呼,然聶,趙秀梅,馬家華申請(qǐng)人:北京市東城區(qū)藥品檢驗(yàn)所