專(zhuān)利名稱(chēng)：：磺酸化膽汁酸酶熒光毛細(xì)分析法及酶熒光定量試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及磺酸化膽汁酸酶熒光毛細(xì)分析法及實(shí)現(xiàn)該方法的SBA酶熒光定量試劑盒，屬于臨床生化分析領(lǐng)域。本發(fā)明適用于健康人群肝膽系統(tǒng)的普査、臨床患者肝膽疾病的快速篩查和診斷，尤其適用于新生兒期黃疸、先天性膽道閉鎖癥和肝炎的早期發(fā)現(xiàn)。
背景技術(shù)：
：膽汁酸在肝臟合成，正常情況下99。/。存在于腸肝循環(huán)內(nèi)，進(jìn)入體循環(huán)的量極少。但是肝膽有疾病受損傷時(shí)，膽汁酸逆流入血，導(dǎo)致血中膽汁酸顯著增加。作為體內(nèi)的解毒機(jī)制，血中的膽汁酸發(fā)生磺酸化，使其水溶性增加，容易通過(guò)尿排出體外，使尿中的磺酸化膽汁酸(SBA)與血中SBA變得容易測(cè)定。因此，可以根據(jù)尿中SBA含量的大小診斷肝膽系統(tǒng)機(jī)能是否正常。在臨床檢査中，發(fā)現(xiàn)SBA的測(cè)定與谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶CrGTP)、總膽汁酸(TBA)等血液化學(xué)檢査方法有同等診斷效率(肝膽薛，1995，31,315;Jpn.J.Clin.Chem.1997，26，95;J.Pediatr.Surgery,2002,37,1707;Pediatr.Int,2003,45.281)，并且更具有特異性和靈敏性，是肝膽機(jī)能的重要指標(biāo)。目前，在日本，尿中SBA測(cè)定己成為判斷肝膽系統(tǒng)機(jī)能和診斷肝硬化、肝癌等疾病的一項(xiàng)新指標(biāo)，成為"日本國(guó)民健康保險(xiǎn)"體檢的檢査項(xiàng)目(檢査編碼0715兒童，6208成人，SBA試劑盒法承認(rèn)番號(hào)20800AMZ10064000)。尿中SBA含量的指標(biāo)基準(zhǔn)值新生兒出生后24周內(nèi)，其尿中SBA的正常值為S5|amol/L、或SBAS55nmol/g'CRE(CRE:肌酐校正)；成人尿中SBA的JH常值為^10nmol/L或SBA^8nmol/g'CRE。在國(guó)外，SBA的測(cè)定也有氣相色譜(Lipids.1973,8，47)和高效液相色譜法(Lipids,1978,13,908;J.Chromatogr.1987,415,45)。用這些方法測(cè)定SBA時(shí)，試樣要進(jìn)行抽提、溶劑分解、衍生物化等繁雜的預(yù)處理過(guò)程，非常費(fèi)時(shí)、復(fù)雜，很難真正應(yīng)用到日常的臨床診斷和檢驗(yàn)中。近年來(lái)，也報(bào)道了一些其它方法，如利用甲基吩嗪硫酸二甲脂異魯米諾-過(guò)氧化物酶化學(xué)反應(yīng)體系用于血清中總膽汁酸的測(cè)定，利用SBA磺酸酯酶(BSS)水解SBA建立的酶比色測(cè)定法(Jpn.J.Clin.Chem.,1992，21,249)。后一種方法是一個(gè)先進(jìn)的SBA測(cè)定法。其原理是SBA在BSS作用下水解成p-羥膽汁酸，在3(3-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(3p-HSD)存在下與氧化型輔酶耶-NAD+)作用，生成NADH和3-酮膽汁酸，NADH與硝基四唑藍(lán)(NTB)顯色試劑反應(yīng)，生成有色的甲臢，通過(guò)比色來(lái)定量SBA。但是，由于在反應(yīng)體系中使用了NTB作顯色試劑，其反應(yīng)產(chǎn)物易沉淀，比色皿易發(fā)生吸附、著色，測(cè)定結(jié)果難以達(dá)到準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的臨床檢查要求。在此基礎(chǔ)上，將顯色試劑NTB換成水溶性的WST-1(円本特許平7-33336)，使比色皿吸附著色，空白信號(hào)不穩(wěn)定的情況有所改善?，F(xiàn)有的SBA酶比色測(cè)定法存在的主要問(wèn)題是使用的酶和試劑種類(lèi)太多(BSS、P-HSD、3-酮膽汁酸-厶4-脫氫酶、心肌黃酶、P-NAD、WST-1，ASOD，Tween20，山梨醇，4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES)、酶耗量大，成本高，靈敏度較低，所用的貴重試劑只能一次性使用；而且反應(yīng)產(chǎn)物甲臢類(lèi)，也不完全溶于7jC，定量比f(wàn)eniH頓后也M不同禾體的淑!J^染，如果再利用，必須反復(fù)多次冼凈'劍于自動(dòng)分MB的卿來(lái)說(shuō)條是一個(gè)鵬。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，減少酶和試劑的種類(lèi)和耗量，降低成本，提高靈敏度，消除試劑和;^^WI!淀系統(tǒng)的吸附、著色，實(shí)現(xiàn)貴重酶和試劑的重復(fù)多次使用，減少臨床生化分析廢液量，利于環(huán)境保護(hù)，實(shí)現(xiàn)微量樣品的微量分析；在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)一種新的SBA酶熒光毛細(xì)分析法及實(shí)現(xiàn)該方法的SBA酶熒光定量試劑盒(SBA-FCA-Kit)，實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便的SBA測(cè)定，用于肝膽系統(tǒng)疾病的快速篩查與診斷。本發(fā)明的技術(shù)方案是由測(cè)定原理和測(cè)定方法及SBA-FCA-Kit組成。本發(fā)明的測(cè)定原理SBA在BSS催化作用下水解脫磺酸基，生成3卩-羥膽汁酸；后者在卩-HSD催化作用下與卩-NAD+反應(yīng)轉(zhuǎn)化為3-酮膽汁酸，同時(shí)卩-NAD+被還原成NADH;通過(guò)檢測(cè)NADH的特征熒光強(qiáng)度來(lái)定量SBA;或者為了達(dá)到循環(huán)增敏目的，再使NADH與氧化型電子傳遞體反應(yīng)，生成NAD+和還原型電子傳遞體，后者與刃天青(7-羥基吩噁嗪酮)反應(yīng)生成具有強(qiáng)烈熒光的試鹵靈(3,7-二羥基吩噁嗪)，通過(guò)試鹵靈的熒光強(qiáng)度來(lái)定量SBA。本發(fā)明的測(cè)定方法先將一個(gè)代替常規(guī)熒光試液槽的專(zhuān)用毛細(xì)管定位座(見(jiàn)專(zhuān)利200510021542.8)置于熒光光度計(jì)光路中；適量生物樣品與熒光反應(yīng)液混勻后，在適當(dāng)溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，用一個(gè)固定有BSS和p-HSD的SBA-CBR，利用毛細(xì)現(xiàn)象吸入上述反應(yīng)混合液，然后插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管定位座插孔中，在給定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)條件下，立即測(cè)定SBA-CBR內(nèi)所含反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度，此值作為試劑和樣品的空白值(F》；然后使其繼續(xù)反應(yīng)數(shù)分鐘后，再測(cè)其熒光強(qiáng)度(F2);此值減掉空白值(AF-F2-FD，得到的吸光度增加值(AF)用于定量樣品中的SBA值。毛細(xì)管做為熒光反應(yīng)、測(cè)定或酶固定化的載體。本發(fā)明的各種特征如下本發(fā)明用于實(shí)現(xiàn)SBA酶熒光毛細(xì)分析法的SBA-FCA-Kit試劑盒的示意圖如圖1所示。它包括一根SBA-CBR和一種熒光反應(yīng)液、或兩根SBA-CBR。使用時(shí)，用SBA-CBR和一個(gè)毛細(xì)管定位座替代常規(guī)熒光分析中的試液槽，將其置于熒光分析儀光路中。本發(fā)明包含的熒光反應(yīng)液可以只含有P-NAD+的試劑，也可以含有卩-NAD+、電子傳遞體、刃天青等。本發(fā)明可以將所用的酶固定化，成為SBA固定化酶熒光定量試劑盒(正-SBA-FCA-Kit);也可以使酶不固定化，成為SBA液態(tài)酶熒光定量試劑盒(LE-SBA-FCA-Kit);IE-SBA-FCA-Kit可以根據(jù)用途變成高靈敏固定化酶熒光定量試劑盒(HIE-SBA-FCA-Kit)和低靈敏固定化酶熒光定量試劑盒(L正-SBA-FCA-Kit)。同樣，LE-SBA-FCA-Kit也可以根據(jù)用途變成高靈敏液態(tài)酶熒光定量試劑盒(HLE-SBA-FCA-Kit)和低靈敏液態(tài)酶熒光定量試劑盒(LLE-SBA-FCA-Kit)。本發(fā)明包含的IE-SBA-FCA-Kit主要由一根SBA-CBR和一種熒光反應(yīng)液、或兩根SBA-CBR組成。本發(fā)明包含的HIE-SBA-FCA-Kit，其特征是BSS和3(3-HSD同時(shí)固定化在一根SBA-CBR內(nèi)表面，熒光反應(yīng)液含有P-NAD+、電子傳遞體和刃天青等混合試劑；如果在一根SBA-CBR內(nèi)表面單獨(dú)固定BSS，將p-HSD加入熒光反應(yīng)液內(nèi)而形成的定量試劑盒也屬于此范疇。本發(fā)明包含的LIE-SBA-FCA-Kit的特征是BSS和(3-HSD同時(shí)固定化在一根SBA-CBR內(nèi)表面，但熒光反應(yīng)液中只含有卩-NAD'試劑，通過(guò)測(cè)定NADH的熒光強(qiáng)度來(lái)定量SBA。本發(fā)明也可以將熒光反應(yīng)液固定化在毛細(xì)管內(nèi)，由兩根SBA-CBR組成SBA固定化酶熒光定量雙毛細(xì)管試劑盒(正-SBA-FCA-2C-Kit)。其特征是由SBA-CBR-1和SBA-CBR-2組成。SBA-CBR-1內(nèi)表面同時(shí)固定有(3-HSD、卩-NAD+、電子傳遞體和刃天青，SBA-CBR-2內(nèi)表面固定有BSS、P-HSD、卩-NAD+、電子傳遞體和刃天青，用于高靈敏SBA測(cè)定。進(jìn)一步，SBA-CBR-1內(nèi)表面也可以同時(shí)固定p-HSD和p-NAD+，SBA-CBR-2內(nèi)表面同時(shí)固定有BSS、P-HSD、卩-NAD+，用于低靈敏SBA測(cè)定。本發(fā)明包含的LE-SBA-FCA-Kit主要由1號(hào)液、2號(hào)液、定量毛細(xì)管構(gòu)成。本發(fā)明包含的HLE-SBA-FCA-Kit的特征是1號(hào)液含有p-HSD和熒光反應(yīng)液，2號(hào)液含有BSS、卩-HSD和熒光反應(yīng)液。本發(fā)明包含的LLE-SBA-FCA-Kit的特征是1號(hào)液含有P-HSD、卩-NAD+，2號(hào)液含有BSS、p-HSD、p-NAD+。本發(fā)明包含的LE-SBA-FCA-Kit測(cè)定SBA的過(guò)程是，在一個(gè)空白管和一個(gè)測(cè)定管內(nèi)先加入等量的被測(cè)樣品，再分別將1號(hào)液加入空白管內(nèi)，將2號(hào)液加入測(cè)定管內(nèi)；反應(yīng)一定時(shí)間后，依次將上述兩管中的反應(yīng)混合液吸入定量毛細(xì)管內(nèi)，插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管定位座中，在給定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)條件下，測(cè)定毛細(xì)管內(nèi)所含反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度；根據(jù)空白管(FD和測(cè)定管(F2)的熒光強(qiáng)度差值(M^F2-F。定量樣品中的SBA值。毛細(xì)管在此做為樣品定量、酶熒光反應(yīng)混合液測(cè)定的載體。本發(fā)明所述的電子傳遞體可以從l-甲氧基-5-甲基吩嗪-二甲酯硫酸鹽(l-MPMS)、或心肌黃酶、或麥爾多拉藍(lán)等電子傳遞體類(lèi)中選1種。本發(fā)明的試劑盒可用于已商品化的熒光光度計(jì)或自動(dòng)臨床熒光生化分析裝置，實(shí)施SBA的測(cè)定及研究。本發(fā)明包含的SBA-CBR的制備方法有三個(gè)步驟毛細(xì)管的氨基化修飾、毛細(xì)管中酶的固定化和毛細(xì)管化學(xué)修飾基團(tuán)的封閉。毛細(xì)管的氨基化修飾先用0.050.5mol/LNaOH溶液將毛細(xì)管浸泡12h，用超純水清洗，再用5075%的乙醇溶液浸泡12h，最后用超純水清洗、吹干。然后，將前處理后的毛細(xì)管放入0.12。/。(v/v)作為偶聯(lián)劑的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(以正己垸為溶劑)，在4065。C反應(yīng)46h，使ATPES共價(jià)結(jié)合在毛細(xì)管內(nèi)壁上；最后用無(wú)水乙醇將毛細(xì)管洗凈，吹干；最后，將2.5。/。(v/v)戊二醛試劑吸入毛細(xì)管內(nèi)，在真空狀態(tài)下6(TC放置12h，使戊二醛共價(jià)結(jié)合在ATPES上。毛細(xì)管中酶及試劑的固定化用磷酸緩沖液(pH7.5)洗掉毛細(xì)管中未結(jié)合的戊二醛之后，用毛細(xì)管吸入由磷酸緩沖液配制的11OkU/LBSS和p-HSD溶液，在4°C下旋轉(zhuǎn)固定612h，使BSS和P-HSD的氨基與戊二醛的醛基共價(jià)結(jié)合，最后用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈。毛細(xì)管化學(xué)修飾基團(tuán)的封閉再將固定有BSS、卩-HSD的毛細(xì)管浸泡在l5。/。(w/v)牛血清白蛋白中l(wèi)2h，封閉未結(jié)合的醛基，制成SBA-CBR;最后，將SBA-CBR保存在4°C的磷酸鹽緩沖液中(pH7.5)。本發(fā)明的基本技術(shù)參數(shù)為SBA的測(cè)定范圍在0.1-50|amol/L，檢出限為0.06|amol/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<3.0%，Tris-HCl緩沖液濃度0.050.5mol/L，pH6.59.0，p-NAD+濃度50-80(Vmol/L,BSS和3p-HSD固定化酶的濃度均為210kU/L;酶催化反應(yīng)時(shí)間520min，反應(yīng)溫度204(TC。l-MPMS濃度105(Vmol/L，刃天青濃度105Opmol/L;總反應(yīng)液用量520nL;樣品用量l20|aL;SBA-CBR的長(zhǎng)度為35cm，容量為220pL，內(nèi)徑為0.140.90mm，外徑為0.551.20mm，壁厚為0.100.25mm;其材質(zhì)可以是石英玻璃、光學(xué)玻璃或透明光學(xué)塑料。本發(fā)明使用的酶類(lèi)BSS和P-HSD是己知物質(zhì)，由生物提取而來(lái)。BSS可以按文獻(xiàn)(Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58，889)所述的方法精制而得；|3-HSD、P-NAD+、心肌黃酶、l-MPMS、麥爾多拉藍(lán)可以使用市面銷(xiāo)售的產(chǎn)品，如SigmaChemicalCo.的制品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是顯著降低了貴重酶制劑、化學(xué)試劑和被測(cè)液用量，減少?gòu)U液，提高靈敏度，實(shí)現(xiàn)不連續(xù)的批量臨床樣品快速測(cè)定。a)用SBA-CBR代替常規(guī)的熒光試液槽，實(shí)現(xiàn)酶熒光毛細(xì)分析法；實(shí)現(xiàn)微量樣品的微量分析；b)酶在SBA-CBR中固定化后可以重復(fù)使用多次，克服了液態(tài)酶容易變性和不穩(wěn)定的弱點(diǎn)，能節(jié)約大量的酶、輔酶及其它貴重酶試劑，顯著降低了實(shí)驗(yàn)成本和化學(xué)分析廢液向環(huán)境中的排放量，有利于推廣利用；c)基于酶熒光毛細(xì)分析法制成的SBA酶熒光定量試劑盒，便于攜帶、保存；具有較好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、不易變性失活等良好的理化特性；d)本發(fā)明無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，可以直接測(cè)定，操作簡(jiǎn)便；e)本發(fā)明使用試劑種類(lèi)少，操作耗時(shí)短，適合于不連續(xù)的批量臨床樣品中SBA快速測(cè)定；f)本發(fā)明可成為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)臨床檢驗(yàn)的一個(gè)新方法；g)SBA酶熒光定量試劑盒可用于已商品化的熒光光度計(jì)或自動(dòng)臨床熒光生化分析裝置，實(shí)施SBA的測(cè)定及研究。本發(fā)明可用于尿中SBA的測(cè)定，無(wú)需采血就能實(shí)現(xiàn)肝機(jī)能檢查；也可用于血中SBA的測(cè)定。本發(fā)明適用于臨床檢査中對(duì)肝膽系統(tǒng)疾病的快速篩查和診斷，尤其適用于對(duì)新生兒期及幼兒期黃疸、先天性膽道閉鎖癥和肝炎的早期發(fā)現(xiàn)，這對(duì)保護(hù)人類(lèi)健康具有很重要的實(shí)用意義和社會(huì)意義。圖lSBA實(shí)現(xiàn)酶熒光毛細(xì)分析法的SBA酶熒光定量試劑盒的示意中S樣品、1熒光反應(yīng)液(電子傳遞體、刃天青、卩-NAD+等)、2SBA-CBR、3毛細(xì)管、43-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、5戊二醛、6磺酸化膽汁酸磺酸酯酶(BSS)、7|3-羥基類(lèi)固醇脫氫酶((3-HSD)、8反應(yīng)混合液圖2實(shí)施例1考察SBA-CBR中BSS固定化濃度對(duì)熒光強(qiáng)度影響的曲線(xiàn)3實(shí)施例1考察SBA-CBR中p-HSD用量對(duì)熒光強(qiáng)度影響的曲線(xiàn)4實(shí)施例1考察p-NAD+濃度對(duì)熒光強(qiáng)度影響的曲線(xiàn)5實(shí)施例1考察l-MPMS濃度對(duì)熒光強(qiáng)度影響的曲線(xiàn)6實(shí)施例1考察SBA-CBR中刃天青濃度對(duì)熒光強(qiáng)度影響的曲線(xiàn)7實(shí)施例1考察反應(yīng)體系pH對(duì)熒光強(qiáng)度影響的曲線(xiàn)8實(shí)施例1考察Tris-HCl緩沖液濃度對(duì)炎光強(qiáng)度影響的曲線(xiàn)9實(shí)施例1考察反應(yīng)溫度影響SBA-CBR熒光強(qiáng)度的曲線(xiàn)10實(shí)施例1考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度影響的曲線(xiàn)11實(shí)施例1考察本發(fā)明SBA-CBR日內(nèi)穩(wěn)定性的曲線(xiàn)12實(shí)施例1考察本發(fā)明SBA-CBR日間穩(wěn)定性的曲線(xiàn)13實(shí)施例1考察尿樣空白反應(yīng)時(shí)間對(duì)SBA-CBR影響的曲線(xiàn)14實(shí)施例1用本發(fā)明正-SBA-FCA-Kit測(cè)定SBA標(biāo)準(zhǔn)得到的曲線(xiàn)15實(shí)施例1考察本發(fā)明HIE-SBA-FCA-Kit和HLE-SBA-FCA-Kit的靈敏度曲線(xiàn)16實(shí)施例1用本發(fā)明L正-SBA-FCA法測(cè)定SBA標(biāo)準(zhǔn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖實(shí)施例結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步描述實(shí)施例1本實(shí)施例是考察SBA-CBR(2)中固定化BSS(6)濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)條件激發(fā)波長(zhǎng)540nm，發(fā)射波長(zhǎng)580nm，反應(yīng)液用量18pL，500nmol/L(3-NAD+，5Ojxmol/Ll-MPMS，50[imol/L刃天青，5kU/L卩-HSD(7)，pH8.0，反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10min;在l-10kU/L范圍內(nèi)改變BSS(6)濃度，分別用1.Opmol/L、2.0nmol/L的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液作為測(cè)定樣品，優(yōu)選了SBA-CBR中固定化BSS(6)濃度，結(jié)果見(jiàn)圖2。BSS(6)用量為5kU/L時(shí)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。實(shí)施例2本實(shí)施例是考察SBA-CBR(2)中P-HSD(7)用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。基于以上條件，BSS(6)用量為5kU/L,在l-10kU/L范圍內(nèi)改變p-HSD(7)濃度，考察其對(duì)靈敏度的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3。(3-HSD(7)在l-5kU/L范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；當(dāng)(3-HSD(7)用量為5kU/L時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最人。實(shí)施例3本實(shí)施例是考察p-NAD+濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。p-HSD(7)用量為5.0kU/L，其他實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例2。在50-800fimol/L范圍內(nèi)改變卩-NAD+濃度，考察p-NAD+濃度對(duì)本方法靈敏度的影響。得到的結(jié)果如圖4所示。(3-NAD+在50-400pmol/L范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度隨之逐漸增加，在400|amol/L時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值；當(dāng)p-NAD+濃度高于400|imol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度反而減小。實(shí)施例4本實(shí)施例是考察l-MPMS濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。p-NAD+濃度用量為400pmol/L、其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例3。改變l-MPMS濃度(5、10、25、50、100pmol/L)，考察l-MPMS濃度對(duì)SBA-IE-FCA反應(yīng)體系靈敏度的影響。結(jié)果如圖5所示。熒光強(qiáng)度隨l-MPMS濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度超過(guò)25pmol/L,其熒光強(qiáng)度降低；故最佳l-MPMS濃度為25tunol/L。實(shí)施例5本實(shí)施例是考察刃天青濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。固定l-MPMS濃度為25pmol/L，其他條件同實(shí)施例4，在5-50pmol/L范圍內(nèi)改變?nèi)刑烨酀舛?，測(cè)定反應(yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如圖6所示。反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度隨刃天青濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度超過(guò)1(Vmol/L后，其熒光強(qiáng)度降低。這可能是由于濃度太高導(dǎo)致熒光猝滅所致，本方法所用刃天青的最佳濃度選擇為10nmol/L。實(shí)施例6本實(shí)施例是考察反應(yīng)體系pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。pH是影響酶促反應(yīng)速率和熒光量子產(chǎn)率的一個(gè)重要因素。固定刃天青濃度為10nmol/L，其他實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例5。分別用pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCl緩沖液，改變反應(yīng)體系的酸度，考察反應(yīng)體系pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖可知，pH為8.0時(shí)，熒光強(qiáng)度出現(xiàn)最大值。實(shí)施例7本實(shí)施例是考察Tris-HCl緩沖液濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。固定反應(yīng)體系pH為8.0，其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例6。改變反應(yīng)體系Tris-HCl緩沖液的濃度，用SBA-正-FCA法測(cè)定其熒光強(qiáng)度，考察緩沖液濃度的影響。其結(jié)果如圖8所示。熒光強(qiáng)度隨Tris-HCl緩沖液濃度的增加而增加，當(dāng)其濃度為100mmoI/L時(shí)熒光強(qiáng)度值最大。實(shí)施例8本實(shí)施例是考察反應(yīng)溫度對(duì)SBA-CBR(2)的影響。固定反應(yīng)體系Tris-HCl緩沖液濃度為100mmol/L，其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。用SBA-CBR(2)吸取反應(yīng)混合液(8)后，分別在25、30、35、37、40、45°C，恒溫反應(yīng)15min后，測(cè)定反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖9所示?？梢钥闯觯?dāng)溫度低于37"C時(shí)，隨反應(yīng)溫度增加，反應(yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度也隨著增加；當(dāng)溫度超過(guò)37'C，熒光強(qiáng)度逐漸下降。其原因主要是由于反應(yīng)溫度對(duì)酶促反應(yīng)具有雙重影響。一方面，溫度能加速反應(yīng)；另一方面，升高溫度會(huì)導(dǎo)致酶的變性失活。所以本實(shí)驗(yàn)選用37'C為最佳反應(yīng)溫度。實(shí)施例9本實(shí)施例是考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。固定反應(yīng)體系溫度為37'C，其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例8?？疾旆磻?yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。其結(jié)果如圖IO?？梢钥闯?，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15min時(shí)，其熒光強(qiáng)度達(dá)到恒定值，不再隨著時(shí)間發(fā)生明顯變化。所以，本實(shí)驗(yàn)選定的反應(yīng)時(shí)間為15min。實(shí)施例10本實(shí)施例是考察SBA-CBR(2)的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性。用2[tmol/L和2.5nmol/LGLCA-S標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行日內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和進(jìn)行日間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，日內(nèi)和日間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖ll、圖12所示。從圖12中可以看出，SBA-CBR(2)連續(xù)重復(fù)測(cè)定10次，其熒光強(qiáng)度基本不變，呈現(xiàn)出良好的日內(nèi)穩(wěn)定性。重復(fù)測(cè)定ll次以后，隨測(cè)定次數(shù)增加，熒光強(qiáng)度呈逐漸衰減趨勢(shì)。前10次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%。在圖12中，橫座標(biāo)表示SBA-CBR(2)的保存時(shí)間(天數(shù))，縱座標(biāo)表示相對(duì)熒光強(qiáng)度(％)，第一天用SBA-CBR(2)測(cè)得的相對(duì)熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)(100y。)?？梢钥闯觯?9天內(nèi)，用同一SBA-CBR(2)測(cè)定相同濃度的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液，其熒光強(qiáng)度基本不變；即，SBA-CBR(2)中固定化的酶可保持很好的酶活性；也說(shuō)明，SBA-CBR(2)具有較好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。實(shí)施例11本實(shí)施例是考察尿樣(S)空白反應(yīng)時(shí)間對(duì)SBA-CBR(2)的影響。在25pL尿樣(S)中加入10^L|3-NAD+(400pmol/L)、2.5^L1-MPMS(25nmol/L)、2.5pL刃天青(25pmol/L)，充分混勻后，在37'C下，考察尿樣(S)中本身的干擾物質(zhì)所產(chǎn)生熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，熒光強(qiáng)度在0-10min內(nèi)隨時(shí)間逐漸增加；10-30mhi之間其熒光強(qiáng)度基本不變(見(jiàn)圖13)。這說(shuō)明尿樣(S)中干擾物質(zhì)在lOmin內(nèi)完全反應(yīng)。故尿樣(S)與(3-NAD+、1-MPMS、刃天青的空白反應(yīng)時(shí)間定為lOmin。實(shí)施例12本實(shí)施例是考察本發(fā)明HIE-SBA-FCA-Kit法的抗干擾能力。為了考察尿中共存物對(duì)本發(fā)明測(cè)定尿樣中(S)SBA濃度是否存在干擾，進(jìn)行了此實(shí)驗(yàn)。向2.5nmol/L的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液中分別加入一定濃度的抗壞血酸、尿酸、尿素、葡萄糖、NaCl等，考察加入前后反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算回收率。結(jié)果如表1所示。由結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所用的考察物質(zhì)對(duì)本方法基本無(wú)影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例13本實(shí)施例是用本發(fā)明包含的H正-SBA-FCA-Kit測(cè)定SBA標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)際尿樣的結(jié)果。先將25pL標(biāo)準(zhǔn)液與15pL熒光反應(yīng)液(l)混勻后，在37'C條件下預(yù)孵10min，用一個(gè)固定有BSS和鄧-HSD的SBA-CBR(2)，利用毛細(xì)現(xiàn)象吸入上述反應(yīng)混合液(8)，然后插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管(3)定位座插孔中，在Xex540nrn和、m580nm條件下，立即測(cè)定SBA-CBR(2)內(nèi)所含反應(yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度，此值作為空白值(Fi);然后在37TM吏其繼續(xù)反應(yīng)15min后，再測(cè)其熒光強(qiáng)度(F2);此值減掉空白值(AF:F2-Fi)，得到的熒光強(qiáng)度增加值(AF訴于定量樣品中的SBA值。用一系列不同濃度的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液考察了其濃度與熒光強(qiáng)度之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖14中的b曲線(xiàn)所示?？梢钥闯觯珿LCA-S濃度在0.5-2.5nmol/L范圍與熒光強(qiáng)度呈良好的直線(xiàn)相關(guān)性(y=71.286x+1.8095，r=0.9991)。尿樣(S)測(cè)定過(guò)程和上述相同，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。本發(fā)明的檢出限為0.06|amol/L。上述的熒光反應(yīng)液(l)組成是400nmol/L(3-NAD+、25nmol/L1-MPMS及25nmol/L刃天青。用于SBA-CBR(2)固定化的BSS(6)和(3-HSD(7)的濃度為5kU/L。表2實(shí)際樣品測(cè)定(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例14本實(shí)施例是用本發(fā)明包含的HIE-SBA-FCA-Kit進(jìn)行回收率測(cè)定。取三份尿樣(S)，按樣品:標(biāo)準(zhǔn)=9:1的體積比，在三份尿樣(S)中分別加入25和100nmol/L的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液，用其進(jìn)行回收率測(cè)定，以考察方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果如表3所示，所得尿樣回收率為95.5-105.0%，因此本發(fā)明測(cè)定尿樣(S)SBA的濃度是準(zhǔn)確可靠的。表3尿中SBA添加回收試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例15本實(shí)施例是考察本發(fā)明包含的HIE-SBA-FCA-Kit的精密度。用H正-SBA-FCA-Kit，分別對(duì)濃度為0.5、1.0、2.0nmol/L的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行了11次熒光強(qiáng)度測(cè)定，得到的結(jié)果見(jiàn)表4。fflE-SBA-FCA-Kit的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.4-2.5%之間，其精密度滿(mǎn)足分析定量要求。根據(jù)回歸方程可計(jì)算出本發(fā)明的檢出限為0.06nmol/L(3S/K)。表4HIE-SBA-FCA-Kit的精密度測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例16本實(shí)施例是考察本發(fā)明包含的H正-SBA-FCA-Kit和HLE-SBA-FCA-Kit的靈敏度。先將25pL標(biāo)準(zhǔn)液與15^iL熒光反應(yīng)液(l)混勻后，在37'C條件下預(yù)孵10min，用一個(gè)固定有BSS(6)和(3-HSD(7)的SBA-CBR(2)，利用毛細(xì)現(xiàn)象吸入上述反應(yīng)混合液(8)，然后插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管(3)定位座插孔中，在、540nm和Xem580nrn條件下，立即測(cè)定SBA-CBR(2)內(nèi)所含反應(yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度，此值作為空白值(FD;然后在37'C使其繼續(xù)反應(yīng)15min后，再測(cè)其熒光強(qiáng)度(F2);此值減掉空白值(AF-F2-F,)，得到的熒光強(qiáng)度增加值(AF)用于定量樣品(S)中的SBA值。測(cè)定一系列不同濃度的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液，得到的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖14中的b曲線(xiàn)所示。用HLE-SBA-FCA-Kit，測(cè)定得到的結(jié)果如圖15中的a曲線(xiàn)所示?？梢钥闯?，在各自的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，HIE-SBA-FCA-Kit比HLE-SBA-FCA-Kit的靈敏度要高1倍左右。實(shí)施例17本實(shí)施例是用本發(fā)明包含的HLE-SBA-FCA-Kit測(cè)定GLCA-S和實(shí)際尿樣(S)中的SBA。在一個(gè)空白管和一個(gè)測(cè)定管內(nèi)先各加入25pL標(biāo)準(zhǔn)樣，再分別將25pL熒光反應(yīng)1號(hào)液加入空白管內(nèi)，將25^L熒光反應(yīng)2號(hào)液加入測(cè)定管內(nèi)；在37'C反應(yīng)15min后，依次將上述兩管中的反應(yīng)混合液(8)吸入定量毛細(xì)管(3)內(nèi)，插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管(3)固定座中，在激發(fā)波長(zhǎng)540nm和發(fā)射波長(zhǎng)580nm條件下，測(cè)定毛細(xì)管(3)內(nèi)所含反應(yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度；根據(jù)空白管(FJ和測(cè)定管(F2)的熒光強(qiáng)度差值(AF=F2-F…定量標(biāo)樣中的SBA值。結(jié)果如圖14中的a曲線(xiàn)所示。可以看出，GLCA-S濃度與熒光強(qiáng)度在0.5-10nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(尸38.055x+5.6223，r=0.9989)。尿樣(S)測(cè)定過(guò)程和上述相同，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。RSD為1.4-2.7%。另外，按樣品:標(biāo)準(zhǔn)=9:1的體積比，在所述尿樣(S)中分別加入濃度為25和100pmol/L的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行了回收率測(cè)定(見(jiàn)表5)，尿樣的回收率為95.5-105.7%，因此本發(fā)明測(cè)定尿中SBA濃度是準(zhǔn)確可靠的。經(jīng)計(jì)算本發(fā)明的檢出限為0.4(Hmiol/L。上述的熒光反應(yīng)1號(hào)液和熒光反應(yīng)2號(hào)液中各種酶及試劑濃度如下熒光反應(yīng)l號(hào)液200U/L卩-HSD(7)、500nmol/Lp-NAD+、25j_imol/Ll-MPMS及25|amol/L刃天青；熒光反應(yīng)2號(hào)液200U/LBSS(6)、200U/L(3-HSD(7)、50(Himol/LP-NAD十、25pmol/L1-MPMS及25|amol/L刃天青。表5尿中SBA的測(cè)定結(jié)果和回收實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例18本實(shí)施例是用本發(fā)明包含的LLE-SBA-FCA-Kit檢測(cè)NADH的熒光強(qiáng)度定量尿樣(S)中SBA。在一個(gè)空白管和一個(gè)測(cè)定管內(nèi)先各加入20nL標(biāo)準(zhǔn)樣，再分別將5pL熒光反應(yīng)1號(hào)液加入空白管內(nèi)，將5nL熒光反應(yīng)2號(hào)液加入測(cè)定管內(nèi)；在37。C反應(yīng)10min后，依次將上述兩管中的反應(yīng)混合液(8)吸入定量毛細(xì)管(3)內(nèi)，插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管(3)定位座中，在激發(fā)波長(zhǎng)348nrn和發(fā)射波長(zhǎng)460nrn條件下，測(cè)定毛細(xì)管(3)內(nèi)所含反應(yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度；根據(jù)空白管(F。和測(cè)定管(F2)的熒光強(qiáng)度差值(AF=F2-F!)定量樣品中的SBA值。得到的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖15所示。可以看出，GLCA-S濃度與熒光強(qiáng)度在3.0-50pmol/L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(y咱.3901x+0.6756，r=0.9994)。尿樣(S)測(cè)定過(guò)程和上述相同，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，RSD《。/。。另外，按樣品:標(biāo)準(zhǔn)=9:1的體積比，在三份尿樣(S)中分別加入50、100、200nmol/L的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液，用其進(jìn)行回收率測(cè)定(見(jiàn)表6)，尿樣的回收率為96-106%。因此本發(fā)明檢測(cè)NADH的熒光強(qiáng)度定量尿樣(S)中SBA的方法是準(zhǔn)確可靠的。經(jīng)計(jì)算本發(fā)明的檢出限為2.2(imol/L。上述的熒光反應(yīng)1號(hào)液和熒光反應(yīng)2號(hào)液中各種酶及試劑濃度如下熒光反應(yīng)液(l)l號(hào):200U/Lp-HSD(7)、200nmol/Lp-NAD+;熒光反應(yīng)液(1)2號(hào)200U/LBSS(6)、200U/L卩-HSD(7)、500(amol/Lp-NAD+。表6尿中SBA及回收率的測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例19本實(shí)施例是用本發(fā)明包含的LIE-SBA-FCA-Kit測(cè)定SBA標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)際尿樣的結(jié)果。先將25pL標(biāo)準(zhǔn)液(或尿樣)與15pL熒光反應(yīng)液(l)混勻后，在37'C條件下預(yù)孵10min，用一個(gè)SBA-CBR(2)(固定有BSS和p-HSD)，利用毛細(xì)現(xiàn)象吸入上述反應(yīng)混合液(8)，然后插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管定位座插孔中，在Xex348nrn和460nm條件下，立即測(cè)定SBA-CBR(2)內(nèi)所含反應(yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度，此值作為空白值(F,);然后在38'C使其繼續(xù)反應(yīng)10min后，再測(cè)其熒光強(qiáng)度(F2);此值減掉空白值(AF-F2-F,)，得到的AF用于定量樣品中的SBA值。用一系列不同濃度的GLCA-S標(biāo)準(zhǔn)液考察了其濃度與熒光強(qiáng)度之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖16中所示?？梢钥闯觯珿LCA-S濃度在2.5-50nmol/L范圍與熒光強(qiáng)度呈良好的直線(xiàn)相關(guān)性(y=0.3075x+1.6914，r=0.9998)。上述的熒光反應(yīng)液(l)組成是500pmol/Lp-NAD+;用于SBA-CBR(2)固定化的BSS和卩-HSD(7)的濃度為4kU/L。權(quán)利要求1.一種測(cè)定磺酸化膽汁酸(SBA)的酶熒光毛細(xì)分析法，其特征在于先將一個(gè)代替常規(guī)熒光試液槽的毛細(xì)管定位座置于熒光光度計(jì)或自動(dòng)臨床熒光生化分析裝置光路中；由β-NAD+、電子傳遞體、刃天青等構(gòu)成的熒光反應(yīng)液(1)與適量生物樣品(S)混勻后，在適當(dāng)溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，用一個(gè)固定有磺酸化膽汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)和β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(β-HSD)(7)、稱(chēng)為磺酸化膽汁酸毛細(xì)生物反應(yīng)器(SBA-CBR)(2)的毛細(xì)管(3)，利用毛細(xì)現(xiàn)象吸入上述反應(yīng)混合液(8)，然后插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管(3)定位座插孔中，在給定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)條件下，立即測(cè)定SBA-CBR(2)內(nèi)所含反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度，此值作為樣品和試劑空白值(F1)；然后使其繼續(xù)反應(yīng)數(shù)分鐘后，再測(cè)其熒光強(qiáng)度(F2)；此值減掉樣品和試劑空白值(ΔF＝F2-F1)，得到的吸光度增加值(ΔF)用于定量樣品(S)中的SBA值。毛細(xì)管(3)做為熒光反應(yīng)、測(cè)定或酶固定化的載體。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于被測(cè)樣品(S)在BSS(6)催化作用下水解形成3卩-羥膽汁酸，然后在卩-HSD(7)的催化作用下與卩-NAD+反應(yīng)，生成NADH;NADH與氧化型電子傳遞體(從心肌黃酶、l-MPMS、麥爾多拉藍(lán)等電子傳遞體類(lèi)中選1種)反應(yīng)形成還原型電子傳遞體，后者與刃天青反應(yīng)生成試鹵靈，測(cè)定其熒光強(qiáng)度來(lái)定量SBA。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于可制成含有一個(gè)SBA-CBR(2)和一種熒光反應(yīng)液(l)的SBA固定化酶熒光定量試劑盒(IE-SBA-FCA-Kit)。如果SBA-CBR(2)內(nèi)表面固定有BSS(6)和p-HSD(7)，熒光反應(yīng)液(l)含有p-NAD+、電子傳遞體和刃天青時(shí)將成為一種高靈敏SBA固定化酶熒光定量試劑盒(H正-SBA-FCA-Kit)。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于可制成SBA-CBR(2)內(nèi)表面同時(shí)固定有BSS(6)和卩-HSD(7)、熒光反應(yīng)液(l)只含有P-NAD+的低靈敏SBA固定化酶熒光定量試劑盒(LIE-SBA-FCA-Kit)，通過(guò)測(cè)定NADH的熒光強(qiáng)度來(lái)定量SBA。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于SBA-CBR(2)內(nèi)表面可單獨(dú)固定BSS(6)，將P-HSD包含在熒光反應(yīng)液(l)內(nèi)而形成的定量試劑盒。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于也可以由含有一個(gè)空白SBA-CBR(2)和一個(gè)測(cè)定SBA-CBR(2)組成固定化酶熒光定量雙毛細(xì)管試劑盒(IE-SBA-FCA-2C-Kit)。艮P，空白SBA-CBR(2)內(nèi)表面固定有p-HSD(7)和熒光反應(yīng)液(1)，測(cè)定SBA-CBR內(nèi)表面固定有BSS(6)、卩-HSD(7)和熒光反應(yīng)液(l)的試劑盒。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將各種酶類(lèi)不固定化，可形成一種測(cè)定SBA的液態(tài)酶熒光毛細(xì)分析法，即，在一個(gè)空白管和一個(gè)測(cè)定管內(nèi)加入被測(cè)樣品(S)，再分別將含有卩-HSD(7)和熒光反應(yīng)液(l)的1號(hào)液加入空白管內(nèi)，將含有BSS(6)、(3-NAD+和熒光反應(yīng)液(l)的2號(hào)液加入測(cè)定管內(nèi)；反應(yīng)一定時(shí)間后，依次將上述兩管中的反應(yīng)混合液(8)吸入毛細(xì)管(3)內(nèi)，插入熒光光度計(jì)的毛細(xì)管(3)定位座中，在給定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)條件下，測(cè)定毛細(xì)管(3)內(nèi)所含反應(yīng)混合液(8)的熒光強(qiáng)度；根據(jù)空白管(FO和測(cè)定管(F2)的熒光強(qiáng)度差值(AF-F2-FO定量樣品(S)中的SBA值。8.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于由1號(hào)液、2號(hào)液和定量毛細(xì)管(3)可構(gòu)成高靈敏SBA液態(tài)酶熒光定量試劑盒(HLE-SBA-FCA-Kit);是1號(hào)液含有p-HSD(7)和熒光反應(yīng)液(l)，2號(hào)液含有BSS(6)、p-HSD(7)和熒光反應(yīng)液(l)的SBA定量試劑盒。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于可制成含有1號(hào)液、2號(hào)液和定量毛細(xì)管(3)的低靈敏SBA液態(tài)酶熒光定量試劑盒(LLE-SBA-FCA-Kit)，g卩，是一種1號(hào)液含|3-HSD(7)和(3-NAD+，2號(hào)液含BSS(6)、(3-HSD(7)和p-NAD+的SBA定量試劑盒，通過(guò)測(cè)定NADH的熒光強(qiáng)度來(lái)定量SBA。10.如權(quán)利要求1所述的方法，SBA-CBR(2)的制備其特征在于包括以下三個(gè)步驟毛細(xì)管(3)的氨基化修飾、毛細(xì)管(3)中酶及試劑的固定化和毛細(xì)管(3)化學(xué)修飾基團(tuán)的封閉。1).毛細(xì)管(3)的氨基化修飾先用0.050.5mol/LNaOH溶液將毛細(xì)管(3)浸泡12h，用超純水清洗，再用5075%的乙醇溶液浸泡12h，最后用超純水清洗、吹干。然后，將前處理后的毛細(xì)管(3)放入0.12%(v/v)作為偶聯(lián)劑的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(4)(以正己垸為溶劑)，在4065°<3反應(yīng)46h，使ATPES(4)共價(jià)結(jié)合在毛細(xì)管(3)內(nèi)壁上；最后用無(wú)水乙醇將毛細(xì)管(3)洗凈，吹干；最后，將2.5。/。(v/v)戊二醛(5)試劑吸入毛細(xì)管(3)內(nèi)，在真空狀態(tài)下6(TC放置12h，使戊二醛(5)共價(jià)結(jié)合在ATPES(4)上。2).毛細(xì)管(3)中酶及試劑的固定化用磷酸緩沖液(pH7.5)洗掉毛細(xì)管(3)中未結(jié)合的戊二醛(5)之后，用毛細(xì)管(3)吸入由磷酸緩沖液配制的110kU/LBSS(6)和p-HSD(7)溶液，在4QC下旋轉(zhuǎn)固定612h，使BSS(6)和(3-HSD(7)的氨基與戊二醛(5)的醛基共價(jià)結(jié)合，最后用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈。3).毛細(xì)管化學(xué)修飾基團(tuán)的封閉再將固定有BSS(6)、(3-HSD(7)的毛細(xì)管(3)浸泡在l5。/0(w/v)牛血清白蛋白中12h，封閉未結(jié)合的醛基，制成SBA-CBR(2);最后，將SBA-CBR(2)保存在4°C的磷酸鹽緩沖液中(pH7.5)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了磺酸化膽汁酸(SBA)酶熒光毛細(xì)分析法及SBA熒光定量試劑盒(SBA-FCA-Kit)，屬于臨床生化檢驗(yàn)領(lǐng)域，適用于肝膽疾病的快速篩查和診斷，尤其適用于新生兒期黃疸、先天性膽道閉鎖癥的早期發(fā)現(xiàn)。生物樣品與熒光反應(yīng)液混合后，用一個(gè)含有磺酸化膽汁酸磺酸酯酶、β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶的SBA毛細(xì)生物反應(yīng)器(SBA-CBR)吸入，在給定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下，測(cè)定SBA-CBR的空白熒光強(qiáng)度；然后使其繼續(xù)反應(yīng)一定時(shí)間，再測(cè)其熒光強(qiáng)度；用熒光強(qiáng)度差值定量樣品中的SBA。SBA-FCA-Kit由一個(gè)SBA-CBR和含有β-NAD⁺、電子傳遞體及刃天青等的熒光反應(yīng)液構(gòu)成。文檔編號(hào)G01N21/64GK101221129SQ200810045260公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2008年1月25日優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日發(fā)明者李永生,高秀峰申請(qǐng)人:四川大學(xué)