專利名稱：：對(duì)存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象進(jìn)行診斷和/或治療的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，本發(fā)明涉及心臟病學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及對(duì)存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象進(jìn)行診斷和/或治療的裝置和方法。
背景技術(shù)：
：眾所周知，在長(zhǎng)期高血壓、心瓣膜病或者比如糖尿病的其它慢性疾病的過(guò)程中發(fā)生的慢性心臟負(fù)荷導(dǎo)致心臟肥大，而心臟肥大是心力衰竭的最重要的危險(xiǎn)因素之一。充血性心力衰竭(HF)是一種常見(jiàn)的并且嚴(yán)重而復(fù)雜的臨床綜合癥，在老年人中尤為常見(jiàn)，充血性心力衰竭的特點(diǎn)在于心臟收縮功能減退和運(yùn)動(dòng)耐力下降。心力衰竭的癥狀還包括肺及外周性水肺、疲勞和/或呼吸困難。因?yàn)槠渌鞴俳邮詹坏阶銐虻难?，所以?yán)重的心力衰竭還會(huì)導(dǎo)致其它器官的功能下降。然而，并不是所有肥大的心臟最終都會(huì)衰竭。因此，盡管相當(dāng)多的病人發(fā)生有威脅生命的并發(fā)癥，但是其他病人可以長(zhǎng)時(shí)間地保持穩(wěn)定。到目前為止，還沒(méi)有完全了解在這種從肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)變之前并且預(yù)示這種轉(zhuǎn)變的分子變化。因?yàn)樵缙阼b別存在發(fā)生高血壓終末器官損害(例如，心力衰竭)的風(fēng)險(xiǎn)的病人可以防止病情的快速發(fā)展，所以優(yōu)選的是能夠在實(shí)際發(fā)生心力衰竭之前鑒別(診斷)可能出現(xiàn)心力衰竭的那些病人。因此可以對(duì)早期診斷的病人進(jìn)行治療，從而防止心力衰竭發(fā)作。另外，優(yōu)選的是能夠鑒別那些經(jīng)歷心力衰竭痛苦的病人，這些病人處于發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)中。目前的方法能夠可靠地排除實(shí)際出現(xiàn)心力衰竭，但是不能可靠地證明存在心力衰竭，這些方法也不能預(yù)測(cè)已確診的心力衰竭的結(jié)果，或者預(yù)測(cè)心力衰竭的發(fā)生。因此，需要有一種筒單且可靠的方法來(lái)預(yù)測(cè)心力衰竭發(fā)作的可能性和/或預(yù)測(cè)已確診的心力衰竭的結(jié)果。另外，開(kāi)發(fā)在心力衰竭和/或其并發(fā)癥出現(xiàn)之前對(duì)存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的病人進(jìn)行治療的裝置和方法在臨床上是非常重要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供可以鑒別具體存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的病人和/或具體存在發(fā)生心力衰竭并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的病人的"^斷方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供對(duì)存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)和/或存在發(fā)生心力衰竭并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的病人進(jìn)4于治療的裝置和方法。通過(guò)提供對(duì)存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象進(jìn)行診斷的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，該方法包括以下步驟(a)確定一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記在所述受試對(duì)象的生物樣品中的水平；(b)將所述生物標(biāo)記的水平與同一生物標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較；(c)確定生物標(biāo)記的水平是否表示存在發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，其中，所述生物標(biāo)記是溶酶體整合膜蛋白-2(LIMP-2)和/或Kriippel樣因子15(KLF-15)。在為獲得本發(fā)明而進(jìn)行的研究中，許多基因被鑒別為與發(fā)生心力衰竭的過(guò)程相關(guān)。被鑒別的基因已經(jīng)列在了表2中。另外，已經(jīng)表明用所述基因編碼的特定多肽確實(shí)在機(jī)制上聯(lián)系到心力衰竭。已經(jīng)具體地表明通過(guò)表2的基因編碼的特定蛋白與造成從心臟肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制相關(guān)，從而這些特定蛋白可以用作鑒別存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的病人的生物標(biāo)記。另外，這些蛋白、和/或?qū)λ龅鞍拙幋a的基因、和/或所述蛋白和/或基因的多肽和/或多核苷酸片段或變異體可以用作治療那些存在風(fēng)險(xiǎn)的病人的目標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)具體示出了特定的閏盤組分(具體地為溶酶體整合膜蛋白-2(LIMP-2)和Kriippel樣轉(zhuǎn)錄因子15(KLF-15))與預(yù)測(cè)從心臟肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制相關(guān)，并且可以被合適地用作鑒別存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的生物學(xué)標(biāo)記(生物標(biāo)記)。根據(jù)本發(fā)明，由此發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)確定所述受試對(duì)象的生物樣品中的一個(gè)或多個(gè)被鑒別的生物標(biāo)記的水平并且將所述標(biāo)記的水平與標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較來(lái)鑒別存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象。所述標(biāo)準(zhǔn)水平來(lái)自于健康的受試對(duì)象，即，標(biāo)準(zhǔn)水平是健康人(即，沒(méi)有心臟疾病的人)的所述生物樣品中的所述生物標(biāo)記的水平。如果與所述標(biāo)準(zhǔn)水平相比，才企測(cè)的生物標(biāo)記的水平發(fā)生改變，例如，被提高或被降低(取決于有關(guān)的特異性生物標(biāo)記)，則受試對(duì)象存在發(fā)生HF的風(fēng)險(xiǎn)和/或發(fā)生嚴(yán)重心力衰竭并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。例如對(duì)于成功地尋找潛在的疾病和/或通過(guò)例如對(duì)確診病人進(jìn)行治療來(lái)防止進(jìn)一步的心肌功能障礙和臨床惡化來(lái)說(shuō)，早期診斷心力衰竭，優(yōu)選地在出現(xiàn)臨床癥狀之前診斷心力衰竭是必要的。在為獲得本發(fā)明而進(jìn)行的研究中，調(diào)查了來(lái)自由于高血壓而肥大但是通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)(超聲波心動(dòng)描記術(shù))呈現(xiàn)良好功能并且代償?shù)?、然而隨后被證明發(fā)生心力衰竭的心臟的大量基因的基因表達(dá)譜。將上述表達(dá)譜與從也是由于高血壓而肥大、通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)(超聲波心動(dòng)描記術(shù))呈現(xiàn)相同的良好功能并且代償?shù)摹⒌请S后證明沒(méi)有發(fā)生心力衰竭而是保持穩(wěn)定的心臟獲得的基因表達(dá)語(yǔ)進(jìn)行比較。可見(jiàn)，根據(jù)本發(fā)明，被鑒別的預(yù)測(cè)隨后發(fā)生心力衰竭的基因已經(jīng)被證明成為肥大和向心力衰竭轉(zhuǎn)變的新穎的且關(guān)鍵的調(diào)節(jié)劑。這些基因已經(jīng)在表2中列出。接著，鑒別特定的優(yōu)選生物標(biāo)記，具體地為，與特定閏盤有關(guān)的生物標(biāo)記。閏盤(1D)形成構(gòu)成心臟中的心臟纖維的心臟肌細(xì)胞之間的連接。由此閏盤是提供細(xì)胞之間的機(jī)械結(jié)合和電結(jié)合并且支持心臟組織的同步收縮的專門的細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，由此已經(jīng)證明與表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)水平相比，心臟中的LIMP-2的表達(dá)增加鑒別出那些有傾向發(fā)生明顯心力衰竭傾向的肥大心臟。因此，盡管在LIMP-2缺失小鼠中心臟發(fā)育是正常的(Gamp等，2003),但是在這些小鼠中，高血壓導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病。已經(jīng)證明了LIMP-2結(jié)合到重要的心臟粘著連接蛋白N4丐粘蛋白，并且對(duì)于確保N-鈣粘蛋白和(3-連環(huán)蛋白之間的合適的相互作用是必需的。還發(fā)現(xiàn)LIMP-2的表達(dá)在處于發(fā)生心力衰竭邊緣的肥大的大鼠心臟中增加，從而表明心臟肌細(xì)胞的LIMP-2表達(dá)增加預(yù)示心臟肌細(xì)胞不能正常響應(yīng)機(jī)械力。這樣，增加的LIMP-2表達(dá)可以被視為肌細(xì)胞竭力響應(yīng)變差的負(fù)荷，并且指示即將到來(lái)的衰竭。此外，證明了在臨床上具有嚴(yán)重壓力負(fù)荷的病人中，LIMP-2表達(dá)明顯增力口。通過(guò)確定高血壓的受試對(duì)象中的LIMP-2蛋白水平和/或編碼LIMP-2的基因表達(dá)水平，并且將上述水平與標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較，隨后確定該水平是否表示存在發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，從而可以在非常早的階段鑒別可能屈服于壓力的心肌。具體地講，與標(biāo)準(zhǔn)水平相比，LIMP-2蛋白的水平增加和/或LIMP-2基因表達(dá)的水平增加表示存在發(fā)生心力衰竭和/或與心力衰竭有關(guān)的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。在為獲得本發(fā)明而進(jìn)行的研究中，還示出了編碼Kriippel樣因子15(KLF-15)的基因表征了快速發(fā)展為心力衰竭的肥大心臟。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR證實(shí)了以上發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)PCR證明了在代償?shù)腖VH中，KLF-15被下調(diào)；而在快速發(fā)展為衰竭的肥大心臟中，KLF-15被進(jìn)一步明顯地抑制。還證明了KLF-15在心臟肌細(xì)胞中起到心臟肥大的抑制劑的作用。因此，確定高血壓的受試對(duì)象中KLF-15蛋白水平和/或編碼KLF-15的基因表達(dá)水平，并且將上述水平與標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較，對(duì)于在非常早的階段鑒別可能發(fā)生心力衰竭的那些病人也是有用的。在KLF-15的情況下，與標(biāo)準(zhǔn)水平相比，生物樣品中KLF-15蛋白的水平下降和/或KLF-15基因表達(dá)下降表示發(fā)生心力衰竭。本發(fā)明涉及體內(nèi)方法和體外方法，體內(nèi)方法為在體內(nèi)確定生物樣品中的生物標(biāo)記的水平的方法。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，對(duì)從個(gè)體獲得的生物樣品中，在體外確定生物標(biāo)記的水平。為了在體外確定本發(fā)明的生物標(biāo)記的水平，可以使用任何體液的任何適合的生物樣品，所述生物樣品可以包括通過(guò)該研究確定的生物標(biāo)記。優(yōu)選地，從由血液、血漿、血清、心臟組織組成的組中選擇生物樣品。更優(yōu)選地，生物樣品是外周血樣品、或者從外周血得到的血漿或血清樣品。例如，可以容易地從病人取得外周血樣品，而不需要復(fù)雜的侵入過(guò)程，例如，不需要導(dǎo)管插入術(shù)?？梢愿鶕?jù)公知技術(shù)來(lái)處理生物樣品，從而制備待測(cè)的樣口口C0為了測(cè)量本發(fā)明的生物標(biāo)記的水平，可以采用本領(lǐng)域y^知的傳統(tǒng)方法。當(dāng)生物標(biāo)記是蛋白和z或蛋白的片段和/或變異體時(shí)，可以采用幾種傳統(tǒng)方法來(lái)確定特定蛋白、和/或該蛋白的片段和/或變異體的水平，這些傳統(tǒng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如，可以通過(guò)利用免疫檢測(cè)方法(例如，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))來(lái)測(cè)量標(biāo)記的水平，從而提供簡(jiǎn)單的、能夠重現(xiàn)的并且可靠的方法。在這樣的檢測(cè)中使用的抗體是可以獲得的，并且可以利用開(kāi)發(fā)抗體的公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)另外的(多克隆和單克隆)抗體。此外，用于測(cè)量生物蛋白標(biāo)記的水平的其它方法可以包括(免疫)組織化學(xué)、免疫蛋白印跡、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)、RIA、竟?fàn)帣z測(cè)等以及它們的任意組合。在體內(nèi)，可以通過(guò)標(biāo)記并跟蹤針對(duì)感興趣的蛋白之一的特異性抗體來(lái)確定例如非分泌蛋白的水平。通過(guò)所謂的"分子成像"技術(shù)呈現(xiàn)心臟中的蛋白量。當(dāng)生物標(biāo)記是基因、和/或基因的多核香酸片段和/或變異體例如DNA、cDNA、RNA、mRNA等(例如，編碼特定蛋白的基因或轉(zhuǎn)錄后的mRNA))時(shí)，可以通過(guò)例如公知的分子生物檢測(cè)(例如，利用指向特定多核苦酸的探針的原位雜交技術(shù))來(lái)測(cè)量例如心臟活檢物中的生物標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明可以使用的其它核酸類檢測(cè)包括RT-PCR、核酸類ELISA、Northern印跡等以及它們的任意組合。為了提高診斷方法的特異性和/或靈敏性，本發(fā)明的方法可以包括檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)其它(生物)標(biāo)記的水平，即，本發(fā)明的生物標(biāo)記的檢測(cè)可以適當(dāng)?shù)嘏c指示發(fā)生心力衰竭的其它標(biāo)記的檢測(cè)相結(jié)合。本發(fā)明還涉及用于執(zhí)行如上所述的診斷方法的試劑盒。本發(fā)明具體涉及用于鑒別存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象的這樣的診斷試劑盒，所述試劑盒包括用于容納所述受試對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)生物樣品的裝置和用于確定所述受試對(duì)象的所述生物樣品中的生物標(biāo)記的水平的裝置。因此，提供了一種試劑盒，該試劑盒可以用作可靠并且簡(jiǎn)易的診斷工具。用于容納生物樣品的裝置例如可以包括標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板的孔。用于確定所述受試對(duì)象的所述生物樣品中的與閏盤相關(guān)的生物標(biāo)記的水平的裝置例如可以包括適于檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明鑒別的生物標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)特異性抗體、多核苦酸探針、引物等。所述試劑盒還可以包括校準(zhǔn)裝置和使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的生物標(biāo)記和/或它們的片段和/或功能性變異體在用于鑒別預(yù)防和Z或治療心力衰竭的化合物的篩選方法中的用途。在具體實(shí)施例中，用于鑒別預(yù)防和/或治療心力衰竭的化合物的方法包括以下步驟(a)用在表2中列出的多核苷酸編碼的多肽與一種或多種化合物接觸，優(yōu)選地，表2中列出的多核苦酸為KLF-15和/或LIMP-2、和/或它們的片段和/或變異體；(b)確定所述化合物與所述多肽的結(jié)合親和力；(c)用表現(xiàn)出至少IO微摩爾的結(jié)合親和力的化合物接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞群；(d)鑒別能夠預(yù)防和/或治療心力衰竭的化合物。在本發(fā)明的篩選方法中，待測(cè)的多肽可以在體外進(jìn)行檢測(cè)，例如，在溶液中游離、附于固體載體、負(fù)載在細(xì)胞表面上、或者位于細(xì)胞內(nèi)，或者可以在體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。為了執(zhí)行所述方法，可行的是將本發(fā)明的多肽或者化合物固定從而便于將多肽的復(fù)合體與非復(fù)合體分離，以及提供自動(dòng)的檢測(cè)。本發(fā)明的多肽與化合物的相互作用(例如，結(jié)合)可以在適于容納反應(yīng)物的任何容器中完成。這種容器的示例包括微量滴定板、試管和微型離心管?；衔锱c多肽的結(jié)合親和力可以通過(guò)例如本領(lǐng)域已知的方法來(lái)測(cè)量，例如，利用表面等離子體共振生物傳感器(Biacore)、通過(guò)利用標(biāo)記化合物的飽和結(jié)合分析(例如，Scatchard和Lindmo分析)、經(jīng)過(guò)置換反應(yīng)、通過(guò)差示UV分光光度計(jì)、熒光偏振檢測(cè)、熒光成像板閱讀儀(FLIPR)系統(tǒng)、突光共振能量轉(zhuǎn)移和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移。化合物的結(jié)合親和力也可以用解離常數(shù)(Kd)或者IC50或EC50來(lái)表示。IC50表示將另一配體與多肽的結(jié)合抑制50。/。所需要的化合物的濃度。EC50表示獲得體外的最大效果的50%所需要的濃度。解離常數(shù)Kd是配體與多肽的結(jié)合程度的尺度，它相當(dāng)于使多肽上的結(jié)合位剛好飽和一半所需要的配體濃度。具有高親和力結(jié)合的化合物具有低的Kd、IC50和EC50值，即，在100nM到lpM的范圍內(nèi)；中等到低的親和力結(jié)合涉及高的Kd、IC50和EC50值，即在孩i摩爾范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及表2中列出的基因和/或蛋白(優(yōu)選地為KLF-15和/或LIMP-2基因和/或蛋白)在制備藥物中的用途，所述藥物是預(yù)防和/或治療心力衰竭的預(yù)防性和/或治療性的藥物。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及表2中列出的基因和/或蛋白(優(yōu)選地為KLF-15和/或LIMP-2基因和/或蛋白)的調(diào)節(jié)劑在制備預(yù)防和/或治療心力衰竭的預(yù)防性和/或治療性的藥物中的用途。在本申請(qǐng)中，調(diào)節(jié)劑可以為刺激根據(jù)本發(fā)明被發(fā)現(xiàn)為降低的一種或多種生物標(biāo)記的表達(dá)和/或增加所述一種或多種生物標(biāo)記的水平的任何化合物(例如，激動(dòng)劑)，或者可以是抑制根據(jù)本發(fā)明被發(fā)現(xiàn)為增加的一種或多種生物標(biāo)記的表達(dá)和/或降低所述一種或多種生物標(biāo)記的水平的任何化合物(例如，拮抗劑)。所述藥物可以為蛋白類分子，例如，針對(duì)蛋白標(biāo)記的抗體、和/或它們的片段和Z或變異體。本發(fā)明還包括嵌合的單鏈和人化抗體，以及Fab片段和Fab表達(dá)庫(kù)的產(chǎn)物與Fv片段和Fv表達(dá)庫(kù)的產(chǎn)物?？蛇x地，所述藥物可以為核酸類分子。基因下調(diào)可以利用例如反義核酸在翻譯或轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)。反義核酸是能夠與編碼蛋白和/或?qū)?yīng)的mRNA的核酸中的全部或者一部分進(jìn)行特異性雜交的核酸。反義核酸、編碼反義RNA的DNA的制備在本領(lǐng)域是已知的。所述藥物還可以包含小干擾(發(fā)夾)RNA(siRNA)。siRNA通過(guò)在序列上與沉默RNA同源的雙鏈DNA(dsDNA)來(lái)調(diào)節(jié)基因沉默的翻"i,后加工。siRNA的制備在本領(lǐng)域是已知的。類似地，基因上調(diào)(或過(guò)表達(dá))可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，調(diào)節(jié)劑是TGFfi的抑制劑。根據(jù)本發(fā)明，示出了KLF-15的抑制是發(fā)生衰竭傾向形式的肥大的關(guān)^t步驟，并且TGFfi強(qiáng)烈抑制了KLF-15?，F(xiàn)在在不同領(lǐng)域正在開(kāi)發(fā)TGFJ3的抑制劑，從而可以適當(dāng)?shù)赜糜陂_(kāi)發(fā)預(yù)防和/或治療心力衰竭的預(yù)防性和/或治療性的藥物。根據(jù)本發(fā)明可以使用的合適的TGFfi抑制劑的示例是美國(guó)洛杉磯的Scios有限公司制造的TGFJ3受體抑制劑，該公司在他們的網(wǎng)站(http:〃www.sciosinc.com/scios/tgf)上指出"ScioshasdevelopednovelandpotentsmallmoleculeinhibitorsdesignedtoinhibittheactionofTGF-betaatitsreceptor.Thesesmallmoleculeshavebeenshowntobeeffectiveinreducingscarformation(fibrosis)whengivenorallytoanimals.Sciosexpectstoadvancetwoleadmolecules,representingdifferentchemicalclasses,intopreclinicaldevelopmentthatcouldpotentiallybeusedtotreatdiseaseconditionsinpatientswithsignificantunmetmedicalneeds(Scios已經(jīng)開(kāi)發(fā)出新穎的并且有效的小分子抑制劑，用來(lái)通過(guò)抑制TGFJ3的受體來(lái)抑制TGFJ3的行為。這些小分子已經(jīng)示出當(dāng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行口服時(shí)在減少瘢痕形成(纖維化)方面是有效的。Scios希望使代表不同化學(xué)類的兩種主導(dǎo)分子進(jìn)入臨床前開(kāi)發(fā)，這種開(kāi)發(fā)可以潛在地用于應(yīng)對(duì)醫(yī)學(xué)需要嚴(yán)重未滿足的病人的病情)，,。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明鑒別的蛋白在提供診斷裝置方面的用途，所述診斷裝置用于對(duì)鑒別的蛋白中的一種或多種進(jìn)行(分子)成像，從而評(píng)價(jià)蛋白的水平，并因此鑒別存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象。所述診斷裝置例如可以包括針對(duì)生物蛋白標(biāo)記的標(biāo)記抗體。通過(guò)下面的附圖和示例進(jìn)一步示出本發(fā)明。附圖圖1:LIMP-2在Ren-2大鼠中的表達(dá)增加。圖1A:在IO周周齡獲取左心室心臟活檢物，Ren-2大鼠顯示出相當(dāng)?shù)男呐K肥大，縮短率不能將即將發(fā)生心力衰竭的大鼠或保持代償?shù)拇笫髤^(qū)別開(kāi)。在15周和18周周齡之間，一部分Ren-2大鼠發(fā)生心力衰竭，剩余的大鼠保持代償直到在21周周齡被處死。*,尸〈5e—6。圖1B:通過(guò)對(duì)10周周齡的肥大的Ren-2大鼠進(jìn)行微陣列分析，與保持代償?shù)姆蚀驦V(compLVH，n=6)和對(duì)照大鼠(n=4)相比，發(fā)現(xiàn)在有衰竭傾向的大鼠(有HF傾向的LVH,n=4)中LIMP-2mRNA明顯過(guò)表達(dá)。圖1C:與代償?shù)腞en-2大鼠(comp,n=6)相比，在晚期衰竭的Ren-2大鼠(HF，n=9)中LJMP-2蛋白被上調(diào)。與對(duì)照大鼠(n=6)相比，衰竭和代償?shù)腞en-2大鼠均顯著增加了LIMP-2蛋白的水平。*,與對(duì)照大鼠相比尸<0.05;**,與對(duì)照大鼠相比尸<0.01;$,與comp相比尸0.05;Mwm,分子量標(biāo)記；au,任意單位。圖2:AngII處理的LIMP-2KO(KOAng)小鼠具有擴(kuò)張性心肌病。圖2A:WTAng小鼠(n=4)明顯增加了它們的LV重量，而KOAng(n=14)小鼠沒(méi)有明顯增加LV重量(*,與WT(n=8)和KOAng相比)。在KOAng小鼠中，單個(gè)M^細(xì)胞沒(méi)有增加它們的體積(WT和KO,n=4;WTAng和KOAng，n=5;肌細(xì)胞面積(au):264±42對(duì)WTAng中的308士14;*，尸O.Ol)。條狀物表示50pm。圖2B:LIMP-2KO(n=3)和WT(n=4)小鼠響應(yīng)AngII示出了相當(dāng)?shù)难獕?。圖2C:AngII處理的WT(n=8)和KO(n=8)在BNP和ANFmRNA表達(dá)方面示出了相當(dāng)?shù)脑黾?*,與基礎(chǔ)狀態(tài)相比(n=4)P<0.05)，同時(shí)使得askamRNA表達(dá)在KOAng小鼠中明顯較小的增加，這與它們減小了的肌細(xì)月包體積一致(*，與KO(n=4)相比);$，與WTAng相比Z3〈0.05。圖2D:WT(n=10)和KO(n=ll)小鼠(0天)的基礎(chǔ)狀態(tài)的超聲波心動(dòng)描記術(shù)參數(shù)類似。AngII注射14天和28天之后，野生型小鼠的LV壁明顯變得肥大，而剔除小鼠沒(méi)有顯示出肥大而是擴(kuò)張(*，與基礎(chǔ)狀態(tài)和KOAng相比PO.005;$，與基礎(chǔ)狀態(tài)和WTAng相比PO.005)。圖2E:在KOAng小鼠中，p-腎上腺素響應(yīng)多巴酚丁胺而下降(WT和KO，n=14;WTAng，n=4;KOAng，n=9;*，尸<0.005)。LVW/BW,相對(duì)于體重而才交正的LV重量。圖3:AngII處理的LIMP-2KO小鼠具有大塊間質(zhì)纖維化。AngII處理的LIMP-2剔除(n=4)和野生型(n=5)小鼠的LV的天狼猩紅染色顯示在剔除小鼠中存在明顯的間質(zhì)纖維化(*，與WTAng和KO基礎(chǔ)狀態(tài)相比/30.02),而用AngII處理的野生型和剔除的小鼠均顯示出類似程度的血管周纖維化。條狀物表示250(im。圖4:AngII處理的LIMP-2KO小鼠顯示出肌細(xì)胞混亂。結(jié)蛋白染色的AngII處理的LIMP-2KO小鼠的心臟月幾細(xì)胞顯示出混亂，并且具有混亂的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如這些小鼠的更高的和更多的反復(fù)無(wú)常的結(jié)蛋白表達(dá)所示。條狀物表示250拜。圖5:在其它形式的心臟壓力下，LIMP-2表達(dá)被上調(diào)。圖5A:在新生大鼠心臟肌細(xì)胞中，6小時(shí)拉伸增加了LIMP-2mRNA表達(dá)(每組n=4)。圖5B:將經(jīng)過(guò)10周訓(xùn)練的大鼠(每周5天，11=6)與沒(méi)有肥大的對(duì)照大鼠(11=7)進(jìn)行比較，在經(jīng)過(guò)10周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的大鼠的肥大心肌中，LIMP-2mRNA也被上調(diào)。圖5C:將經(jīng)受主動(dòng)脈狹窄的病人(LVH,n=20)與沒(méi)有肥大的對(duì)照病人(n=7)進(jìn)行比較，在主動(dòng)脈狹窄的病人的心肌中LIMP-2mRNA也被上調(diào)。*，與對(duì)照物相比尸O.05;**,與對(duì)照物相比PO.01;LVH,左心室肥大。圖6:LIMP-2存在于心臟肌細(xì)胞的質(zhì)膜中，并且對(duì)于閏盤功能是重要的。圖6A:用抗LIMP-2免疫染色的壓力超負(fù)荷小鼠LV的埋在石蠟中的組織切片顯示陽(yáng)性染色不僅存在于室間隔中(*)，而且也存在于心臟肌細(xì)胞的質(zhì)膜中()。刻度條表示250|im。圖6B:壓力超負(fù)荷大鼠的LV組織切片的采用抗LIMP-2的免疫電子顯微技術(shù)也示出了LIMP-2存在于質(zhì)膜中()?？潭葪l表示lpm。圖6C:電子顯微技術(shù)示出了AngII處理的野生型小鼠的正常的閏盤，而在AngII處理的LIMP-2KO小鼠中，閏盤具有更高程度的巻曲和更高濃度的粘著連接(右圖的黑色斑點(diǎn)增加)，這與這些小鼠中的擴(kuò)張性心肌病并發(fā)。條狀物表示2pm。M,線粒體；ID,閏盤；a,粘著連接；d,橋粒。圖7:LIMP-2調(diào)節(jié)鈣粘蛋白分布。圖7A:在新生大鼠心室肌細(xì)胞中，LIMP-2結(jié)合到鈣粘蛋白。LIMP-2被免疫沉淀(IP),在全細(xì)胞裂解液(輸入)、上清液(sup)和沉淀的蛋白裂解液(IP)中，鈣粘蛋白被免疫印跡(IB)。心臟肌細(xì)胞的鈣粘蛋白含量的一部分被LIMP-2結(jié)合。圖7B:利用抗全鈣粘蛋白(紅色)和抗LIMP-2(綠色)將對(duì)照受試對(duì)象和2位心力衰竭病人的組織切片免疫熒光染色。箭頭()示出了LIMP-2和4丐粘蛋白在心臟肌細(xì)胞的ID中共位。條狀物表示50|im。圖7C:利用抗全4丐粘蛋白將AngII處理的LIMP-2剔除和野生型LV的組織切片染色。在野生型小鼠中，鉤粘蛋白分布被限制于閏盤，引起鈣粘蛋白規(guī)則地出現(xiàn)，而在LIMP-2K0小鼠中，定位后的鈣粘蛋白已經(jīng)丟失了處于閏盤的嚴(yán)格位置而產(chǎn)生的典型圖案。條狀物表示250,圖8:LIMP-2通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸化的(3-連環(huán)蛋白與鈣粘蛋白的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)閏盤完整性。圖8A:用針對(duì)LIMP-2的shRNA(shLIMP-2)或?qū)φ誷hRNA處理過(guò)的新生大鼠心臟肌細(xì)胞的裂解液的免疫印跡(IB)。培養(yǎng)10天之后，心臟肌細(xì)胞顯示抑制了92%的LIMP-2蛋白。通過(guò)GAPDH確認(rèn)了相等的蛋白負(fù)荷。圖8B:與對(duì)照裂解液相比，在shLIMP-2裂解液中用抗全4丐粘蛋白進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)(IP)之后，免疫印跡(IB)顯示了P-f3-連環(huán)蛋白的水平下降。在對(duì)照的和shLIMP-2的IP裂解液中，4丐粘蛋白負(fù)荷相當(dāng)。在總shLIMP-2和對(duì)照蛋白裂解液中的(3-連環(huán)蛋白的磷酸化是相當(dāng)?shù)摹?，ZM)細(xì)6。圖8C:免疫印跡示出了用抗全鈣粘蛋白進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)的特異性。當(dāng)向蛋白裂解液中添加IgG來(lái)代替全鈣粘蛋白抗體時(shí)，沒(méi)有P-p-連環(huán)蛋白結(jié)合。圖9:圖9A:通過(guò)對(duì)來(lái)自10周周齡的Ren-2大鼠的左心室活檢物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR來(lái)評(píng)價(jià)KLF-15表達(dá)?；顧z之后，使大鼠恢復(fù)并且接著確定它們是否將發(fā)生衰竭或者保持代償。在保持代償?shù)姆蚀笮呐K中，KLF-15的表達(dá)明顯被下調(diào)，而在快速發(fā)展為明顯衰竭的肥大心臟中，KLF-15的表達(dá)明顯地被進(jìn)一步抑制，這表明KLF-15抑制的水平鑒別了衰竭傾向形式的心臟肥大。圖9B:與肥大的心肌相比，正常血壓的對(duì)照心臟中KLF-15的原位雜交。在大量的肌細(xì)胞中，缺失了正常心臟中廣泛分布的核染色，而在非肌細(xì)胞核中存在剩余的染色，這表明KLF-15表達(dá)特異性地出現(xiàn)在心臟肌細(xì)胞中。圖9C:通過(guò)短發(fā)夾RNA的慢病毒引入來(lái)穩(wěn)定地抑制KLF-15,誘導(dǎo)BNP在培養(yǎng)的NRVM中的表達(dá)。圖10:圖10A:向培養(yǎng)的心臟肌細(xì)胞中添加TGF(3(10ng/ml)幾乎完全抑制KLF-15mRNA表達(dá)。短發(fā)夾RNA的慢病毒引入穩(wěn)定地抑制TGF(3I型受體，從而消除了這種效果，這表明TGF卩經(jīng)過(guò)它的TGF卩I型受體能夠抑制KLF-15表達(dá)。圖10B:針對(duì)TGF(3I型受體而被免疫印跡的全心臟勻漿示出了TGF(3I型受體的表達(dá)的本質(zhì)上的并且顯著的下降，但是沒(méi)有完全缺失受體。圖10C:免疫組織化學(xué)法表明，當(dāng)將WT心臟與MerCreMer-TGF卩I型小鼠心臟進(jìn)行比較時(shí)，肌細(xì)胞的cre特異性激活導(dǎo)致從心臟肌細(xì)胞中明顯的并且強(qiáng)烈的缺失TGF(3I型受體。圖10D:血管緊張素II注射導(dǎo)致在WT小鼠中的明顯的肥大響應(yīng)，這種現(xiàn)象在MerCreMer-TGF(3I型小鼠中被消弱。圖10E:血管緊張素II注射導(dǎo)致作為心臟功能缺失的指示標(biāo)的縮短率明顯降低，這種現(xiàn)象在MerCreMer-TGF卩受體小鼠中被消弱。圖10F:血管緊張素II注射和后續(xù)的肥大導(dǎo)致KLF-15被下調(diào)，這種現(xiàn)象在MerCreMer-TGF(3受體小鼠被消弱。圖11:上圖示出了與綠色熒光蛋白(AAV9-GFP)注射相比，AAV9-KLF-15注射后，在小鼠心臟中KLF-15mRNA明顯上調(diào)。**:與GFP組相比尸<0.05。*:與GFP組相比尸<0.05。#:與GFP+AngII組相比尸<0.05。下圖示出了與具有AngII的AAV9-GFP組相比AngII刺激后在AAV9-KLF-15組中明顯減少的肥大。用學(xué)生t-檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，11=3-5只動(dòng)物/組。具體實(shí)施例方式示例示例1溶酶體整合膜蛋白-2是閏盤的新組分并且預(yù)防心肌病才才泮牛和方法Ren-2大鼠、微陣列分析和免疫印跡如早先所述(VanHaaften等，2006),從十周大的Ren-2、Sprague-Dawley(SD)大鼠(M。llegard，LilleSkensveld,Denmark)中取出LV的活檢物。在10周、12周、15周、16周、18周、19周和21周周齡，對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)的超聲波心動(dòng)描記術(shù)，當(dāng)大鼠出現(xiàn)心力衰竭的臨床體征(心力衰竭傾向/HF傾向的大鼠)時(shí)，大鼠在15周至18周被處死；或者當(dāng)沒(méi)有出現(xiàn)衰竭的臨床體征(代償?shù)?comp大鼠)時(shí)，大鼠在21周被處死。如早先所述(Schroen等，2004;Heymans等，2005),從LV活檢物分離總RNA并且使總RNA擴(kuò)增，并且總RNA^皮雜交到Affymetrix大鼠2302.0基因芯片，用MicroarrayAnalysisSuiteSoftware5.0進(jìn)行分析。用多克隆兔抗LIMP-2(NovusBiologicals,Littleton,CO,1:500)和多克隆兔抗GAPDH(Abcam，Leusden，Netherlands;1:10,000)對(duì)LV蛋白提取物(50嗎)進(jìn)行免疫印跡。剔除了LIMP-2的小鼠，RNA分離和定量PCR分析采用十周至十二周大的雄性LIMP-2KO、重量為20克至25克的WTC57/B16小鼠。為了研究AngII的血壓效應(yīng)，在每分鐘以0.5ng、1.5ng、5ng、15ng和50ng的劑量進(jìn)行靜脈注射期間監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓。為了研究LV肥大的發(fā)展，通過(guò)滲透性孩i泵2004(Alzetosmoticpumps，Cupertino,CA)皮下注射AngII(1,5嗎/g/天),持續(xù)28天。在0天、14天和28天進(jìn)行超聲波心動(dòng)描記術(shù)。去除LV之后，在基礎(chǔ)的和多巴酚丁胺(dobutamin)刺激的條件下，利用Millar⑧對(duì)28天的小鼠進(jìn)行血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)(dP/dt)。利用RNeasy小型試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)分離RNA,并且在BioRadiCycler上進(jìn)行SYBRGreen定量PCR分析，從而確定BNP、ANF和a-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(aska)的表達(dá)(表1)。如早先所述(J皿queira等，1979)，用蘇木素伊紅(HE)和苦味酸天狼猩紅(SR)給LV切片染色，或者用單克隆小鼠抗全鈣粘蛋白(anti陽(yáng)pan-cadhenn)(Sigma,SaintLouis,美國(guó)；1:500)和單克隆小鼠抗人結(jié)蛋白(anti-hum肌desmin)(DakoCytomation，丹麥，1:50)對(duì)LV片^殳進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。如早先所述(Schroen等，2004),通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析。主動(dòng)脈狹窄和心力衰竭病人中的LIMP-2如早先所述(Heymans等，2005),將RNA與從20位主動(dòng)脈狹窄病人和7位非肥大的對(duì)照病人得到的透壁活檢物分離，并且執(zhí)行SYBRGreen定量PCR分析，從而確定LIMP-2的表達(dá)(表1)。對(duì)1位對(duì)照對(duì)象和2位死于明顯心力衰竭的病人(定義為射血分?jǐn)?shù)小于35%)的切片進(jìn)行用兔抗LIMP-2(1:250,Cy2)和小鼠抗全鈣粘蛋白(1:500，Cy3)的雙免疫萸光染色。用Topro-3(Invitrogen,Breda,荷蘭)對(duì)核配對(duì)物(nuclearcounterpart)進(jìn)4亍染色。采用激光掃描共聚焦系統(tǒng)(Leica,Rijswijk,荷蘭)對(duì)切片照相，按照126倍的最終放大倍率進(jìn)行數(shù)字化，并且用LeicaConfocalSoftware進(jìn)行分析。馬斯特里赫特學(xué)術(shù)醫(yī)院的4侖理委員會(huì)和盧維思大學(xué)醫(yī)院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了該項(xiàng)研究，并且所有的病人知情同意。細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒載體通過(guò)將互補(bǔ)的shLIMP-2寡核苷酸(表1)退火，并且通過(guò)Hpal、Xhol內(nèi)切連入到pLL3.7嘌呤霉素載體DNA(從美國(guó)劍橋的麻省理工學(xué)院的LukvanParijs友情提供的改良得到)，產(chǎn)生表達(dá)慢病毒載體rat-LIMP-2shRNA。利用Lipofectamine2000(Invitrogen),通過(guò)將3pgshLIMP-2/pLL3.7。票呤霉素和包裝載體或者將3)ig空的pLL3.7。票呤霉素和包裝載體共轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞，從而獲得了慢病毒產(chǎn)物，48小時(shí)后收集包含病毒的上清液。如早先所述(DeWindt等，1997),通過(guò)對(duì)一天到兩天大的幼鼠進(jìn)行酶分裂，大鼠心室心肌細(xì)胞(RCM)被分離。為了慢病毒侵染，以每孔5xl()S個(gè)細(xì)胞，將RCM放置到6孔膠質(zhì)板上，并在加有10%的馬血清、5%的新生牛血清、葡萄糖、慶大霉素和AraC的DMEM/M199(4:1)培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，第二天通過(guò)聚凝胺(Sigma)促進(jìn)shLIMP-2或空的慢病毒侵染RCM。經(jīng)過(guò)噤呤霉素(3嗎Zml)篩選后，侵染率在80%以上。培養(yǎng)10天后，細(xì)胞蛋白通過(guò)抗LIMP-2(1:100)、單克隆小鼠抗全鈣粘蛋白(Sigma,1:100)或IgG的免疫沉淀(IP)來(lái)分離。利用單克隆抗全鈣粘蛋白(1:5000)、多克隆抗磷p-連環(huán)蛋白(Ser33/37/Thr41;CellSignalingTechnology,Danvers,MA,美國(guó)，1:1000)和單克隆抗卩-連環(huán)蛋白(BDTransductionLaboratories,FranklinLakes,美國(guó)，1:1000)對(duì)IP裂解液進(jìn)4亍免疫印跡。對(duì)于拉伸試驗(yàn)，將RCM在包覆有I型膠原的硅橡膠膜(SpecialtyManufacturing,Inc,美國(guó))上培養(yǎng)，并且經(jīng)歷4爭(zhēng)止，等雙軸4立伸(equibiaxialstretch)6小時(shí)。為了進(jìn)行LIMP-2SYBRGreen定量RT-PCR(表1)，利用RNeasy小型試劑盒(Qiagen)分離RNA。涉及到動(dòng)物試驗(yàn)的所有研究方案都經(jīng)過(guò)馬斯特里赫特大學(xué)動(dòng)物關(guān)愛(ài)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并且根據(jù)基于對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的關(guān)愛(ài)和使用在荷蘭法律中制定的官方規(guī)則(與NIH的規(guī)則非常類似)進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以平均士SEM呈現(xiàn)。每個(gè)研究組的數(shù)據(jù)都利用MannWhitney或者學(xué)生t-檢驗(yàn)比較，均為合理的。PO.05被認(rèn)為是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性。結(jié)果在表2中，呈現(xiàn)了與代償?shù)腞en-2大鼠相比有衰竭傾向的大鼠中表達(dá)有差異的基因的列表。因?yàn)檫@些基因來(lái)自于當(dāng)所有的大鼠仍然存在代償性肥大時(shí)在IO周周齡提取的心臟活檢物，所以這些基因的差異表達(dá)發(fā)生在Ren-2大鼠心力衰竭之前。在表3中，呈現(xiàn)了在基礎(chǔ)狀態(tài)和AngII處理14天和28天后LIMP-2WT、KO小鼠的詳細(xì)的超聲波心動(dòng)描記術(shù)的數(shù)據(jù)。有衰竭傾向的LV肥大的基因表達(dá)譜在代償?shù)腖V肥大階段中在10周周齡獲得10只純合Ren-2大鼠中的心臟活檢物。在取出活^企物之后五周內(nèi)，四只大鼠快速發(fā)展為心力衰竭，而剩余的六只大鼠在活檢之后的11周保持代償(圖1A)。在對(duì)這些活檢物(GEO號(hào)GSE4286)進(jìn)行線性的基于T7的擴(kuò)增和后續(xù)的Affymetrix2302.0基因表達(dá)分析之后，僅在發(fā)展為心力衰竭的肥大心臟中檢測(cè)到上調(diào)或下調(diào)的143個(gè)有差異的表達(dá)基因(表2)。LIMP-2，即溶酶體整合膜蛋白是有心力衰竭傾向的大鼠中的上調(diào)的mRNA之一(圖1B),并且特別有趣的是，LIMP-2是能夠與血小板反應(yīng)素(TSP)1(Crombie等，1998)和2(未示出數(shù)據(jù))相互作用的mRNA之一，早先已經(jīng)示出了血小板反應(yīng)素2是從肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。圖1C示出了LIMP-2蛋白在Ren-2大鼠的晚期心力衰竭中也起作用。血管緊張素II導(dǎo)致剔除了UMP-2的小鼠的擴(kuò)張性心肌病由于溶酶體蛋白中的功能缺失突變導(dǎo)致了心力衰竭(Eskelmen等，2003;Nishmo等，2000;Stypmann等，2002)，所以進(jìn)一步研究了LIMP-2在血管緊張素II(AngII)導(dǎo)致的高血壓的小鼠模型中的作用。對(duì)LIMP-2剔除的小鼠和對(duì)照小鼠進(jìn)行4周的AngII皮下注射。AngII處理結(jié)果為在野生型小鼠中，LV質(zhì)量指數(shù)增加30。/。，但是在AngII處理的剔除了LIMP-2的小鼠中肥大響應(yīng)被減小(LV質(zhì)量指數(shù)增加14%;PO.01)(圖2A)。這通過(guò)測(cè)量單個(gè)心臟肌細(xì)胞面積來(lái)確定。AngII處理的剔除小鼠的LV肌細(xì)胞面積明顯小于AngII處理的WT對(duì)照物的LV肌細(xì)胞面積(任意單位的肌細(xì)胞面積AngII處理的剔除小鼠的為264±42,而AngII處理的野生型小鼠的為308士14;PO.Ol)。另外，當(dāng)AngII導(dǎo)致在剔除了UMP-2的小鼠和野生型小鼠(未示出數(shù)據(jù))中血管周纖維化明顯增加時(shí)，與野生型對(duì)照的同窩小鼠相反，AngII導(dǎo)致剔除了LIMP-2的小鼠的LV的大塊間質(zhì)纖維化響應(yīng)(間質(zhì)纖維化AngII處理的剔除小鼠的為15.0±6.0%,而AngII處理的對(duì)照小鼠的為1.8±0.1%;PO.002)(圖3)。對(duì)結(jié)蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色示出了AngII處理的LIMP-2缺失小鼠的肌細(xì)胞混亂(圖4)。確定的是，在野生型小鼠和剔除小鼠中AngII引起類似的血壓響應(yīng)(圖2B)。盡管LV肥大有所下降，但是對(duì)于肥大LV的腦利鈉肽(BNP)和心房利鈉因子(ANF),LIMP-2缺失小鼠示出了典型標(biāo)記的正常響應(yīng)(圖2C),這表明在AngII處理時(shí)正常啟動(dòng)了肥大基因表達(dá)程序。相反，與AngII處理的野生型相比，AngII處理的剔除了LIMP-2的小鼠中結(jié)構(gòu)細(xì)胞肥大標(biāo)記a-骨骼肌肌動(dòng)蛋白明顯較少(圖2C),這反映出心臟肌細(xì)胞的肥大響應(yīng)降低(Stilli等，2006)。連續(xù)的超聲波心動(dòng)描記術(shù)顯示出AngII在AngII處理的LIMP-2缺失小鼠中引起明顯的心臟擴(kuò)張，而AngII處理的野生型小鼠示出了向心型LV肥大，而沒(méi)有擴(kuò)張(圖2D和表3)。另外，如通過(guò)響應(yīng)于多巴酚丁胺注射(AnglI處理的剔除小鼠的+dP/dt為79.8/秒士5.1,而Angll處理的對(duì)照物的+dP/dt為100.0/秒土4.0;尸<0.005)引起的收縮減小所示出的，AngII導(dǎo)致LIMP-2缺失小鼠的收縮儲(chǔ)備的損失(圖2E)?？偠灾?，在LIMP-2缺失小鼠中，高血壓沒(méi)有導(dǎo)致正常的肥大響應(yīng)，而是導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病以及反應(yīng)間質(zhì)纖維化和心臟功能損失。根據(jù)心臟負(fù)荷來(lái)調(diào)節(jié)LIMP-2表達(dá)AngII處理的LIMP-2缺失小鼠沒(méi)有作出肥大響應(yīng)而是正常地引起B(yǎng)NP和ANF的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)表明LIMP-2是對(duì)機(jī)械負(fù)荷進(jìn)行正常響應(yīng)的關(guān)鍵部分。實(shí)際上也示出了LIMP-2表達(dá)在將心臟肌細(xì)胞在體外拉伸之后明顯增加(P=0.02)，并且運(yùn)動(dòng)引起的生理肥大也有所增力口(PK).04)(圖5A和圖5B)。為了確定在適應(yīng)了心臟壓力負(fù)荷的人中也包括LIMP-2，通過(guò)對(duì)20位明顯心臟肥大的主動(dòng)脈狹窄病人和7位對(duì)照病人的心臟活檢物進(jìn)行定量RT-PCR來(lái)分析LIMP-2的表達(dá)。該試驗(yàn)示出了通過(guò)Mann-Whitney檢驗(yàn)，與對(duì)照物相比，在主動(dòng)脈狹窄病人的肥大心臟中LIMP-2上調(diào)明顯(1.23倍；P=2.3e-4)(圖5C)。LIMP-2存在于心臟閏盤中接下來(lái)，通過(guò)免疫組織化學(xué)來(lái)分析LIMP-2在壓力超負(fù)荷的鼠科動(dòng)物心肌中的表達(dá)模式。如所預(yù)料的，在心臟肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)液泡形隔室中表達(dá)了蛋白，但是還發(fā)現(xiàn)蛋白非典型地分布在心臟肌細(xì)胞的質(zhì)膜上(圖6A)。免疫電鏡證實(shí)了這種發(fā)現(xiàn)(圖6B)。需要注意的是，AngII處理的剔除了LIMP-2的小鼠和對(duì)照小鼠的左心室切片的電鏡顯示LIMP-2缺失小鼠中的ID的異常形態(tài)，這表明在ID正常的生物中可能包含LIMP-2。在細(xì)胞間的接觸位置，AngII處理的KO-ID的膜顯示出了更高程度的巻曲和更高濃度的粘著連接蛋白(圖6C)，這表明了擾亂的ID構(gòu)造(Pernard等，2003)。由于ID中的變化已經(jīng)顯示引起了擴(kuò)張性心肌病(Periard等，2003),所以猜測(cè)LIMP-2對(duì)于ID的正常功能可以是關(guān)鍵的。新生大鼠的心臟肌細(xì)胞蛋白的免疫沉淀反應(yīng)顯示LIMP-2與粘著連接的關(guān)鍵成分N-鈣粘蛋白(N-cadhenn)存在物理上的相互作用(圖7A)。這種發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)換為人的情況，如對(duì)照的和人類心肌衰竭的共聚焦顯微鏡所示，證明在鈣粘蛋白和LIMP-2之間存在相互作用，并且示出這種相互作用發(fā)生在ID的鈣粘蛋白和LIMP-2共位的位置(圖7B)。這表明通過(guò)調(diào)節(jié)4丐粘蛋白的作用，LIMP-2對(duì)于正常的ID功能可能是非常重要的。事實(shí)上，對(duì)UMP-2缺失小鼠的心臟中的鈣粘蛋白進(jìn)行組織化學(xué)分析顯示異常的4丐粘蛋白分布(圖7C)，但是在AnglI處理的野生型小鼠中顯示正常分布。AnglI處理的野生型小鼠顯示在兩個(gè)縱向的心臟肌細(xì)胞之間的接觸位的4丐粘蛋白表達(dá)，而這種表達(dá)在AngII處理的剔除了LIMP-2的小鼠中更加的無(wú)組織并且更加分散。這些數(shù)據(jù)確定LIMP-2對(duì)于閏盤的正常結(jié)構(gòu)組織是關(guān)鍵的。LIMP-2調(diào)節(jié)閏盤完整性為了確定哪種調(diào)整機(jī)制依賴于LIMP-2,采用針對(duì)LIMP-2的慢病毒引入的短發(fā)夾RNA(shLIMP-2)，來(lái)獲得新生大鼠心臟肌細(xì)胞中的LIMP-2失活的單獨(dú)才莫型。培養(yǎng)10天之后，與對(duì)照處理的心臟肌細(xì)胞相比，shLIMP-2處理的心臟肌細(xì)胞中的LIMP-2蛋白表達(dá)被縮減了92%(圖8A)。已經(jīng)報(bào)道了閏盤的功能完整性取決于P(Ser37)-(3-連環(huán)蛋白(P(Ser37)-(3-catenin)和鈣粘蛋白之間的適當(dāng)?shù)南嗷プ饔谩Ｒ虼?，已?jīng)研究了LIMP-2的缺失是否影響P-(3-連環(huán)蛋白與鈣粘蛋白的結(jié)合。鈣粘蛋白在心臟肌細(xì)胞裂解液中的免疫沉淀反應(yīng)顯示，LIMP-2抑制實(shí)際上降低了P-(3-連環(huán)蛋白和鈣粘蛋白之間的相互作用(圖8B)。免疫沉淀反應(yīng)對(duì)于鈣粘蛋白是特異性的(圖8C)。該項(xiàng)研究表明溶酶體蛋白LIMP-2是心臟肌細(xì)胞閏盤(具體的是粘著連接)的重要的且新的組分。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)示出了LIMP-2結(jié)合到N-甸粘蛋白，并且示出了LIMP-2缺失小鼠在AngII導(dǎo)致高血壓時(shí)發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病，伴隨心臟中的N-4丐粘蛋白的局部混亂。確定的是，體外的這種結(jié)合示出在培養(yǎng)的肌細(xì)胞中LIMP-2的抑制擾亂了N-4丐粘蛋白和(3-連環(huán)蛋白之間的相互作用。這表明LIMP-2作為最初了解的溶酶體蛋白是閏盤的重要部分。LIMP-2在壓力超負(fù)荷期間對(duì)心臟的作用LIMP-2在ID蛋白中是引人注目的。完全缺失ID的其它主要組分(《丐粘蛋白、(3-連環(huán)蛋白、盤狀球蛋白)導(dǎo)致致命的進(jìn)展型心臟紊亂，表明ID的這些組分對(duì)于正常的心臟發(fā)育是必需的。相反，根據(jù)本發(fā)明，如果不是LIMP-2缺失僅影響后天的心臟重構(gòu)，則發(fā)現(xiàn)LIMP-2缺失小鼠具有正常的心臟發(fā)育。這表明LIMP-2代表不同類型的ID蛋白，該ID蛋白的作用主要在負(fù)荷增加的情況下是必要的。LIMP-2的這種特殊作用由于發(fā)現(xiàn)LIMP-2的表達(dá)還在處于向衰竭發(fā)展邊緣的肥大大鼠心臟中增加而得到重視，該事實(shí)表明LIMP-2表達(dá)尤其在看起來(lái)不能正常響應(yīng)負(fù)荷條件的心臟肌細(xì)胞中增加?？傊砻鱈IMP-2是ID功能的一種新型介體，并且代表一種迄今為止未經(jīng)確認(rèn)類型的介體，該介體對(duì)于ID和肌細(xì)胞響應(yīng)增加的負(fù)荷條件來(lái)說(shuō)是必要的。LIMP-2缺失小鼠對(duì)增加的負(fù)荷產(chǎn)生異常響應(yīng)與保持代償?shù)姆蚀笮呐K相比，LIMP-2尤其在以后將發(fā)展為衰竭的那些肥大的心臟中增加。這表明心臟的LIMP-2表達(dá)可能是超負(fù)荷的早期分子標(biāo)志。LIMP-2組成針對(duì)超負(fù)荷的防御機(jī)制是根據(jù)下面的發(fā)現(xiàn)而提出的在LIMP-2缺失小鼠經(jīng)歷由于慢性血管緊張素II侵染導(dǎo)致的壓力負(fù)荷時(shí)，LIMP-2缺失小鼠發(fā)展為心臟擴(kuò)張和纖維化，而心臟肌細(xì)胞肥大非常少。正常地誘導(dǎo)利鈉肽，這表明如a-骨骼肌肌動(dòng)蛋白的消弱表達(dá)所證明的，LIMP-2缺失小鼠的心臟肌細(xì)胞確實(shí)感受到增加的負(fù)荷條件，但是不能進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蚀箜憫?yīng)。這表明LIMP-2對(duì)心臟負(fù)荷進(jìn)行正常響應(yīng)是所必需的，并且LIMP-2表達(dá)在負(fù)荷條件超過(guò)代償機(jī)制時(shí)顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)換到人的情況，顯示LIMP-2在臨床上具有嚴(yán)重壓力負(fù)荷的病人中也顯著增加?？傊?，LIMP-2是ID的一種新組分，并且看起來(lái)代表一種新類型的ID蛋白，對(duì)正常的心臟功能之外的負(fù)荷產(chǎn)生響應(yīng)是所必需的。LIMP-2對(duì)負(fù)荷的響應(yīng)機(jī)制在壓力負(fù)荷的LIMP-2缺失小鼠中證實(shí)了閏盤異常，其表征為心臟閏盤紊亂，這正常地作用于臨近肌細(xì)胞的組織。之前已經(jīng)示出了在從代償?shù)腖V肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)變的過(guò)程中的閏盤重構(gòu)，而閏盤的結(jié)構(gòu)擾亂已經(jīng)聯(lián)系，J人類、倉(cāng)鼠和豬的擴(kuò)張性心肌病。已經(jīng)示出了LIMP-2與N-4丐粘蛋白結(jié)合，表明經(jīng)過(guò)這種ID組分對(duì)LIMP-2起作用。實(shí)際上，壓力超負(fù)荷的LIMP-2KO小鼠在電子顯微鏡下示出了異常的閏盤，并且它們的N-4丐粘蛋白分布混亂，表明粘著連接中存在缺陷。粘著連接的強(qiáng)度由N-4丐粘蛋白和p-連環(huán)蛋白之間的結(jié)合親和力確定(Gumbmer等，2000)，結(jié)合親和力通過(guò)(3-連環(huán)蛋白的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)。在體外示出，通過(guò)抑制培養(yǎng)的肌細(xì)胞中的LIMP-2，LIMP-2缺失擾亂了這種N-鈣粘蛋白/(3-連環(huán)蛋白復(fù)合體。假設(shè)粘著連接與肌原纖維有關(guān)，則LIMP-2缺失預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致跨質(zhì)膜的力量轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率下降(Ferreira等，2002)已經(jīng)表明LIMP-2是N-鈣粘蛋白與p-連環(huán)蛋白正常結(jié)合所必需的，并且這種作用在負(fù)荷條件下尤為重要。然而，仍需說(shuō)明LIMP-2確保將N-鈣粘蛋白結(jié)合到(3-連環(huán)蛋白的確切方式。LIMP-2包含兩個(gè)跨膜區(qū)、一個(gè)細(xì)胞質(zhì)環(huán)和兩個(gè)魯米那糖基化區(qū)。已知的是溶酶體膜蛋白可以在溶酶體和質(zhì)膜之間穿梭，其中，LIMP-2可以結(jié)合到TSP1和TSP2(數(shù)據(jù)未示出)。TSP2如在早期所證實(shí)的是令人感興趣的，即，TSP2對(duì)于心臟壓力負(fù)荷的響應(yīng)也是所必需的，并且增加LV肥大的形式的衰竭傾向(Schroen等，2004)。這表明LIMP-2和TSP2均可以是心臟肌細(xì)胞所需的復(fù)合體的一部分，以對(duì)負(fù)荷進(jìn)行適應(yīng)性的響應(yīng)。推論根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)揭示了當(dāng)心肌面對(duì)負(fù)荷增加的條件時(shí)LIMP-2作為ID的重要介體的新作用。除了這種新穎的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)之外，還發(fā)現(xiàn)了LIMP-2表達(dá)在處于向衰竭發(fā)展邊緣的肥大大鼠心臟中增加，從而推測(cè)心臟肌細(xì)胞的LIMP-2表達(dá)增加證實(shí)了它們不能正常響應(yīng)負(fù)荷條件。這樣，LIMP-2增加表達(dá)可以表示衰竭即將到來(lái)。由于已經(jīng)示出了LIMP-2表達(dá)在臨床上具有嚴(yán)重壓力負(fù)荷的病人中也明顯增加，并且位于質(zhì)膜中，所以LIMP-2可能是分子影像學(xué)的引人注目的目標(biāo)，從而在非常早的階段鑒別將要屈服于壓力的心肌。示例2TGF(3通過(guò)抑制KrUp。d樣因子15來(lái)促進(jìn)心臟肥大，Kriippel樣因子15是心臟肥大的一種新型抑制劑材料和方法轉(zhuǎn)基因的大鼠，左心室活檢物和血液動(dòng)力學(xué)研究研究了十八只雄性的純合Ren-2大鼠和5只年齡匹配的Sprague-Dawley(SD)(M6llegardBreedingCenter,LilleSkensveld,丹麥)。有心力衰竭的臨床體征的三只Ren-2大鼠在10周到12周周齡被處死，從研究中將這三只大鼠排除。如前所述，在10周周齡，從剩余的健康的15只Ren-2大鼠和5只SD對(duì)照大鼠中提取左心室的活檢物。如上所述，在10周、12周、15周、16周、18周、19周和21周周齡，對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)的超聲波心動(dòng)描記術(shù)。存在心力衰竭的臨床體征的九只Ren-2大鼠在15周至18周周齡被處死，并且被指定為"有心力衰竭傾向"的大鼠。監(jiān)視剩余的6只Ren-2大鼠，當(dāng)沒(méi)有出現(xiàn)衰竭的臨床體征時(shí)，這些大鼠在21周被處死，并且被指定為"代償?shù)?大鼠。微陣列分析如前所述，從10周周齡的4只SD對(duì)照大鼠、6只保持代償?shù)拇笫蠛?只有心力衰竭傾向的大鼠中提取LV活檢物，從LV活檢物分離總RNA并且擴(kuò)增。接著，擴(kuò)增后的cRNA與Affymetrix大鼠2302.0基因芯片雜交。利用MicroarrayAnalysisSuiteSoftwareversion5.0(MAS5.0)來(lái)確定SD對(duì)照大鼠、代償?shù)拇笫蠛虷F大鼠的基因轉(zhuǎn)錄水平。慢病毒shKLF-15產(chǎn)物將互補(bǔ)的shKLF-15寡核苷酸(正義5'-GATGTACACCAAGAGCAGC-3'和反義5'-GCTGCTCTTGGTGTACAT-3')退火，并且利用E.ColiDH5a感受態(tài)細(xì)胞將它們克隆到內(nèi)切的pLL3.7嘌呤霉素載體DNA(由美國(guó)劍橋的麻省理工學(xué)院生物系的LukvanParijs友情提供)，來(lái)獲得慢病毒載體。利用QiagenPlasmidMidikit將所得物純化。在加有10%的FCS、2mM的L-Glut、10mM的非必需氨基酸、ImM的丙酮酸鈉和青鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)293FT細(xì)胞。利用Lipofectamine2000(InvitrogenLifeTechnology,Breda,荷蘭)，卄夸3|dgshKLF-15和包裝載體，或者將3嗎shTgfbrl/pLL3.7。票呤霉素和包裝載體，或者將3路空的pLL3.7嘌呤霉素和包裝載體共轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞，來(lái)獲得慢病毒產(chǎn)物，48小時(shí)后收集包含病毒的上清液，過(guò)濾，快速冷凍。新生大鼠心室肌細(xì)胞試驗(yàn)如早先所述(Schroen等，2004),通過(guò)對(duì)1天到3天大的新生大鼠心臟進(jìn)行酶分裂，將新生大鼠的心室肌細(xì)胞(NRVM)分離。以每孔5xl()S個(gè)細(xì)胞，在6孔膠質(zhì)板上，在加有10。/。的馬血清(HS)、5。/。的新生牛血清(NBCS)、葡萄糖、慶大霉素和2%的抗生素/抗真菌藥的DMEM/M199(4:1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)NRVM。為了shKLF-15侵染，將NRVM過(guò)夜培養(yǎng)，第二天通過(guò)聚凝胺(Sigma)促進(jìn)shK丄F-15和空的慢病毒對(duì)照載體侵染NRVM。48小時(shí)后，清洗細(xì)胞，去除載體，并且將細(xì)胞放置在嘌呤霉素篩選的條件下再過(guò)48小時(shí)。接著，細(xì)胞在DMEM/M199(4:1)、葡萄糖、慶大霉素和10%的抗生素/抗真菌藥中在靜態(tài)條件下過(guò)夜。第二天，用包含DMEM/M199、葡萄糖、慶大霉素、5%的抗生素/抗真菌藥、胰島素、L-肉堿和BSA的培養(yǎng)基來(lái)替換原來(lái)的培養(yǎng)基。l小時(shí)之后，添加TGF-b(10ng/ml培養(yǎng)基)1小時(shí)，此后，利用RNeasyminiprotocol(Qiagen)分離RNA,采用KLF-15或BNP引物(F5'-GCTGCTTTGGGCAGAAGATAGA-3'R5'-GCCAGGAGGTCTTCCTAAAACA-3')進(jìn)行SYBRGreen定量PCR。與用空的慢病毒載體侵染的NRVM的水平相比，shKLF-15的抑制效果是大約80%。MEF2熒光素酶啟動(dòng)子檢測(cè)如上所述，分離NRVM。以每孔5xl()S個(gè)細(xì)胞，在6孔膠質(zhì)板上，在加有10%的馬血清(HS)、5%的新生牛血清(NBCS)、葡萄糖、慶大霉素和2%的抗生素/抗真菌藥的DMEM/M199(4:1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。為了shKLF-15侵染，將NRVM過(guò)夜培養(yǎng)，第二天通過(guò)聚凝胺(Sigma)促進(jìn)shKLF-15和空的慢病毒對(duì)照載體侵染NRYM。48小時(shí)之后，清洗細(xì)胞，去除載體，并且將細(xì)胞放置在噤呤霉素篩選的條件下再過(guò)48小時(shí)。包含三個(gè)Mef2結(jié)合位的Mef2報(bào)告質(zhì)粒(pGL2-3xMEF2-熒光素酶)經(jīng)過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染克隆到細(xì)胞中的Tata-box和熒光素酶的上游。清洗細(xì)胞，每個(gè)孔中添加1.6昭的MEF2結(jié)構(gòu)以及Opti-MEMI培養(yǎng)基(Invitrogen)和lipofectamine2000與沒(méi)有抗生素的培養(yǎng)基。第二天早晨清洗細(xì)胞，并且將細(xì)胞放置在正常的培養(yǎng)基中再過(guò)兩天。在低血清條件下保持細(xì)胞過(guò)夜(見(jiàn)上)，第二天早晨添加AngII(x克/ml)4小時(shí)。利用LuciferaseAssayProtocol(Promega)進(jìn)4亍焚光素酶斗全觀'J。雙轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生在a-MHC啟動(dòng)子(MerCreMer""wt,Larsson等)的控制下，將通過(guò)TGF卩RI的外顯子3與lox-P位(Sohal等，2001)側(cè)連接產(chǎn)生的rGi^兄嚴(yán)小鼠(C57B1/6背景)與包含cre-重組酶的小鼠(C57B1/6FVB背景)異種交配，產(chǎn)生包含r(7i^/^'—e基因的雜合雙轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠隨后與7T7F/^,小鼠回交，得到C57B1/6FVB和C57BL/6混合背景中的具有rGF/^產(chǎn)'"和:TG"朋嚴(yán)，的種群。DNA分離和基因分型才艮據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，利用基因組DNA純化試劑盒(Promega)從小鼠尾部分離DNA。如早先所述(Sohal等，2001),我們利用三個(gè)引物5-ATGAGTTATTAGAAGTTGTTT、3'-ACCCTCTCACTCTTCCTGAGT和3'-GGAACTGGGAAAGGAGATAAC采用PCR來(lái)測(cè)定T(3RIflox小鼠的基因型。為了檢測(cè)MerCreMer轉(zhuǎn)基因，我們用引物5-CCTGGAAAATGCTTCTGTCCG和5-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC，從c廠e擴(kuò)增400-bp片段。Cre重組方案為了資導(dǎo)心臟肌細(xì)胞中的結(jié)合有ot-MHC的tre重組酶，通過(guò)皮下插入滲透性微泵(ALZET，型號(hào)2001)用三苯氧胺(Sigma)以每天20mg/kg的劑量處理成年的rG印i/^和rG"/嚴(yán)嫌雙轉(zhuǎn)基因小鼠，持續(xù)7天。用三苯氧胺處理一組野生型小鼠，來(lái)檢查三笨氧胺本身是否對(duì)心臟的形態(tài)和功能產(chǎn)生影響。將三苯氧胺溶解在10%的乙醇和90%的聚乙二醇-400中，接著進(jìn)行簡(jiǎn)短的超聲處理。在用AngII或載體處理之前，使小鼠恢復(fù)兩周。滲透性微泵的皮下植入和AngII注射用2.5%的異熒烷將重量為24g-32g的任何性別的小鼠麻醉。在無(wú)菌條件下，進(jìn)行肩月甲中切割(midscapularincision),通過(guò)鈍性解剖在皮下組織中產(chǎn)生袋狀物，并且插入填充有鹽水或AngII(0.5mg/kg/天)的滲透性微泵(ALZET型號(hào)2004，ALZACorp.,PaloAlto,加利福尼亞，美國(guó))。滲透性樣i泵中的成分以0.25^1/小時(shí)的速率被遞送到局部皮下空隙中，持續(xù)4周。在每組中，新添加7只至9只小鼠用于試驗(yàn)，每組中的至少5只小鼠完成了試驗(yàn)。除了LV導(dǎo)管插入術(shù)不成功的3只動(dòng)物外，所有的中途退出的小鼠均是由于麻醉而死亡。超聲波心動(dòng)描記術(shù)在2.5%的異熒烷麻醉的條件下，在外科手術(shù)之前以及在野生型、7T/^R/-/-和rOF/^/-/++鼠中注入4周的AngII之后進(jìn)行經(jīng)胸超聲波心動(dòng)描記術(shù)。在2D超聲波心動(dòng)描記術(shù)中得到標(biāo)準(zhǔn)觀點(diǎn)，測(cè)量心室舒張末期和心室收縮末期的內(nèi)徑，計(jì)算射血分?jǐn)?shù)和縮短率。血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量采用腹膜內(nèi)注射氨基曱酸乙酯將小鼠麻醉。將Millar(1.4F)導(dǎo)管(由美國(guó)推進(jìn)到左心室中，來(lái)測(cè)量左心室內(nèi)的壓力。利用熱控制的外科手術(shù)臺(tái)將體溫保持在37。C,并且用直腸4冢針進(jìn)行監(jiān)測(cè)。然后4吏小鼠在血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量之前穩(wěn)定30分鐘。組織獲取和心肌形態(tài)測(cè)量血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量之后，將心臟快速切離，在0.9%的氯化鈉溶液中清洗，去除心房，將心室切成片。為了將RNA和蛋白分離，將樣品在液氮中快速冷凍，并且在-80。C下保藏。為了進(jìn)行組織學(xué)分析，將左心室固定在多聚甲醛(1%)中，并且埋入石蠟中。為了清楚地呈現(xiàn)總膠原，如前所述執(zhí)行天狼猩紅染色。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(CellSignalingTechnology,Leusden,荷蘭)，利用抗P38抗體通過(guò)免疫染色將P38定位。蛋白分離和免疫蛋白印跡根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議(SantaCruzBiotechnology,Leiden，荷蘭)，在放射免疫測(cè)定緩沖液中，將冷凍的心室壓碎并且使之成為均勻的顆粒。利用針對(duì)T卩RI(1:1000)、總的和磷酸(P)-Smad2、總的和P-P38(1:1000，CellSignalingTechnology,Leusden，荷蘭)、P-Smad3(1:5000，E.Leof教授和M.Wilkes博士(MayoClinicCancerResearch,Rochester,Minnesota,美國(guó))々赍貝曾)的4爭(zhēng)異性抗體以及膠原I(1:3000)和III(1:500)抗體(Abeam,Leusden,荷蘭)進(jìn)行免疫蛋白印跡。TGFj51型受體免疫組織化學(xué)去除心臟組織切片上的石蠟并且進(jìn)行再水合，使抗原修復(fù)組織與一抗體(兔抗TGF卩受體1(SantaCruzSC-398))過(guò)夜培養(yǎng)，接著與二抗體(羊抗兔-Biotme(DakoCytomationE0432))過(guò)夜培養(yǎng)，此后它們用Streptavidin-HorseradishPeroxidase(抗生蛋白寺連菌素-辣沖艮過(guò)氧"f匕物酶)(RenaissanceTSATMBiotinSystem,PerkinElmerPrecisely,TyramideSignalAmplificationkit)處理。涉及到動(dòng)物試驗(yàn)的上述所有的研究方案均得到了馬斯特里赫特大學(xué)的動(dòng)物關(guān)愛(ài)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)，并且根據(jù)基于對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的關(guān)愛(ài)和使用在荷蘭法律中制定的官方規(guī)則(與NIH的規(guī)則非常類似)下進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)被示出為平均土SEM。進(jìn)行不成對(duì)的t-檢驗(yàn)，來(lái)比較AnglI/TGFp/shKLF-15的調(diào)節(jié)子與媒介處理過(guò)的動(dòng)物和細(xì)胞之間的差別。P值$0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。結(jié)果早先已經(jīng)示出了高血壓的遠(yuǎn)系繁殖純合TGR(mRen2)27大鼠(Ren-2)可以用來(lái)研究從肥大向心力衰竭的轉(zhuǎn)變(Schroen等，2004)。使用在10周周齡得到的心肌活檢物來(lái)研究改變后的基因表達(dá)是否可以預(yù)測(cè)哪只大鼠以后將發(fā)展為心力衰竭。這些活檢物的表達(dá)鐠顯示編碼Kriippel樣因子15(KLF-15)的基因的抑制表征出將快速發(fā)展為衰竭的肥大心臟。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR確認(rèn)了上述結(jié)果，實(shí)時(shí)PCR示出了在代償?shù)腖VH中，KLF-15被下調(diào)；而在快速發(fā)展為衰竭的肥大心臟中明顯地進(jìn)一步抑制了KLF-15(圖9A)。原位雜交示出了在心臟肌細(xì)胞中KLF-15的表達(dá)被明顯下調(diào)(圖9B)。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了早期的觀察，在該早期的觀察中，KLF-15在心臟中被組成型地表達(dá)，而在肥大的情況下被下調(diào)。在向心力衰竭轉(zhuǎn)變之前的KLF-15的更強(qiáng)烈的抑制導(dǎo)致了這樣一種說(shuō)法，即，KLF-15具有重要的保護(hù)性質(zhì)。為了探究KLF-15的功能作用，穩(wěn)定地引入了相對(duì)于KLF-15的短發(fā)夾RNA(shRNA)。導(dǎo)致BNP(肥大基因程序的分子標(biāo)志)的自發(fā)表達(dá)大于培養(yǎng)的心臟肌細(xì)胞中的KLF-15的shRNA介導(dǎo)抑制的10倍(圖9C)。這表明KLF-15的組成型存在對(duì)于防止肥大基因程序的表達(dá)來(lái)說(shuō)是重要的。在并行的研究中，已經(jīng)示出了KLF-15缺失小鼠發(fā)生肥大，并且在壓力負(fù)荷下心臟功能缺失，被引起重視的是組成型表達(dá)的KLF-15對(duì)于防止LVH的不良形式是必要的。為了探究KLF-15能夠壓制肥大基因程序的機(jī)制，研究了KLF-15在MEF2活化中的作用。MEF2是通過(guò)神經(jīng)4丐蛋白(calcmeurin)和MAPK途徑傳達(dá)肥大信號(hào)的目標(biāo)，并且被認(rèn)為是肥大基因程序的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子之一。采用MEF2報(bào)告子來(lái)確認(rèn)改變了水平的KLF-15是否影響心臟肌細(xì)胞中的MEF2活性。該報(bào)告僅是無(wú)力地響應(yīng)了MEF2的刺激(Creemers，Olson未公布數(shù)據(jù))。實(shí)際上，響應(yīng)于血管緊張素II,在MEF2活性方面僅觀察到少許增加來(lái)響應(yīng)。然而，KLF-15的抑制明顯增加了MEF2活性(圖9D),這表明KLF-15作為MEF2的抑制物。接下來(lái)試圖探索是什么機(jī)制抑制了心臟肌細(xì)胞中的KLF-15。因此，對(duì)心臟肥大的已知介體進(jìn)行篩選，篩選有能力抑制KLF-15在心臟肌細(xì)胞中的表達(dá)的介體。在培養(yǎng)的心臟肌細(xì)胞中，TGFp非常強(qiáng)烈地抑制KLF-15,使得在添加了TGF卩之后KLF-15的表達(dá)幾乎完全被消除。由抑制RNA導(dǎo)致的TGF(3I型受體被抑制防止了KLF-15被TGF卩抑制(圖10A),這表明典型的TGF卩給出信號(hào)，包括它的I型受體對(duì)于這種效果是必要的。為了弄清楚TGF(H型受體在體內(nèi)對(duì)KLF-15的調(diào)節(jié)作用，產(chǎn)生了攜帶有鼠給服三苯氧胺來(lái)使心臟肌細(xì)胞中特有的cre活化(Larsson等，Sohal等，2001)。這使得剔除了成年小鼠的心臟肌細(xì)胞中特有的TGF(3I型受體，避免TGF(3I型受體的胚胎缺失對(duì)發(fā)育產(chǎn)生影響。在這些小鼠中，如上所述，由于慢性血管緊張素II注射而引起高血壓，從而引起肥大和KLF-15下調(diào)。全心臟勻漿的免疫蛋白印跡揭露了TGF[3I型受體明顯下調(diào)(圖IOB)。免疫組織化學(xué)確定了TGF(3I型受體的肌細(xì)胞明顯下調(diào)，這種受體在其它細(xì)胞型中的表達(dá)說(shuō)明了在全心臟勻漿中發(fā)現(xiàn)的TGFpI型受體的殘余信號(hào)(圖IOC)。血管緊張素II引起野生型小鼠的LVH，但是MerCreMer-TGF(3I型小鼠中LVH的發(fā)生被防止(圖IOD)。盡管在WT小鼠中，血管緊張素II減少了縮短率，但是在MerCreMer-TGF卩I型小鼠中，仍然保持縮短率(圖IOE)。這表明心臟肌細(xì)胞中的TGF(H型受體缺失可以防止高血壓導(dǎo)致的肥大和功能缺失。如所預(yù)計(jì)的，KLF-15的表達(dá)在WT小鼠的肥大心臟中受到抑制，但是這種抑制沒(méi)有出現(xiàn)在MerCreMer-TGF卩I型小鼠的心臟中(圖IOF)。這表明心臟肌細(xì)胞上的TGFPI型受體對(duì)于高血壓型肥大的發(fā)展是重要的，同時(shí)對(duì)于抑制KLF-15也是重要的?？傊?，KLF-15是第一位的Kriippel樣因子，在心臟肌細(xì)胞中起到心臟肥大抑制劑的作用。KLF-15抑制MEF2,并行的工作顯示KLF-15也抑制其它前肥大轉(zhuǎn)錄因子，例如GAT4。結(jié)果，可以想到的是，KLF-15的缺失非常強(qiáng)烈地引起肥大基因表達(dá)，并且與不利的結(jié)果相關(guān)。因此，KLF-15的抑制可以是衰竭傾向形式的肥大的發(fā)展過(guò)程中的新穎的和關(guān)鍵的一步。已經(jīng)證明，TGFP能夠非常強(qiáng)烈地抑制KLF-15。因此，當(dāng)前在不同領(lǐng)域正在開(kāi)發(fā)TGF卩的抑制劑，TGF(3的抑制劑可具有預(yù)料不到的治療潛力，由此來(lái)防止心臟肥大發(fā)展為心力衰竭。結(jié)論心臟對(duì)負(fù)荷和損傷響應(yīng)而變得肥大，這經(jīng)常向明顯的心力衰竭發(fā)展。根據(jù)本發(fā)明，揭露了該過(guò)程的新機(jī)制，其中，細(xì)胞因子TGFp對(duì)肥大的新型抑制劑(Kriippel樣因子15(KLF-15))進(jìn)行抑制。體內(nèi)和體外的TGF(3I型受體的缺失防止KLF-15被抑制并且防止心臟肥大和衰竭的發(fā)展。TGF(3能夠阻礙抑制心臟肥大的這種新機(jī)制，該發(fā)現(xiàn)令人興奮地揭示了抑制TGF[3發(fā)出信號(hào)從而防止心臟肥大的不利形式的可能性。示例3Kriippd樣因子15,心臟肥大的轉(zhuǎn)錄抑制劑根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)示出了鋅指轉(zhuǎn)錄因子Kriippel樣因子15(KLF-15)是有效的LV肥大轉(zhuǎn)錄抑制劑。基因打靶研究示出了KLF-15缺失小鼠正常發(fā)育，但是在響應(yīng)壓力超負(fù)荷的情況下，發(fā)展為擴(kuò)張形式的心臟肥大，其特點(diǎn)在于心臟重量增加、肥大基因表達(dá)增加、肌細(xì)胞尺寸增加的左心室室腔擴(kuò)張以及左心室收縮功能下降。總之，這些研究證實(shí)了KLF-15在體內(nèi)的LV肥大中的作用。有趣的是，KLF-15在幾種形式的病理性肥大中:^皮下調(diào)，但是在生理性肥大中沒(méi)有被下調(diào)，這表示KLF-15是病理性肥大的調(diào)節(jié)劑，而不是生理性肥大的調(diào)節(jié)劑。KLF-15阻礙肥大這一事實(shí)以及另外的發(fā)現(xiàn)(KLF-15在病理性肥大和心力衰竭中明顯下調(diào))帶來(lái)令人興奮的可能性，即，以防止KLF-15水平下降為目標(biāo)的干預(yù)能夠防止病理性生長(zhǎng)，甚至使病理性生長(zhǎng)逆轉(zhuǎn)。體內(nèi)試驗(yàn)為了證明在病理性肥大過(guò)程中防止KLF-15缺失可以限制心臟的病理性生長(zhǎng)的令人感興趣的可能性，在心肌肌鉤蛋白I啟動(dòng)子的控制下，利用重組腺相關(guān)病毒(rAAV)介導(dǎo)的基因送遞使小鼠心臟中的KLF-15明顯地過(guò)表達(dá)(Vandedriessche等，2007)。具體地講，rAAV9載體已經(jīng)示出了在靜脈給藥之后的幾周內(nèi)，在心臟組織中完成了轉(zhuǎn)基因表達(dá)的快速增加。小鼠被靜脈注射lxl(V。vg的AAV9-KLF-15或者AAV9-GFP,此后通過(guò)血管緊張素n(AngII)處理(通過(guò)滲透性微泵處理4周)來(lái)引起肥大。如圖11中所示(上圖)，KLF-15在心臟中被過(guò)表達(dá)。需要注意的是，與接收AAV9-GFP的AngII處理的小鼠相比，被分配給AAV9-KLF-15基因轉(zhuǎn)移的小鼠在AngII刺激的情況下發(fā)生明顯較小的肥大(見(jiàn)圖11,下圖)?？傊@些數(shù)據(jù)示出了KLF-15在心臟肌細(xì)胞中的強(qiáng)制性表達(dá)能夠使心臟肥大下降。結(jié)論KLF-15缺失是肥大的發(fā)展和向心力衰竭轉(zhuǎn)變的過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。KLF-15的心臟過(guò)表達(dá)抑制病理性肥大的發(fā)展，這一發(fā)現(xiàn)令人興奮地揭示了防止體內(nèi)KLF-15下調(diào)，從而防止肥大和后來(lái)的心力衰竭的策略的可能性。表1:SYBRGreenPCR和shLIMP-2產(chǎn)物的引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>3探針設(shè)計(jì)ID,Affymetrix探針設(shè)計(jì)數(shù)bp值，PO.05祐:認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著M咅數(shù)變化，與代償?shù)腞en-2大鼠相比，有衰竭傾向的Ren-2大鼠的基因表達(dá)的倍數(shù)變化。例如，負(fù)號(hào)意味著有衰竭傾向的Ren-2大鼠有下調(diào)。d基因名稱，與探針設(shè)計(jì)ID有關(guān)的基因的名稱表3:在基礎(chǔ)狀態(tài)以及14天和28天的AngII處理之后，LIMP-2KO和WT小鼠的超聲波心動(dòng)描記術(shù)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>平均±SEM*與基礎(chǔ)狀態(tài)的KO或WT相比PO.005$與年齡匹配的WT相比P<0.05$$與年齡匹配的WT相比PO.001a從短軸測(cè)量IVSd,心臟舒張情況下的室間隔；LVIDd，心臟舒張情況下的左心室內(nèi)徑；LVPWd，心臟舒張情況下的左心室后壁厚度；FS(%)，縮短率；b從長(zhǎng)軸測(cè)量LVAd,心臟舒張情況下的左心室面積；LVLd，心臟舒張情況下的左心室長(zhǎng)度參考文獻(xiàn)Gamp等，Hum.Mol.Genet.12:631-646,2003.VanHaaften等,BMCBioinformatics7:onine,2006-09-21.Schroen等，Circ.Res.110:3121-3128,2004.Heymans等，Circulation112:1136-1144，2005.J皿queira等，Histochem.J.11:447-455,1979.DeWmdt等，J.Mol.Cell.Cardiol.29:2095-2106,1997.Crombie等，J.Biol.Chem.273:4855-4863,1998.Eskelinen等，TrendsCell.Biol.13:137-145,2003.Nishmo等，Nature406:906-910，2000.Stypmann等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA99:6234-6239,2002.Stilli等，Exp.Physiol.2006.Perriard等，TrendsCardiovasc.Med.13:30-38,2003.G腦biner,J.Cell.Biol.148:399-404,2000.Ferreira-Comwell等，J.Cell.Sci.,115:1623-1634,2002.Sohal等，Circ.Res.89:20-25，2001.Larssoii等,EmboJ.20:1663-1673Vandendriessche等，J.Thromb.Haemost.5(1):16-24,2007.40DNA序列KLF15智人來(lái)源NCBI_智人Kruppel樣因子15,mRNA(cDNA克隆MGC:45113IMAGE:5526657):完整cds.添加BC036733<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>氨基酸序列KLF15智人來(lái)源NCBI智人種Kruppel樣因子15,mRNA(cDNA克隆MGC:45113IMAGE:5526657)完整cds.添加BC036733MVDHLLPVDENFSSPKCPVGYLGDRLVGRRAYHMLPSPVSEDDSDASSPCSCSSPDSQALCSCYGGGLGTESQDSILDFLLSQATLGSGGGSGSSIGASSGPVAWGPWRRAAAPVKGEHFCLPEFPLGDPDDVPRPFQPTLEEIEEFLEE顧EPGVKEVPEGNSKDLDACSQLSAGPHKSHLHPGSSGRERCSPPPGGASAGGAQGPGGGPTPDGPIPVLLQIQPVPVKQESGTGPASPGQAPENVKVAQLLVNIQGQTFALVPQVVPSSNLNLPSKFVRIAPVPIAAKPVGSGPLGPGPAGLLMGQKFPKNPAAELIKMHKCTFPGCSKMYTKSSHLKAHLRRHTGEKPFACTWPGCGWRFSRSDELSRHRRSHSGVKPYQCPVCEKKFARSDHLSKHIKVHRFPRSSRSVRSVN:LT^P-2l'叛因應(yīng)列以"B，，格式表示其它外顯子的位置以""表示已選擇外顯子的位置〉染色體:NCBB6:4:77298918:77354059:-1GTCTTCCAGAAGGCTGTAGACCAGAGTATCGAGAAG;TGAGGCGGGGCGGGCTGTGTGTG<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage47</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>GGGGATGCTGCTGTCTTAATATACCTCTGCTCCGC:JJACTGTCATAGAGTGGTGCCAGGTGCACTTCCTCAGGGAGATCATCGAGGCC^TGTTGAAAG(;CTATCAGCAGAAGCTCTTTGTGACTCACACAGTTGACGAATTGCTCTGGGiGCTACAAAGATGAAATCTTGTCCCTTATCCATGTTTTCAGGCPCGATATCTCTCCCTATTTTGGCCTATTCTATGAG<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>TGTTTAGTCATCAAGAATACTATTTTCrTGCCTCTCC'AGAGTGTTC^CATTGATAAAGAGACGGCG入GTCgACTCi!iAGTCTATG^rTAKciw;T—TTTGATCATCACCAACATACCCTACATCATCATGGC^GCTGGG+GTGTTCTTTGGTTTGGTTiTTACCTGGCTTGCATGCAAAGGACAGGGAfCCATGGATGAG;AACTGGCTGAAGGAACTTCTTCCTTACTGGATAACTTagaagtttctgacatgaacatct.二—二-cttgttttctctcttctgtgtttc-:-(ggaacagcggatgaaagac;cacccctcattcgaacctaaacattgcctttgcttggtgaagaAactgtgtgagctgtcctgacctggacgatgacgtggggaaaccctccacctccttgcagc^cttgttgcctgttgaaagaaggaaaaagacacggcgctdgcaagtgataggaacatt(^tggccaga^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ggttaaagagcaggctgacatggctggccattaagctt'tataaaatcatgtgggctctgaaattg.ttcttttatgtgtctagcaagtatttaataaacccttgtatagtaattttgttgttgttgggtjsctg^t^gctccagaattt;tgtgacd:kctattgtgggtaafl^tgtc:tctgcatcacttgttaatg—aci"ggtctaac^tcattca6tatgcttcattcaccgaactttgtgctcaaaatgcgtatAtaccat.tttatgttgtattcctccatttcacttgcaaaacagaagtaaataagagttcgggacccagggtaaaatggtagcttcatccaatatatcattcaaatgcatctga^ttctaaaacatattacattttatgcltgatcttcagttcataaitcttccaggaaaactcagtcttccaactgcaataaaatactgggtagaatcaaatgggaaaggggttgggtgggg,c[aatacccatgagttgatagtgata^gctcctaaggatttttaacttgtacttttgtgaacq;^agagaatgcataaataatgttggtgaggataaagtacagatatttcatgta^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^GAATTA7V5TGCTApT;TAGATGgTTGTGGATC;AGa^A^CTGTTTTTTTTTTAGTCAAAATGi-,ww'"^-,,,jf"1,:、s■■"'J*-.^3^(^i'，戰(zhàn)化"曙，"、v二，■,,itATCATGC.TACGAft^GATGCTTCTGAGAG^ATGTAATGAGTAACTGATTTTTCTTCCTGAGTCGCfcCTTGCCAAATATGTTACT(3TATTAAT;rAATCT^ATATTGAGTGATTATTTGTAAAATTATGA^ATGGGAAATCCA^CTATCafAqAGCCTAAG^TACACATAAGTT^TCAGAAAGTCTGATTA)3ACTAft!AGAG々TATT;rCTTC—G;AGAGC.C一qCTTCTTGGTAATTTTGAAGTtctttttacaagttccttcctcagtttcagttctttccagtgttttgtagctcactgtcaCTCACTGAATAGAGAAACGTGTGCCCTATACTTdCJTGTGAcAATbAT't—gctgacagaai，^V'-.-f;'.."-;^k^vC二'、二貨'》；^*-',...二'."0JI:',':TGATGGATQTTTAAAATA亡TGC'At:A!^G踏改效XSKiS^^i的C.敏妙站沐扭^SAAQG"t餘甚嫂輛紐4敏^^G纟S^纟絲^^^^p^"疆紐i^翻Gil^銀^l女T^rTCTCAAAi^lj嫂J^g^種CAfaT靜AATTGAgfi^薛'q;站^^TT^AddTd甚CAA^i3—<image>imageseeoriginaldocumentpage65</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>權(quán)利要求1、對(duì)存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包括以下步驟(a)確定一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記在所述受試對(duì)象的生物樣品中的水平；(b)將所述生物標(biāo)記的水平與同一生物標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較；(c)確定標(biāo)記的水平是否表示存在發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，其中，所述生物標(biāo)記是Krüppel樣因子15和/或溶酶體整合膜蛋白-2和/或它們的片段和/或變異體，并且/或者，生物標(biāo)記是Krüppel樣因子15和/或溶酶體整合膜蛋白-2和/或它們的片段和/或變異體的編碼基因。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述方法在體外進(jìn)行。3、如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中，從由血液、血漿、血清、心臟組織組成的組中選擇所述生物樣品。4、如權(quán)利要求l、2或3所述的方法，其中，與標(biāo)準(zhǔn)水平相比，Kriippel樣因子15蛋白的水平下降和/或Kriippel樣因子15基因表達(dá)的水平下降表示存在發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。5、如權(quán)利要求l、2或3所述的方法，其中，與標(biāo)準(zhǔn)水平相比，溶酶體整合膜蛋白-2蛋白的水平增加和/或溶酶體整合膜蛋白-2基因表達(dá)的水平增加表示存在發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。6、用于執(zhí)行如權(quán)利要求1-5所述的方法的診斷盒。7、如權(quán)利要求6所述的診斷盒，所述診斷盒包括用于容納受試對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)生物樣品的裝置以及用于確定所述生物樣品中的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記的水平的裝置。8、Kriippe]樣因子15和/或溶酶體整合膜蛋白-2蛋白、和/或Kriippel樣因子15和/或溶酶體整合膜蛋白-2的編碼基因、和/或所述蛋白和/或基因的片段和/或變異體在篩選方法中的用途，所述篩選方法用于鑒別預(yù)防性和/或治療性的化合物，所述化合物用來(lái)預(yù)防和/或治療心力衰竭。9、Kriippel樣因子15和/或溶酶體整合膜蛋白-2蛋白、和/或Kriippel樣因子15和/或溶酶體整合膜蛋白-2的編碼基因、和/或所述基因和/或蛋白的片|￡和/或變異體在制備藥物中的用途，所述藥物為預(yù)防和/或治療心力衰竭的預(yù)防性的和/或治療性的藥物。10、Kriippel樣因子15和/或溶酶體整合膜蛋白-2蛋白、和/或Kriippel樣因子15和/或溶酶體整合膜蛋白-2的編碼基因、和/或所述基因和/或蛋白的片段和/或變異體的調(diào)節(jié)劑在制備藥物中的用途，所述藥物為預(yù)防和/或治療心力衰竭的預(yù)防性的和/或治療性的藥物。11、如權(quán)利要求IO所述的用途，其中，所述調(diào)節(jié)劑是TG印的抑制劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種對(duì)存在發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包括以下步驟(a)確定一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記在所述受試對(duì)象的生物樣品中的水平；(b)將所述生物標(biāo)記的水平與同一生物標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較；(c)確定標(biāo)記的水平是否表示存在發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，其中，所述生物標(biāo)記是Krüppel樣因子15(KLF-15)和/或溶酶體整合膜蛋白-2(LIMP-2)和/或它們的片段和/或變異體，并且/或者，生物標(biāo)記是KLF-15和/或LIMP-2和/或它們的片段和/或變異體的編碼基因。本發(fā)明還涉及KLF-15和/或LIMP-2蛋白、和/或KLF-15和/或LIMP-2的編碼基因、和/或所述基因和/或蛋白的片段和/或變異體在制備藥物中的用途，所述藥物為預(yù)防和/或治療心力衰竭的預(yù)防性的和/或治療性的藥物。文檔編號(hào)G01N33/68GK101542290SQ200780035642公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2007年9月25日優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日發(fā)明者伊佳爾·M·品托,埃絲特·E·克里梅斯,朱斯特·L·林德斯申請(qǐng)人:馬斯特里赫特大學(xué)