專(zhuān)利名稱(chēng)：流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞分析檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞蛋白的 表達(dá)。
技術(shù)背景目前，在實(shí)體腫瘤研究中，由腫瘤組織塊制備的單細(xì)胞通常全部視為腫瘤細(xì)胞進(jìn)行 測(cè)定和研究，當(dāng)需要做患者自身腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞比對(duì)時(shí)，常需要另外采集正常組織 細(xì)胞，這涉及患者意愿、多部門(mén)配合、樣品存儲(chǔ)運(yùn)輸?shù)认盗袉?wèn)題，往往不易完善；在比 較腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平時(shí)，則要在不同的試管中分別檢測(cè)、分別分析。事實(shí)上在腫瘤組織中除大量的腫瘤細(xì)胞外還含有血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等正常細(xì) 胞。如果能用合適的標(biāo)記抗體加以區(qū)分，就可以在一個(gè)試管中完成不同細(xì)胞的某種蛋白 表達(dá)水平測(cè)定，達(dá)到同步檢測(cè)、同步分析、互相比較的目的。流式細(xì)胞術(shù)是借助流式細(xì)胞儀通過(guò)抗原、抗體反應(yīng)和熒光標(biāo)記法完成對(duì)細(xì)胞各種特 性進(jìn)行定性定量的一種分析技術(shù)。其原理是將懸浮在液流中的單細(xì)胞逐個(gè)通過(guò)測(cè)量區(qū)， 用儀器檢測(cè)細(xì)胞的光學(xué)參數(shù)而達(dá)到快速、大量地測(cè)定細(xì)胞的一系列物理特性和生化特 性。 ' 發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤中細(xì)胞 蛋白表達(dá)的方法，可滿足同步測(cè)定多種細(xì)胞(兩種或以上的細(xì)胞)的蛋白表達(dá)水平的要求。技術(shù)方案為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的思路是將使用熒光標(biāo)記區(qū)分不同細(xì)胞的 方法與使用抗體標(biāo)記特異性識(shí)別蛋白的方法組合，達(dá)到同步檢測(cè)不同細(xì)胞上某一蛋白表 達(dá)的目的。流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞的蛋白表達(dá)方法的具體步驟如下1、 將新鮮的腫瘤組織制備成單細(xì)胞懸液。2、 調(diào)節(jié)單細(xì)胞懸液濃度為±106細(xì)胞/10(^1。3、 在一個(gè)試管中加入步驟2得到的單細(xì)胞懸液，分別按熒光標(biāo)記抗體的試劑說(shuō)明 的配比濃度加入能夠區(qū)分不同待測(cè)細(xì)胞的熒光標(biāo)記抗體5-20W，充分混勻，室溫避光反 應(yīng)15 45分鐘。通過(guò)加入適合的熒光標(biāo)記與細(xì)胞反應(yīng)顯色來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞的方法為本 領(lǐng)域公知的技術(shù)，例如使用具有不同熒光標(biāo)記的抗體CD3、 CD19和CD14同時(shí)區(qū)分T 細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞。 4、 在上述試管中，加入待測(cè)蛋白的熒光抗體，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 45分 鐘。該抗體的顏色標(biāo)記要與步驟3中標(biāo)記細(xì)胞的熒光顏色相區(qū)別。對(duì)于不同的蛋白種類(lèi)， 選擇合適的抗體和抗體的加入方式為本領(lǐng)域公知的技術(shù)，對(duì)于位于細(xì)胞膜表面的表達(dá)蛋 白，可以直接加抗體反應(yīng)；對(duì)于位于細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)蛋白，需要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、破膜， 然后加抗體反應(yīng)。例如檢測(cè)細(xì)胞膜上的多藥耐藥糖蛋白Pgp表達(dá)，直接加與細(xì)胞熒光不 同的熒光抗體進(jìn)行反應(yīng)；在檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)的凋亡蛋白Bcl-2、增殖細(xì)胞核抗原PCNA時(shí)， 需要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、破膜，然后加與細(xì)胞熒光不同的熒光抗體進(jìn)行反應(yīng)。5、 離心去除上清液，以清除未結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。6、 懸浮細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析多種細(xì)胞的蛋白表達(dá)。 其中步驟3中所述的待測(cè)細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞或血細(xì)胞中的兩種或兩種以上的細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞可以是鱗癌細(xì)胞、腺癌細(xì)胞、未分化 癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。血細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞或造血干 細(xì)胞。在腫瘤組織制備成單細(xì)胞懸液前，新鮮腫瘤組織塊可放入含30-60IU/ml抗凝劑的生 理鹽水中，以達(dá)保濕運(yùn)輸?shù)哪康?。有益效果本發(fā)明的流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法與現(xiàn)有技 術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):1、 可以了解腫瘤組織塊中不同細(xì)胞的含量。2、 以往視腫瘤組織塊細(xì)胞均為腫瘤細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定和研究，現(xiàn)在通過(guò)標(biāo)記抗體區(qū)分 細(xì)胞后，可以有效提高對(duì)目標(biāo)細(xì)胞測(cè)定的準(zhǔn)確度和精確度。3、 可以用腫瘤組織塊中已有的正常細(xì)胞作為內(nèi)參照，不僅解決了參照細(xì)胞不易獲 取的問(wèn)題，而且可以在同一張數(shù)據(jù)圖中進(jìn)行同步分析，擴(kuò)大了信息量。4、 降低測(cè)定成本，減少分次實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的系統(tǒng)誤差。


圖l為采用本發(fā)明方法檢測(cè)腺癌樣本(實(shí)施例1)的流式細(xì)胞分析圖。 圖2為采用本發(fā)明方法檢測(cè)鱗癌樣本(實(shí)施例2)的流式細(xì)胞分析圖。 圖3a為采用傳統(tǒng)方法即不進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)甲狀腺腫塊樣本(實(shí)施例3)的流 式細(xì)胞分析圖。圖3b至3e為采用本發(fā)明方法檢測(cè)甲狀腺腫塊樣本(實(shí)施例3)的流式細(xì)胞分 析圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:對(duì)腺癌進(jìn)行抑癌基因突變產(chǎn)物P53(mutant)表達(dá)水平的研究。腺癌標(biāo)本立即放入含50IU/ml抗凝劑的生理鹽水中送實(shí)驗(yàn)室制備單細(xì)胞懸液，調(diào)單 細(xì)胞懸液濃度為±106細(xì)胞/10(^1。單細(xì)胞懸液分為2份，每份100pl。 一份先用熒光標(biāo)記 CD45鼠抗人單抗(Immunotech公司)l(Hd體標(biāo)記血細(xì)胞，充分混勻后，室溫避光反應(yīng)30 分鐘；再用固定和破膜的試劑盒IntmPREpTM對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和破膜后，P53(mutant)鼠 抗人單抗(Ancell公司)20^il標(biāo)記細(xì)胞蛋白，充分混勻后，室溫避光反應(yīng)25分鐘；經(jīng)離心 去除上清液，懸浮細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀FACSCalibur檢測(cè)、分析。另一份做同型陰性對(duì) 照管。圖l顯示該標(biāo)本去除血細(xì)胞(CD45+)后的腺癌細(xì)胞的P53(mutant)表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞 率為16.88%。實(shí)施例2:觀察一例鱗癌細(xì)胞增殖水平，進(jìn)行增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的測(cè)定。鱗癌標(biāo)本立即放入含60IU/ml抗凝劑的生理鹽水中送實(shí)驗(yàn)室制備成單細(xì)胞懸液，調(diào) 單細(xì)胞懸液濃度為±106細(xì)胞/10(^1。單細(xì)胞懸液分為2份，每份100jxl。 一份先用熒光標(biāo) 記CD45鼠抗人單抗(Immunotech公司)10pl體標(biāo)記血細(xì)胞，充分混勻后，室溫避光反應(yīng) 45分鐘；再用固定和破膜的試劑盒IntraPREpTM對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和破膜后，用鼠抗人單 抗PCNA (Pharmingen公司)IOW標(biāo)記細(xì)胞蛋白，充分混勻后，室溫避光反應(yīng)45分鐘； 經(jīng)離心去除上清液，懸浮細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀FACSCalibur檢測(cè)、分析。另一份做同型 陰性對(duì)照管。圖2顯示該鱗癌中血細(xì)胞(CD45+)的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率為30.35%，腺癌 細(xì)胞的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率為40.75%。實(shí)施例3:對(duì)一例甲狀腺腫塊進(jìn)行多藥耐藥糖蛋白Pgp表達(dá)水平的測(cè)定。標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)濃度為±106細(xì)胞/10(^1。單細(xì)胞懸液分為2份， 每份10(^1。 一份先用帶有熒光標(biāo)記1和帶有熒光標(biāo)記2的鼠抗人單抗(Immunotech公 司)CD45、 CD14各10^1分別標(biāo)記血細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，充分混勻后，室溫避光反應(yīng)45 分鐘；再用帶有熒光標(biāo)記3的多藥耐藥糖蛋白Pgp單抗(Immunotech公司)標(biāo)記細(xì) 胞蛋白，充分混勻后，室溫避光反應(yīng)30分鐘，上流式細(xì)胞儀FC500檢測(cè)、分析。圖3a 顯示采用傳統(tǒng)方法即不進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記時(shí)測(cè)得的甲狀腺腫塊Pgp表達(dá)水平4.5%;圖3b顯 示采用本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法時(shí)測(cè)得甲狀腺腫塊 中腫瘤細(xì)胞占80.4%，血細(xì)胞占15.8%，巨噬細(xì)胞占1.4%。圖3c顯示采用本發(fā)明流式 細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法時(shí)測(cè)得甲狀腺腫塊中腫瘤細(xì)胞Pgp表達(dá) 水平2.6%。圖3d顯示采用本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法 時(shí)測(cè)得甲狀腺腫塊中血細(xì)胞Pgp表達(dá)水平3.6%。圖3e為采用本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)同步檢 測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法時(shí)測(cè)得甲狀腺腫塊中巨噬細(xì)胞Pgp表達(dá)水平65.5%。
權(quán)利要求
1、一種流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)將新鮮的腫瘤組織制備成單細(xì)胞懸液；(2)調(diào)節(jié)單細(xì)胞懸液濃度為±106細(xì)胞/100μl；(3)在一個(gè)試管中加入步驟(2)得到的單細(xì)胞懸液，分別按熒光標(biāo)記抗體的試劑說(shuō)明的配比濃度加入能夠區(qū)分不同待測(cè)細(xì)胞的熒光標(biāo)記抗體5-20μl，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15～45分鐘；(4)在上述試管中，加入待測(cè)蛋白的抗體，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15～45分鐘；(5)離心去除上清液，以清除未結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體；(6)懸浮細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析多種細(xì)胞的蛋白表達(dá)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法， 其特征在于步驟(3)中所述的待測(cè)細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、浸潤(rùn) 淋巴細(xì)胞或血細(xì)胞中的兩種或兩種以上的細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法， 其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞為鱗癌細(xì)胞、腺癌細(xì)胞、未分化癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞或腫瘤干 細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法， 其特征在于所述的血細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞或造血干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)腫瘤中多種細(xì)胞蛋白表達(dá)的方法，包括如下步驟將新鮮的腫瘤組織制備成單細(xì)胞懸液；調(diào)節(jié)單細(xì)胞懸液濃度為±10⁶細(xì)胞/100μl；在一個(gè)試管中加入上述步驟得到的單細(xì)胞懸液，分別按試劑說(shuō)明的配比濃度加入能夠區(qū)分不同細(xì)胞的熒光標(biāo)記抗體5-20μl，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15～45分鐘；在上述試管中，加入待測(cè)蛋白的抗體，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15～45分鐘；離心去除上清液，以清除未結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體；懸浮細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析。該方法可以提高對(duì)目標(biāo)細(xì)胞測(cè)定的準(zhǔn)確度和精確度，并且可以降低測(cè)定成本，減少分次實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的系統(tǒng)誤差。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101126758SQ20071013200
公開(kāi)日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2007年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日
發(fā)明者吳曉柳, 朱月清, 沈宗麗 申請(qǐng)人:江蘇省腫瘤醫(yī)院