專利名稱：：乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)生物素一親和素免疫放大技術結合化學發(fā)光免疫分析技術測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原體，乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒的重要血清學標志物。血清(或其他體液)中存在乙型肝炎病毒表面抗原表明受檢者感染乙型肝炎病毒。乙型肝炎病毒表面抗原實驗室檢測方法主要為免疫分析，常用檢測方法為放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA),目前使用最廣的為酶免疫分析(EIA)。近十年來標記免疫分析技術的研究和應用發(fā)展迅速，已廣泛應用于生物醫(yī)學基礎理論研究及臨床疾病診斷各領域。其中技術工藝成熟，具有先進性且實用性強，易于推廣的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、時間分辨熒光免疫分析和化學發(fā)光免疫分析等四種。這些超微量檢測技術的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發(fā)出的信號各不相同。根據大量的試驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，依次為化學發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析法存在諸多缺點，如操作復雜、測定結果不穩(wěn)定、試劑保存時間短、放射性污染、儀器昂貴等。生物素-親和素免疫放大技術可極大地提高檢測方法的靈敏度，且特異性強，穩(wěn)定性高，適用范圍廣，實驗成本低。生物素-親和素免疫放大技術有兩種基本類型，一類以游離親和素為中間物，分別連接包含生物素大分子的待測反應體系和標記生物素，后在此基礎上發(fā)展了親和素-生物素化酶復合物技術；另一類是直接用標記親和素連接生物素化大分子反應體系進行檢測，稱為標記親和素-生物素法。根據待測反應體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，又分為直接法和間接法。在間接法中，親和素-生物素系統(tǒng)可以與免疫分析檢測體系偶聯(lián)，放大終反應先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標準抗原和待測抗原)同時反應，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復合物，再加入親和素與復合物中的生物素結合，最終使反應信號放大，從而提高了免疫分析的靈敏度?；瘜W發(fā)光免疫分析法結合生物素一親和素免疫放大技術是一種較先進而有效的方法。化學發(fā)光檢測需要一定的發(fā)光增強劑，并配有各自的過氧化物酶系統(tǒng)。主要是生物素與親合素、過氧化物酶(或堿性磷酸酶)結合，再經過化學發(fā)光及增強作用，將光量放大后檢測。目前，生物素一親和素免疫放大技術結合化學發(fā)光免疫分析技術在乙型肝炎病毒表面抗原免疫分析產品的應用方面仍未使用。一方面，產業(yè)應用需要解決成品的高效性和穩(wěn)定性問題。另一方面，現(xiàn)有技術中的化學發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明的試劑盒采用微孔板化學發(fā)光免疫分析技術，既可應用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應用。'
發(fā)明內容本發(fā)明同時解決了上述問題，即將生物素一親和素免疫放大技術結合化學發(fā)光技術與乙型肝炎病毒表面抗原的免疫分析學有效地結合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定地^r測乙型肝炎病毒表面抗原的試劑盒，該試劑盒適于在產業(yè)上有效地推廣應用。本發(fā)明的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術結合化學發(fā)光免疫分析測定乙型肝炎病毒表面抗原的試劑盒。.本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據本發(fā)明的試劑盒包括1)乙型肝炎病毒表面抗原校準品；2)親和素化的固相載體；3)生物素化的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體；4)酶標記的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體；以及5)上述酶所作用的化學發(fā)光底物。根據本發(fā)明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒；所述標記酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；所述化學發(fā)光底物為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾，其中所述l,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。進一步，本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟1)以乙型肝炎病毒表面抗原純品配制乙型肝炎病毒表面抗原校準品；2)固相載體包^L親和素；3)使乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體生物素化；4)用酶標記乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體；5)分裝上述乙型肝炎病毒表面抗原校準品、生物素化的乙型肝炎病毒表面抗體的單克隆抗體、酶標記的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體和該酶所作用的化學發(fā)光底物；以及6)組裝為成品。根據本發(fā)明的方法，優(yōu)選，所述固相載體包被親和素的步驟2)包括以下步驟1)包被用0.050MpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液配制成所需濃度的親和素包被液，并將包被液負載于固相載體上；2)用生理鹽水洗滌上述固相栽體；以及3)封閉用含P/oBSA，pH值為7.0-7.5,濃度為0.010M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述洗滌后的固相載體。具體地，所述包#皮方法可以包括1)包被配制包被液，基于1000mL所述包被液包含1.59g的無水碳酸鈉和2.94g的碳酸氳鈉，所述包被液的pH值為9.6,然后將制備的包被液與適當濃度的親和素混合，并將所得混合液負載于固相載體上；2)用生理鹽水洗涂上述固相載體；以及3)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2P04■2H20、2.9gNaH2P04'12H20、10gBSA和lmL生物防腐劑，所迷封閉液的pH值為7.0~7.5，然后將所得封閉液負載于上述洗滌后的固相栽體上。在上述方法中，優(yōu)選，所述親和素的固相栽體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒；所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾，其中所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。具體的上述試劑盒可以包括乙型肝炎病毒表面抗原校準品、親和素化的微孔板、生物素化的的抗體、酶標記物與化學發(fā)光底物液、20倍濃縮洗滌液等。其中，所述乙型肝炎病毒表面抗原校準品為標準級，純度不低于90%,親和素化的微孔板為48或96孔的微孔板條，標記抗體的酶為偶聯(lián)過氧化物酶(HRP),化學發(fā)光底物液為魯米諾，濃縮洗滌液為PBST。本發(fā)明"乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，，可以非常專一地檢測出感染乙型肝炎病毒后人體中的乙型肝炎病毒表面抗原的含量，可以根據乙型肝炎病毒表面抗原含量的多少判斷治療效果及其病情的變化。它具有筒便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。該乙型肝炎病毒表面抗原測定試劑盒(化學發(fā)光法與免疫放大技術結合)的各項指標均達到同類進口試劑盒的分析法水平。并且，根據本發(fā)明的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據本發(fā)明的試劑盒，酶標記的抗體與載體上包被的抗體和被測樣品的乙型肝炎病毒表面抗原形成"雙抗體夾心"結構，因此本發(fā)明采用的"歡抗體夾心一步法"反應模式，既有效地利用了化學發(fā)光技術原理，又確保了檢測的靈敏度。另外，這種模式還便于操作和生產。本發(fā)明的試劑盒應用的是酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產生的光信號代替酶免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現(xiàn)今的酶免疫分析的靈敏度提高約10倍，可為乙型肝炎病毒表面抗原的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據。近年大量研究證實，生物素一親合素系統(tǒng)可以與包括酶在內的多種標記試劑結合。本發(fā)明的試劑盒應用生物素一親合素系統(tǒng)，與酶標記的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體高親合力的牢固結合，并產生多級放大效應，使生物素一親合素系統(tǒng)免疫標記和示蹤分析更加靈敏，能夠更高效地診斷乙型肝炎病毒表面4元原。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑一、酶標抗體制備和生物素偶聯(lián)抗體的制備1.乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體用戊二醛法與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，對PBS充分透析，加等體積甘油，-20。C以下保存?zhèn)溆谩?.生物素偶聯(lián)乙型肝炎病毒表面抗體多克隆抗體或單克隆抗體的制備(1)用常少見方法將生物素(BNHS)溶于N,N-二甲基曱酰胺(DMF)配成lmg/mL^(2)用0.1mol/LpH值為9.0的NaHCO3將純化的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體稀釋為1~2mg/mL;(3)按BNHS與抗體容積比為1:8或重量比1:7左右混合，室溫攪拌下反應2~4h;(4)裝入透析對0.05mol/LpH值為7.2的PBS，4'C透析過夜，結合物加等體積甘油，小量分裝，-2(TC以下保存?zhèn)溆?。二、乙型肝炎病毒表面抗原校準品的制備用乙型肝炎病毒表面抗原純品配制，分裝0、0.3、1.5、6、30、150ng/mL共6瓶。三、酶標抗體濃度選定采用方陣法選擇酶標抗體的工作濃度大于1:5000。四、親和素化的固相微孔板制備(1)包被'無水-碳酸鈉0.795g碳酸氫鈉1.47g雙蒸水500mL溶解混勻后，調整pH至9.6,加入適量的親和素混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔130nL,4。C放置24h。(2)洗滌用生理鹽水洗三次。(3)封閉NaH2P04.2H200.2gNa2HP0412H202.9gBSA10gProclin300lmL雙蒸水定容至1000mL將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7.0。每孔分別加入封閉液300pL,室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕千燥24小時。立即進行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢查無漏氣，如果有漏氣需重新封袋。貼簽后置28。C保存。五、酶標多抗或單抗稀釋液Tris12.120gBSA5gProclinlmL雙蒸水1000mL六、化學發(fā)光底物A液Tris53mM3.29g硼砂8.5mM3.26gBSA0.1%1.0gLuminollOmM1.772g苯并熒蒽0.05%(W/V)0.5gProclin3001mL雙蒸水定溶lOOOmLpH8.2~8.8七、化學發(fā)光底物B液Na2HP04'12H20102.8mM檸檬酸H202(30%)Proclin300174.7mM0.03%定溶雙蒸水pH值使用時A液與B液等比例混合。八、2(H咅洗滌、液Na2HP0412H20NaH2P042H20NaClTween-20Proclin30036.817g10.21gLOmL1mLlOOOmL為5.0—5.858g2g160glmLlmL簡OmL去離子水i周整pH至7.2~7.4八、半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成乙型肝炎病毒表面抗原測定試劑盒(化學發(fā)光法)。組裝成試劑盒后還需抽4金合格后才能出廠。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了篩選試驗和質量鑒定，包括標記抗體與生物素化抗體的活性、親和素化載體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。然后對親和素化載體的方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和封閉液進行試驗，選擇出最適合的包被緩沖液和封閉液，通過親和素不同包被濃度試驗找到最佳的濃度條件。對于生物素偶聯(lián)抗體和對于HRP的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比試驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，并對生物素偶聯(lián)抗體和酶標記物使用的稀釋液進行了長期的考察試驗，配制出了能夠使生物素偶聯(lián)抗體和酶標記物長期保持活性而穩(wěn)定的稀釋液。再次通過多次方陣交叉試驗確定了生物素化的抗體與酶標記物混合的適當比例為1:5—1:10。本發(fā)明的發(fā)明人還對試劑盒的反應模式和反應條件進行了試驗研究，最終確定了雙抗體夾心一步法反應模式，并就不同的反應時間對試驗結果的影響進行了試驗，確定最適合的反應時間。通過對化學發(fā)光底物液發(fā)光持續(xù)時間的測定及不同發(fā)光時間對測定值的影響試驗表明在加入化學發(fā)光底物液后5~30分鐘之間進行測量為最佳，其結果也較為準確。實施例2-3制備本發(fā)明的乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以堿性磷酸酶標記乙型肝炎病毒表面抗體、以AMPPD作為化學發(fā)光底物、以塑料珠作為栽體、包被液的pH值為4.5、封閉液的pH值為7.5外，其余均以與實施例1相同的方法制備乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例4制備本發(fā)明的乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以磁性顆粒作為載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例5本發(fā)明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的具體操作如下1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。2)取出包被板條，插入板架上。3)反應孔中分別加各濃度校準品每孔加0、0.3、1.5、6、30、150ng/ml各50pL,每次試驗設空白1孔，然后除空白孔外各孔加生物素化的抗體和酶標記物混合體積50pL,用tt量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育l小時。4)甩去反應液，每孔加滿稀釋后的洗滌液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。5)各孔加化學發(fā)光底物液A、B各50pL,用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20~25。C)避光反應5分鐘。6)必須于加化學發(fā)光底物液后的第5~30分鐘內測量，在化學發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強度(RLU),測量時間1秒/孔。7)以校準品濃度為橫坐標，RLU值為縱坐標繪出標準曲線，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的乙型肝炎病毒表面抗原的濃度。實施例6本發(fā)明的試劑盒的方法學鑒定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行鑒定,見下表1-3:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2國家參比品檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>說明"乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒"的準確性、特異性、精密性、靈敏度和穩(wěn)定性是完全合格的。表3校準品濃度值與回算值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>從所列出兩種試劑檢測結果數(shù)據分析，本發(fā)明試劑檢測結果陰性中有6份陽性，這6份陽性結果中有2份和羅氏試劑檢測結果不符，這一差異可能由于試劑采用的抗原/抗體材料不同，及抗原/抗體的結合位點不同而引起的，本發(fā)明試劑盒的靈敏度、特異性、準確性與同類進口試劑盒無明顯差異；便于推廣應用；安全可靠。權利要求1、一種乙型肝炎病毒表面抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)乙型肝炎病毒表面抗原校準品；2)親和素化的固相載體；3)生物素化的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體；4)酶標記的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體；以及5)上述酶所作用的化學發(fā)光底物。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述親和素化的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。5、如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。6、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物包括A液和B液，其中，基于1000mL所述化學發(fā)光底物A液，包括3.29gTris、3.26g硼砂、l.OgBSA、1.772g魯米諾、0.5g苯并熒蒽、lmLProclin300,其pH值為8.2~8.8;基于lOOmL所述化學發(fā)光底物B液，包括36.72gNa2HP04'12H20、10:21g檸檬酸、l.OmL30%的H202、1mLProclin300，其pH值為5.0~5.8。7、一種制備權利要求I所迷試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以乙型肝炎病毒表面抗原純品配制乙型肝炎病毒表面抗原校準品；2)固相載體包被親和素；3)使乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體生物素化；4)用酶標記乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體；5)分裝上述乙型肝炎病毒表面抗原校準品、生物素化的乙型肝炎病毒表面抗體的單克隆抗體、酶標記的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體和該酶所作用的化學發(fā)光底物；以及6)組裝為成品。8、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述固相載體包被親和素的步驟2)采用以下方法1)包被用0.050MpH值為9.6的碳綾鹽援沖液配制成所需濃度的親和素包被液，并將包被液負載于固相載體上；2)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及3)封閉用含1%BSA,pH值為7.0-7.5,濃度為0.010M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述洗滌后的固相載體。9、如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述親和素化的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。10、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。11、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。12、如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒表面抗原測定試劑盒及其制備方法。根據本發(fā)明的試劑盒包括1)乙肝表面抗原校準品；2)親和素包被載體；3)生物素化的乙型肝炎病毒表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體；4)表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體酶標記物；以及5)化學發(fā)光底物。進一步，根據本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以表面抗原純品配制校準品；2)以親和素包被載體；3)使表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體生物素化；4)以酶標記表面抗體的多克隆抗體或單克隆抗體；5)分裝上述校準品和化學發(fā)光底物；以及6)組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。文檔編號G01N33/569GK101363861SQ20071011998公開日2009年2月11日申請日期2007年8月6日優(yōu)先權日2007年8月6日發(fā)明者應希堂,楊俊鋒,胡國茂申請人:北京科美東雅生物技術有限公司