專利名稱：一種采用莖環(huán)結構檢測探針的電化學dna檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因雜交檢測領域，具體涉及一種采用莖環(huán)結構檢測探針 的電化學DNA檢測方法及其試劑盒。
背景技術：
基因(DNA)檢測和分析在很多方面都有巨大的潛在用途，例如人 類疾病診斷和食品中病原體檢測。分子信標(molecular beacon, MB)檢測是19%年Tyagi等根據熒光共 振能量轉移現象，以定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)為 基礎而設計的分子生物學檢測方法。分子信標是一段具有特殊結構的單鏈 DNA探針，其兩端分別含有一段特定長度的莖，兩端的莖可以互補配對， 而中間環(huán)結構與靶向DNA (脫氧核糖核苷酸)互補，當耙分子不存在或不 能完全互補時，分子信標呈莖環(huán)結構。當有靶分子存在時，分子信標的環(huán) 序列與靶分子特異性結合，形成更穩(wěn)定的雙鏈體。美國專利US20050221329A1公開了 Peter H.key等人的研究他們設 計了一段分子信標探針，在這種探針的一端修飾有熒光基團，另一端修飾 有淬滅基團，當沒有和中間環(huán)區(qū)域互補的耙向DNA存在時，分子信標探 針兩端的莖互補配對，自身形成環(huán)狀的結構，使熒光基團和淬滅基團之間 的距離足夠小，熒光基團的熒光被淬滅基團淬滅；當有耙向DNA存在時， 分子信標和靶向DNA雜交形成支鏈結構，熒光基團和淬滅基團之間的距 離拉大，熒光基團發(fā)出可以被檢測到的熒光。由于含有甲基化結構的靶向 DNA和正常的DNA在分子信標雜交之后Tm值不同，通過改變雜交溫度 條件，就可以找到一個解鏈溫度，使得正常DNA已經和分子信標分開，而甲基化的靶向DNA仍然和分子信標保持雜交狀態(tài)。歐洲專利EP1669464公開了 Inouye等人的研究他們采用一種特殊的 分子信標探針，在這種探針兩端都修飾有芘基，當分子信標探針和靶雜交 之后，形成支鏈結構，這時兩端的熒光基團互相遠離，發(fā)出的熒光是單體 的熒光；當分子信標沒有和靶向DNA雜交的時候，兩端環(huán)區(qū)域互補形成 環(huán)狀結構，兩端的芘基靠近形成激發(fā)態(tài)二聚體，這時熒光特性和單體明顯 不同，通過檢測熒光的變化就可以檢測靶向DNA的存在。作者還證明了 用這種方法可以靈敏檢測SNP (單堿基多態(tài)性)。對于DNA檢測，莖環(huán)結構的探針比直鏈探針在很多方面都有明顯的 優(yōu)勢，最明顯的優(yōu)勢就是無需對靶向DNA進行任何標記，而且莖環(huán)探針 可以用于靈敏的單堿基錯配檢測。因此莖環(huán)結構探針很早就被用于溶液相 的DNA檢測，例如實時定量PCR (聚合酶鏈式反應)、單核苷酸多態(tài) 性和突變的檢測、病原體鑒定、原位熒光雜交。也有科學家將莖環(huán)結構的探針固定在表面上應用于生物傳感器的研 發(fā)。但是表面固定化的莖環(huán)結構探針檢測時的信噪比一直比在溶液中要低。2003年PNAS報道了一個新的電化學DNA檢測方法(Chunhai Fan, Kevin W. Plaxco， and Alan J. Heeger， PNAS (100): 9134-9137, August 5， 2003 )，他們將一端修飾二茂鐵基團的莖環(huán)結構檢測探針固定在電極表面， 當沒有和探針環(huán)序列互補的靶向DNA時，探針自身形成兩端互補的環(huán)形 結構，因此另一端的二茂鐵基團被拉近工作電極表面并產生一個可以被感 知的氧化還原電流，當有靶向DNA存在時，探針和靶向DNA雜交，形成 直線狀的雙鏈結構，二茂鐵基團和工作電極表面分離，從而增大了二茂鐵 和電極表面的距離，阻礙了電子傳遞，氧化還原電流明顯減小，這種傳感 器成功的將DNA的檢測限降低到30pM，在靈敏度方面有了很大的提高， 但是這種傳感器是"signal-off"傳感器，這種傳感器和"signal-on"傳感 器相比，更容易受假陽性信號的影響。2005年Nucleic Acids Research報道了 Benjamin Bockisch等科學家的 研究成果(NudeicAcidsResearch,2005, Vol. 33，No. 11)，他們在莖環(huán)結 構探針的一端修飾特定基團，用于將探針固定在基底表面，而探針另一段 修飾有親和性的基團，用來捕獲信號標記分子，雜交之前探針形成莖環(huán)結 構，親和基團被拉近到基底表面，使得親和基團受到空間保護作用，不能 捕獲信號標記分子；當雜交之后探針形成支鏈構型的雙鏈結構，親和集團 離開基底表面，從而可以特異性的捕獲信號標記分子，可以提供可感知的 比色分析信號。該方法可以檢測到10pM目標DNA，并且有很好的區(qū)分單 堿基錯配的能力。這種方法是"signal on"體系，很好的避免了假陽性信 號的影響，但是這種方法是采用酶催化之后的比色法檢測，靈敏度受到一 定的限制。發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題就在于結合酶催化的高效、特異和電化學檢 測迅速、靈敏、操作簡便的特點，提供一種以固定在電極表面的莖環(huán)結構 DNA序列為檢測探針，對目標DNA (靶向DNA)序列進行檢測的方法， 從而克服現有DNA檢測技術的缺陷，實現無標記，高靈敏度，操作簡便， 檢測迅速，多樣品同時檢測的電化學DNA檢測。本發(fā)明要解決的另一個技術問題在于提供一種相應的采用莖環(huán)結構檢 測探針的電化學DNA檢測試劑盒，該試劑盒采用上述方法檢測DNA。表面固定莖環(huán)結構的檢測探針在生物傳感器領域得到很多的應用，但 是檢測限的提高卻是急需解決的問題。本發(fā)明人利用生物素和親和素之間 親和力強的優(yōu)點，將修飾有生物素的莖環(huán)結構檢測探針組裝到固定有親和 素的電化學芯片的工作電極表面，發(fā)現這種電極具有表面檢測探針密度高， 本底電流小的特點，可大大提高檢測信噪比。本發(fā)明人采用能催化氧化還 原反應的酶，催化其底物發(fā)生氧化還原反應，例如采用辣根過氧化物酶(HRP酶)催化TMB (鄰二甲基對二氨基聯(lián)苯)和雙氧水之間的氧化反 應，發(fā)現酶催化效率高，特異性好，有利于分析方法的提高。本發(fā)明人還 發(fā)現電化學檢測DNA的方法靈敏度高，成本低，操作簡便，具有開發(fā)便 攜式檢測儀器的潛力。因此，本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為 一種采用莖環(huán) 結構檢測探針的電化學DNA檢測方法，包括以下步驟1) 將含莖環(huán)結構的DNA檢測探針的一端結合于電化學裝置的工作電極表面；2) 將耙向DNA與上述的DNA檢測探針進行雜交反應；3) 加入能催化氧化還原反應的酶，使其連接于DNA檢測探針的游離4山頓；4) 加入步驟3)所述的酶催化反應的底物，進行電化學檢測分析。 優(yōu)選的，本發(fā)明步驟1)中所述的電化學裝置可以是多通道的電化學芯片，較佳的是裸金(bare gold)芯片，更優(yōu)選的可以為現有的16通道的 裸金芯片。通常，金電極上DNA檢測探針的組裝是使用巰基和金之間的金硫鍵， 如采用修飾有巰基的DNA檢測探針，與金電極結合。本發(fā)明為加強結合 力，提高特異性，較佳地，所述的DNA檢測探針的一端可以通過鏈霉親 和素與生物素的親和作用結合于該裸金芯片的工作電極表面。由于組裝有生物素分子的DNA檢測探針易購得，本發(fā)明可以相應地 在該裸金芯片，特別是工作電極表面上組裝鏈霉親和素分子。更佳的，本發(fā)明可以通過多步化學結合作用在所述的裸金芯片上組裝 鏈霉親和素分子，步驟包括a)在裸金芯片工作電極表面滴加巰基和羥基/羧基之間碳鏈長度相同的巰基au醇和巰基<:6. 酸的混合溶液，禾U用金和巰基之間的特異性結合，可以將巰基C6.u酸組裝在工作電極表面，巰基 C6.u醇共組裝可以調控巰基C6. 酸的組裝密度，更有利于后續(xù)組裝步驟；b ) 然后滴力卩 EDC[l-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，EDC.HCI]和 NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)的混合溶液，然后加入修飾有氨基的生物 素，禾IJ用氨基和羧基在EDC和NHS活化的條件下的特異性結合，可以將 修飾有氨基的生物素固定在電極表面，超純水沖洗，氮氣吹干；c)最后加入鏈霉親和素，利用生物素和親和素的特異性結合，可以將 親和素固定在電極表面上，而且一個親和素分子一共有4個可以結合生物 素的活性位點，剩余的活性位點可以用來結合檢測探針上的修飾的生物素。當然，如果檢測探針上修飾的生物素帶有氨基，也可以將其與步驟a) 中巰基修飾的電極直接結合，但是這種結合力不如親和素和生物素的結合 力；而且步驟a)的電極穩(wěn)定性不如步驟c)中組裝有親和素的電極。優(yōu)選的，步驟a)中所述的巰基Q，u醇和巰基C6-u酸的終摩爾濃度可 以是4:1 2:1。更優(yōu)選的，所述的巰基C6. 醇和巰基C6.n酸可分別是巰基十一醇(巰 基Cu醇)和巰基十一酸(巰基Cn酸)，兩者的終摩爾濃度是3.-l。優(yōu)選的，步驟b)中所述的EDC和NHS的終摩爾濃度比例可以是 6:1 2:1，更優(yōu)選的是4:1。如上所述的表面連接好鏈霉親和素的芯片且稱為鏈霉親和素芯片。如 果不馬上使用，可選擇地，本發(fā)明所述的鏈霉親和素芯片，可在氮氣(或 者其他惰性氣體)環(huán)境中保護，在低于4'C的干燥環(huán)境中可保存不超過一 個月。優(yōu)選的，步驟3)中所述的DNA檢測探針的游離端和能催化氧化還原 反應的酶可以分別修飾能特異性結合的基團，通過該基團之間的特異性結 合來連接。例如，DNA檢測探針的游離端可修飾有地高辛(Digoxigenin) 或熒光素分子，而酶可以連接抗地高辛或抗熒光素分子，通過地高辛分子 與抗地高辛分子或者熒光素與抗熒光素分子的結合連接酶和DNA檢測探針的游離端。根據本發(fā)明，步驟3)中所述的能催化氧化還原反應的酶可以包括辣 根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等氧化還原酶，但不限于此。本發(fā)明優(yōu)選的 是辣根過氧化物酶，而步驟4)中所述的催化反應的底物可以是TMB和雙 氧水，但不限于此；還可以是其他的底物，如ABTS[ (2，2-連氮-雙-(3-乙 基苯并噻唑-6-磺酸))]或變色酸2R (CT2R)等。高價態(tài)的TMB在電極表 面得到電子被還原，從而產生可感知的電流信號。進而可以對待測樣品中 的目標DNA序列進行檢測分析。優(yōu)選的，本發(fā)明可以使用含有0.1M 0.2M NaCl的低鹽濃度的緩沖溶 液配制抗地高辛分子標記的辣根過氧化物酶復合物溶液，并且加入 0.5%~5%(w/v， g/ml)低濃度的小分子蛋白，如酪蛋白、胎牛血清或羊血清 等封閉劑，以封閉抗地高辛標記的辣根過氧化物酶復合物在一些空白位點 上的非特異性吸附。優(yōu)選的，低鹽濃度的緩沖溶液可以是低鹽PBS緩沖溶 液(100mMPBS): 100mMNaCl， O.IMPB， pH7.0。優(yōu)選的，步驟1)中所述的檢測探針可以用0.5M 1.5MNaCl的高鹽濃 度的緩沖液配制，如0.1MPB， pH7.0 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS);并在 步驟2)中與靶向DNA雜交結合，雜交完成后在4'C 1(TC下靜置，使未 和靶向DNA雜交的DNA檢測探針形成莖環(huán)結構。高鹽濃度和低溫環(huán)境更 加有利于使沒有和靶向DNA雜交結合的檢測探針形成莖環(huán)結構。檢測探 針的游離端修飾著能特異性結合酶的親和基團，形成莖環(huán)結構后，親和基 團被拉近到基底表面，由于受到空間保護作用，不能與酶結合，從而可以 降低檢測本底值。更優(yōu)選的，所述的高鹽濃度的緩沖液可以是1 mol/LNaCl的上述磷酸 鹽緩沖液(PBS)。優(yōu)選的，在每一步反應結束后可以用洗液洗去反應體系中的游離物， 所用的洗液在步驟2)中待測DNA溶液(靶向DNA)與檢測探針雜交反應后至步驟3)加酶之前為0.1M 0.2MNaCl的低鹽濃度的洗液，在其余的 反應中為超純水，洗完后都用氮氣吹干。因為用水沖洗可能會破壞DNA 的雜交配對結合，更可能會破壞檢測探針的莖環(huán)結構。所以雜交之前都用 水清洗，而雜交后的步驟采用低鹽濃度的洗液清洗以防止破壞雜交。但加 酶之后可以用水清洗，因為這時候地高辛和抗地高辛的結合作用已經完成， 溶液中游離的酶會被水沖洗掉，所以檢測探針和靶DNA的雜交以及莖環(huán) 結構是否被破壞都不會影響檢測結果。更優(yōu)選的，所述的低鹽濃度的洗液可以為100mM NaCl， 0.1% (v/v) tween (吐溫)，0.01 MPB， pH7.0~7.4的PBS。本發(fā)明還提供了一種采用莖環(huán)結構檢測探針的電化學DNA檢測試劑 盒，該試劑盒包括1) 工作電極上組裝有鏈霉親和素分子的電化學芯片，2) 兩端分別標記有生物素和地高辛的莖環(huán)結構的DNA檢測探針，3) 高鹽濃度的磷酸鹽緩沖液以及低鹽濃度的洗液，4) 標記抗地高辛的辣根過氧化物酶，5) 辣根過氧化物酶催化反應的底物。優(yōu)選的，所述的電化學芯片可以是裸金芯片，該裸金芯片表面組裝上 鏈霉親和素分子的方法可如上所述。優(yōu)選的，該試劑盒中的辣根過氧化物 酶催化反應的底物可以是TMB和雙氧水；高鹽濃度的磷酸鹽緩沖液可以 是0.5M 1.5MNaCl、優(yōu)選lmol/LNaCl的0.1 MPB， pH7.0 7.4的磷酸鹽 緩沖液；低鹽濃度的洗液可以是加有0.1M 0.2M NaCl、優(yōu)選為100mM NaCl, 0.1°/。(v/v)tween， 0.01MPB, pH7.0 7.4的磷酸鹽緩沖液。綜上所述，本發(fā)明檢測方法，或采用試劑盒工作的較佳實施例的技術 原理如下-首先通過金巰鍵、羧氨鍵以及生物素和親和素的高特異性的結合作用， 在裸金芯片上固定一層活性的親和素。然后，再在親和素上固定生物素標記的檢測探針，并在高鹽、低溫的 條件下使檢測探針形成莖環(huán)結構，從而使檢測探針另一端標記的地高辛被 拉近到裸金芯片表面，處于空間構型的保護作用之下，失去反應的活性。加入檢測樣品(耙向DNA)之后，雜交條件下，只有靶向DNA才能和檢 測探針互補配對結合，形成直線型的雙鏈，標記在檢測探針游離端的地高 辛失去了空間保護作用，具有了和抗地高辛修飾的辣根過氧化物酶結合能 力。這時加入抗地高辛修飾的辣根過氧化物酶，檢測探針就可以特異性的 捕獲抗地高辛修飾的辣根過氧化物酶，而游離的酶則被洗去。最后，滴加TMB和雙氧水底物，辣根過氧化物酶可以催化TMB和雙 氧水的電化學反應，產生電流信號，可使用現有的電化學檢測或分析儀進 行電化學檢測或分析。為進一步理解上述原理，可參見圖l。本發(fā)明采用莖環(huán)結構檢測探針和多通道的電化學檢測方法，實現對靶 向DNA的定量檢測。相對于現有技術，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點1、靈敏 度高。本發(fā)明對DNA的檢測限是10fM，比現有技術中的檢測限是10pM， 大大提高了檢測的靈敏度，有望達到靶基因無需擴增即可得到檢測的目的； 2、多通道的電化學檢測方法，操作簡便、迅速，通量高，成本低；3、特 異性高，可用于單堿基錯配的檢測；4、是"signal on"體系，不易受假陽 性信號影響。


圖1是本發(fā)明方法的技術原理圖。圖2是待測DNA與對應的電化學電流信號大小圖。圖中的待測DNA 依次分別為人工合成的濃度為10pM、 lpM、 O.lpM、 10fM的靶向DNA2， lnM錯配DNA3和lnM非互補任意DNA4。圖3是人工合成的lnM耙向DNA2和lnM非互補任意DNA4對應的TMB氧化還原反應的循環(huán)伏安圖。圖4是用含有0.1MKC1的0.5mM K3Fe(CN)6溶液標定裸金芯片及修 飾好鏈霉親和素的裸金芯片的結果對比圖。圖5是本發(fā)明使用的16通道裸金芯片的結構示意圖。
具體實施方式
下面用實施例進一步說明本發(fā)明的工作流程和功效，但本發(fā)明并不受 其限制。實施例1 試劑盒包括試驗用16通道電化學裸金芯片，購自Genefluidics公司，型號-SC1000-16-B，共16組3電極系統(tǒng)，每一組都可以同時進行組裝和檢測， 其中中間的圓形電極是工作電極1，最外面環(huán)形電極是對電極2，最小的方 形電極是參比電極3，參照圖5;檢測探針DNA1:5'曙Digoxigenin-ggccgt TACTCCCTTCCTCCCCGC acggcc國biotin-3';低鹽PBS緩沖溶液(100mMPBS): 100mMNaCl， 0.1MPB， pH7.0;高鹽PBS緩沖溶液(1MPBS): 1MNaCl， 0.1MPB， pH7.0;0.1MMES (2-(N國morpholine)國ethanesulphonicacid， 2- (N-嗎啉)乙磺 酸)緩沖溶液0.1MMES，pH5.0;低鹽濃度的洗液100mM NaCl, 0.1%(v/v) tween， 0.01M PB， pH 7.0~7.4;鏈霉親和素(streptavidin)，購自Promega公司，參考產品說明書使用前 用lOOmM PBS配置成0.5mg/L溶液；EZ-biotin(Biotin-PEO-Amine)，即帶氨基的生物素，購自PIECE公司， 使用前用0.1M MES緩沖液配成5mg/mL溶液；抗地高辛修飾的辣根過氧化物酶(anti-digoxigenin-POD)，購自Roche 公司，參考產品說明書使用前用lOOmM PBS稀釋成500mU/mL anti-digoxigenin-POD，并添加0.5% (w/v)酪蛋白(casein)封閉非特異性位 點；TMB底物(TMB substrate Low activity)，購自NEOGEN公司，其中 含有TMB和雙氧水。待檢測的目的DNA為耙向DNA2:GTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATA。本發(fā)明的檢測步驟如下，其流程如圖1所示。第一步制備鏈霉親和素芯片。試驗前以無水乙醇為溶劑配制2mM的ll-巰基H"—酸和6mM的11-巰基十一醇溶液。組裝前分別取11-巰基十一酸和ll-巰基十一醇兩種溶液 各16(HU混合均勻，配成組裝液。在16通道電化學裸金芯片的每個工作電 極上滴加20|il組裝液，4。C過夜組裝。試驗前配制400mM的EDC和lOOmM 的NHS，各取40^1混勻后取4^1滴加在每個工作電極上，室溫放置IO分 鐘后用超純水沖洗然后用氮氣吹干。接著在每個工作電極滴加4^1 EZ-biotin溶液，室溫放置15分鐘后用超純水沖洗之后用氮氣吹干。然后 在每組電極上滴加25pl乙醇胺(1Methanolamine)，保證溶液覆蓋包括圓 形對電極以內的整組電極，室溫放置10分鐘，以封閉剩余的羧基位點，超 純水沖洗之后用氮氣吹干。最后在每個工作電極上滴加4nl鏈霉親和素 (0.5mg/L鏈霉親和素)，室溫放置30分鐘后超純水沖洗，然后用氮氣吹干。 這樣制好的鏈霉親和素芯片可以在氮氣干燥的條件下暫時保存。經過含有0.1MKC1的0.5mMK3Fe(CN)6溶液標定，發(fā)現結合了鏈霉 親和素的電極表面的本底值變小，和裸金電極表面的電化學特性明顯不同， 結果見圖4。第二步，用鏈霉親和素芯片進行耙向DNA檢測。在鏈霉親和素芯片的每個工作電極上滴加4M1 1MPBS配制的lpM檢 測探針DNA1， 4'C過夜反應，利用生物素和鏈霉親和素的特異性結合，將 檢測探針固定在芯片的工作電極上。超純水沖洗然后氮氣吹干。在工作電 極上滴加10pM到10fM靶向DNA2， 37'C雜交反應30分鐘。然后冷卻到 4"C反應10分鐘，使沒有和耙向DNA2雜交的檢測探針DNA1在高鹽濃度 及低溫的條件下恢復莖環(huán)結構，以減少本底。然后用低鹽濃度的洗液沖洗 后氮氣吹干。接著在每組電極上滴加25^1 PEG (polyethylene glycol,聚乙 二醇)溶液(0.05 w/vn/。PEG溶液，使用1MPBS配制)，反應10分鐘， 封閉雜交層表面非特異性位點，確保溶液覆蓋圓形對電極以內的整組三電 極區(qū)域。在每個工作電極表面滴加4pl 0.5U/mL anti-digoxigenin-POD，當 檢測探針DNA1和靶向DNA2雜交形成直鏈時，抗地高辛辣根過氧化物酶 就可以和檢測探針DNA1另一端修飾的地高辛結合，從而被捕獲。最后用 超純水沖洗、用氮氣吹干之后，在每組電極上滴加25nl的TMB底物(含 雙氧水)，使用PM3000電化學分析儀檢測。所檢測的靶向DNA2的濃度分別為10pM， lpM， O.lpM， 10fM。結 果見圖2。從圖2可以看出，靶向DNA2的濃度和得到的電化學信號有比 較好的對應關系，所以可以用這種方法對耙向DNA進行定量。實施例2試劑盒同實施例1。將待檢測的目的DNA換成含有一個錯配堿基的DNA3: GTACTTTCA GCGGGGAGGAAGGCAGAAGAGTTAATA。 將實施例1第二步中不同濃度的靶向DNA2換成lnM錯配DNA3重復實驗。結果見圖2。從圖2可以看出，錯配DNA即使?jié)舛群芨咭矌缀鯔z測不到電流信號。 實施例3試劑盒同實施例1。待檢測的目的DNA為任意非互補DNA4: GC AAATCCTAC AAAACGAAC ATC AT 。將實施例1第二步中不同濃度的耙向DNA2換成lnM任意非互補 DNA4重復實驗。結果見圖2。從圖2可以看出，任意非互補DNA即使?jié)?度很高也幾乎檢測不到電流信號。實施例4將實施例1第二步中不同濃度的靶向DNA2換成lnM耙向DNA2和 lnM任意非互補DNA4，最后使用循環(huán)伏安法檢測。結果因為含有目的 DNA的檢測過程中特異性的捕獲了 HRP酶，所以催化了 TMB與雙氧水 的反應，導致氧化峰減小，還原峰增大。而同樣的試驗過程，只將目的DNA 換成任意非互補DNA卻沒有發(fā)現還原電流變大的現象。結果見圖3。本發(fā)明上述實施例中所用的各種DNA序列都是人工合成的，均購自 上海生工生物工程有限公司。其它未特殊說明的條件按照常規(guī)條件或按照 藥品或以其制造廠商所建議的條件。
權利要求
1、一種采用莖環(huán)結構檢測探針的電化學DNA檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)將含莖環(huán)結構的DNA檢測探針的一端結合于電化學裝置的工作電極表面；2)將靶向DNA與上述的DNA檢測探針進行雜交反應；3)加入能催化氧化還原反應的酶，使其連接于DNA檢測探針的游離端；4)加入步驟3)所述的酶催化反應的底物，進行電化學檢測分析。
2、 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所述的電化學裝置 為裸金芯片。
3、 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的DNA檢測探針的一端 通過鏈霉親和素與生物素的親和作用結合于該裸金芯片的工作電極上。
4、 如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的DNA檢測探針上組裝 有生物素分子，相應地在裸金芯片的工作電極上組裝鏈霉親和素分子，該組 裝步驟包括a) 在裸金芯片工作電極表面滴加碳鏈長度相同的巰基CV 醇和巰基<:6~ 酸的混合溶液；b) 然后滴加EDC和NHS的混合溶液、以及修飾有氨基的生物素，將 生物素固定在電極表面；c) 最后加入鏈霉親和素。
5、 如權利要求4所述的方法，其特征在于步驟a)中所述的巰基C6~ 醇和巰基C6~ 酸的終摩爾濃度比是4:1 2:1 。
6、 如權利要求5所述的方法，其特征在于所述的巰基C6~ 醇和巰基C^ 酸分別是巰基十一醇和巰基十一酸，兩者的終濃度是3:1。
7、 如權利要求4所述的方法，其特征在于步驟b)中所述的EDC和NHS 的終摩爾濃度比例是6:1 2:1。
8、 如權利要求7所述的方法，其特征在于所述的EDC和NHS的終摩 爾濃度比例是4:1。
9、 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的能催化氧化 還原反應的酶是辣根過氧化物酶，其修飾有抗地高辛分子；所述的DNA檢 測探針的游離端修飾有地高辛分子，通過地高辛分子與抗地高辛分子的結合 連接辣根過氧化物酶和DNA檢測探針的游離端。
10、 如權利要求9所述的方法，其特征在于步驟4)中所述的催化反應 的底物是TMB和雙氧水。
11、 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所述的DNA檢 測探針用0.5M 1.5M NaCl的高鹽濃度的緩沖液配制，并在步驟2)雜交反 應完成后在4'C 1(TC下靜置，使DNA檢測探針形成莖環(huán)結構。
12、 如權利要求11所述的方法，其特征在于所述的高鹽濃度的緩沖溶 液是lmol/LNaCl， O.IMPB， pH7.0~7.4的磷酸鹽緩沖液。
13、 如權利要求1所述的方法，其特征在于在每一步反應結束后洗去反 應體系中的游離物，所用的洗液在步驟2)中耙向DNA與檢測探針雜交反 應后至步驟3)加酶之前為0.1M 0.2M NaCl的低鹽濃度的洗液，在其余的 反應中為超純水，洗完后都用氮氣吹干。
14、 如權利要求13所述的方法，其特征在于所述的低鹽濃度的洗液為 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) tween, 0.01M PB， pH7.0~7.4的磷酸鹽緩沖液。
15、 一種采用莖環(huán)結構檢測探針的電化學DNA檢測試劑盒，其特征在 于該試劑盒包括1) 組裝有鏈霉親和素分子的電化學芯片，2) 兩端分別標記有生物素和地高辛的莖環(huán)結構的DNA檢測探針，3) 高鹽濃度的磷酸鹽緩沖液以及低鹽濃度的洗液，4) 標記抗地高辛的辣根過氧化物酶，5) 辣根過氧化物酶催化反應的底物。
16、 如權利要求15所述的試劑盒，其特征在于所述的的電化學芯片是 裸金芯片，該裸金芯片工作電極表面先通過滴加巰基十一醇和巰基十一酸的 混合溶液、以及EDC和NHS的混合溶液修飾帶氨基的生物素，再通過鏈霉 親和素與生物素的親和作用組裝上鏈霉親和素分子。
17、 如權利要求15所述的試劑盒，其特征在于所述的高鹽濃度的磷酸 鹽緩沖液是lmol/LNaCl， 0.1MPB, pH 7.0 7.4的磷酸鹽緩沖液；所述的低 鹽濃度的洗液為100 mM NaCl， 0.1 v/v°/。 tween， 0.01M PB, pH7.0~7.4的磷酸 鹽緩沖液；所述的辣根過氧化物酶催化反應的底物為TMB和雙氧水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用莖環(huán)結構檢測探針的電化學DNA檢測方法，該方法依次包括以下步驟1)將含莖環(huán)結構的DNA檢測探針的一端結合于電化學裝置的工作電極表面；2)將靶向DNA與上述的DNA檢測探針進行雜交反應；3)加入能催化氧化還原反應的酶，使其連接于DNA檢測探針的游離端；4)加入步驟3)所述的酶催化反應的底物，進行電化學檢測分析。本發(fā)明還公開相應的試劑盒。本發(fā)明結合了酶催化的高靈敏和多通道電化學檢測迅速、操作簡便的特點，從而提供了一種無標記，高靈敏度，檢測迅速，多樣品同時檢測的電化學DNA檢測方法。
文檔編號G01N27/26GK101241097SQ200710046090
公開日2008年8月13日 申請日期2007年9月18日 優(yōu)先權日2007年9月18日
發(fā)明者剛 劉, 樊春海 申請人:中國科學院上海應用物理研究所